isolasi dan identifikasi oligosakarida madu lokal

BIDANG KEGIATAN :
PKM PENELITIAN
ISOLASI DAN IDENTIFIKASI OLIGOSAKARIDA MADU
LOKAL SERTA ANALISIS AKTIVITAS PREBIOTIKNYA
Latar Belakang
• Madu terbukti memiliki beragam khasiat yang telah
dimanfaatkan selama ribuan tahun
• Oligosakarida: kandungan alami madu, berpotensi
menjadi prebiotik
• Prebiotik: komponen pangan yang tidak tercerna dan
mampu memberikan keuntungan bagi kesehatan
melalui stimulasi pertumbuhan bakteri
menguntungkan
• Produksi madu hutan Indonesia mencapai 115 juta ton
per tahun
• Kandungan dan potensi madu dari lebah hutan lokal
Apis dorsata belum diketahui
Perumusan Masalah
Kandungan oligosakarida madu lokal dan potensinya
sebagai prebiotik belum diteliti sehingga perlu
dilakukan isolasi dan identifikasi oligosakarida madu
serta pengujian aktivitas prebiotiknya
Tujuan
PKMP ini bertujuan mengisolasi dan mengidentifikasi
oligosakarida yang terkandung dalam madu lokal
serta menganalisis aktivitas prebiotiknya
Luaran Yang Diharapkan
• Penyusunan artikel yang secara komperhensif
menyajikan metode isolasi dan identifikasi
oligosakarida madu lokal dan pengaruhnya
terhadap aktivitas prebiotik. Artikel ini akan
diajukan ke jurnal Hayati.
BAHAN & ALAT
• Bahan
Sampel madu dari Pulau Kalimantan Timur dan Pulau Sumbawa.
arang aktif 100 mesh
etanol 10%
kertas saring Whatman No.1
lempeng KLT Whatman K6F
asetonitril
etil asetat
1-propanol
metanol
N*(1-naftil) etilendiamina dihidroklorida
standar karbohidrat
reagen DNS
reagen fenol sulfat
getah pencernaan buatan
kultur L. acidophilus
kultur E. coli
MRSB, MRSA
TSA, TSB
M9 Minimal Medium
inulin komersil
filter 0.45 mikron
BAHAN & ALAT (lanjutan)
• Alat
Peralatan gelas, oven, neraca analitik, vakum,
hair dryer, chamber KLT, botol semprot,
magnetic stirrer, inkubator, sentrifugasi,
inkubator, penangas, spektrofotometer, KCKT
dengan kolom yang digunakan adalah Aminex
HPX-87H
(300mmx7.8mm) dengan guard
column yang mengandung cartridge H+ dan
disimpan pada suhu 65oC.
Isolasi Oligosakarida (Hernandez et al. 2009)
•0.5 g madu+3 g arang aktif+etanol
10%
•Diaduk 30’
•Disaring dengan kertas saring
Whatman No. 1 pada keadaan
vakum
•Arang aktif dibilas dengan 25 mL etOH 10%
Ekstraksi
monosakarida
Desorpsi oligosakarida
dari arang aktif
• + et-OH 50%
• Aduk 30’
• Saring pada kondisi vakum
• Rotarievaporator vakum
40oC
• Simpan pada kondisi kering
Pengeringan
Deteksi Oligosakarida (Vergara et al.
2010, Ato et al. 1960)
Spot pada KLT dan elusi dengan piridin:buatnol:air
(4:6:3)
Semprot hingga jenuh dengan N*(1-naftil)
etilendiamina dihidroklorida dalam metanol: as. Sulfat
(97:3)
Panaskan 120oC selama 8-10’
Pengujian Aktivitas Oligosakarida
Resistensi terhadap enzim pencernaan
• Asam lambung
• Enzim amilase
Aktivitas fermentasi
• Produksi asam lemak rantai pendek
Stimulasi pertumbuhan bakteri
• Perbandingan antara pertumbuhan bakteri probiotik
L.acidophilus dan bakteri enterik E.coli
IDENTIFIKASI OLIGOSAKARIDA
Hasil KLT dilarutkan dalam air
nanofiltrasi dan disaring dengan
filter 0.22 mikron
KCKT Dionex DX-300, kolom CarboPAC PA 100 dan CarboPAC PA 100
penukar ion, 20uL per injeksi
Maltoriosa dan maltotetraosa sbg
standar karbohidrat, eluen: Naasetat, air, NaOH
Resistensi terhadap getah pencernaan
• Inkubasi sampel dengan asam lambung buatan
• Inkubasi sampel dengan enzim amilase air liur
• Pengukuran total karbohidrat awal (0 jam) dengan metode fenol-sulfat
• Pengukuran gula pereduksi metode DNS pada jam ke-0, 0.5, 1, 2, 4, dan
jam
Stimulasi pertumbuhan bakteri
• Inokulasi masing-masing L.acidophilus
dan E.coli pada media yang ditambah
prebiotik
• Media dengan glukosa sebagai kontrol
• U kur OD jam ke-0 dan ke-24 pada 600
nm
 Pp24  Pp0   Ep24  Ep0 

• P rebiotic activ ity score = Pg
24  Pg 0   Eg 24  Eg 0 
Produksi SCFAs
Kultur probiotik usia 24 jam + asam nitrat dan
asam sulfat lalu disaring dengan filter 0.45
mikron dan disentrifugasi pada 5000g 10’
Kandungan SCFAs diukur dengan KCKT kolom
aminex HPX-87H
Madu lokal
Sampel madu lokal berasal dari Hutan
Kampung Bluan Kec. Muara Pahu,
Provinsi Kalimantan Timur dan Bukit
Gunung Tambora, Bima, Pulau
Sumbawa. Sampel madu diambil pada
bulan Februari 2010 dengan bantuan
penduduk setempat. Madu lokal
dihasilkan dari lebah hutan A pis
dorsata. Sumber nektar untuk madu
hutan asal Kalimantan Timur antara lain
bunga pohon rengas, bengkirai, dan
kemiri. Sumber nektar untuk madu asal
Pulau Sumbawa adalah bunga akasia,
samu, loa, luhu, duwet, mangga, jambu,
kemiri, dan pala. Madu lokal Kalimantan
berwarna jingga cerah, sementara itu
madu lokal Pulau Sumbawa memiliki
warna yang lebih gelap.
E kstraksi
oligosakarida
•
Terhitung Senin, 19 April 2010 telah
dilakukan ekstraksi oligosakarida dari
sampel sebanyak 25 gram untuk
masing-masing madu lokal.
Rendemen ekstrak yang diperoleh
dari proses rotavapor vakum untuk
madu lokal Kalimantan sebanyak
0.5148 gram, sementara untuk madu
lokal Sumbawa menghasilkan
rendemen dengan bobot 0.4488
gram. Rendemen madu lokal
Kalimantan berwarna cokelat
mengilap dengan tekstur seperti
permen, sementara rendemen madu
Sumbawa berwarna hitam dan
mengilap.
Deteksi
oligosakarida
Rendemen dilarutkan dengan konsentrasi 4% dan
volume akhir 0.5 mL lalu di spot pada plat KLT silika.
Standar yang digunakan adalah glukosa dan fruktosa
konsentrasi 1%. Hasil KLT madu Kalimantan
menunjukkan adanya 2 buah spot dengan Retention
factor (RF) masing-masing 0.641 dan 0.385. Spot
dengan RF 0.641 Diidentifikasi sebagai fruktosa sesuai
dengan RF dari fruktosa yakni 0.692. Madu Sumbawa
menghasilkan 2 spot masing-masing dengan Rf 0.666
dan 0.410. Spot pertama diidentifikasi sebagai
fruktosa. Sementara itu standar glukosa memiliki RF
0.769. Metode ekstraksi oligosakarida dengan arang
aktif dan etanol belum optimum. Hal ini dikarenakan
jumlah monosakarida saat KLT masih signifikan dan
jauh lebih besar dibandingkan spot kedua, masingmasing dengan Rf 0.410 untuk Sumbawa dan 0.385
untuk Kalimantan, yang diduga merupakan
oligosakarida. Selain itu terdapat ekor di antara spot
yang diduga merupakan disakarida dan oligosakarida
dalam jumlah yang sangat kecil.
Penggantian E luen
(Piridin:butanol:air, 4:6:3)
Resolusi
cukup baik,
hasil
identifikasi
akan
dipertajam
dengan
analisis
KCKT
0.659
0.659
Monosakarida
0.568
0.568
Monosakarida
0.5
0.5
Di- atau trisakarida
0.375
Di- atau trisakarida
0.295
0.306
Di- atau trisakarida
0.18
0.18
0.11
0.11
Oligosakarida
dengan DP lebih
tinggi
Permasalahan dan penyelesaian
• Teknis
Penyediaan senyawa standar oligosakarida
madu yang diperlukan cukup memakan waktu
(+ 1.5 bulan) dan harganya mahal yaitu sekitar
Rp 500000-3000000
Tahap identifikasi oligosakarida dilakukan di
akhir Standar alternatif yaitu maltotriosa (DP
3) dan maltotetraosa (DP 4)
• Keuangan
Saldo dana sebesar Rp 1711500
Kultur L actobacillus acidophilus
Kultur E scherichia coli
Pengukuran asam organik dengan KCKT
Identifikasi oligosakarida dengan KCKT
TOTAL
Rp 350000
Rp 350000
Rp1400000
Rp1750000
Rp3850000
PENGGUNAAN BIAYA
Tanggal
Pemasukan
Rp
Pengeluaran
Rp
Mar 2010
Sewa laboratorium
150000
17 Mar 2010
Reagen (Pak Arya)
1225000
19 Mar2010
Bahan kimia & alat
48000
22 Mar2010
26 Mar 2010
27 Mar2010
01 Apr2010
06 Apr 2010
13Apr2010
Bahan kimia
Rotarievaporator
Bayar lembur
Bahan kimia
Bahan kimia
Etanol
Akuades
Etanol
Rotarievaporator
Pipet
Lempeng KLT
Standar
oligosakarida
Dana DIKTI 6500000
15 Apr 2010
16 Apr 2010
20 Apr 2010
23 Apr 2010
TOTAL
SALDO
6500000
87500
100000
7500
107500
85000
60000
35000
60000
150000
10000
400000
2250000
4788500
1711500