116 PENGEMBANGAN METODE PCR DAN SOUTHERN
advertisement
ISSN: 2339-2592 Prosiding Seminar Nasional Perkembangan Terkini Sains Farmasi dan Klinik III 2013 PENGEMBANGAN METODE PCR DAN SOUTHERN HYBRIDIZATION UNTUK DETEKSI GEN BABI PADA CANGKANG KAPSUL 1 Marlina1, Mutalib, S. A2, Islami, S. N1, Sari, H. K1, Fitria, A1 Fakultas Farmasi, Universitas Andalas, Padang, Indonesia, 25162 2 Fakultas Sains dan Teknologi, Universiti Kebangsaan Malaysia, Bangi, Malaysia, 43600 ABSTRAK Pada penelitian ini telah diidentifikasi sebanyak lima jenis cangkang kapsul keras dan tiga jenis cangkang kapsul lunak. Isolasi DNA kapsul menggunakan kit Qiagen DNeasy Blood and Tissue dan diamplifikasi menggunakan mesin PCR. Hasil dari amplifikasi PCR ini kemudian dielektroforesis dan dilanjutkan DENGAN identifikasi dengan metode Southern hybridization yang menggunakan kit Olipro®. Penggunaan kit Olipro® pada metode Southern hybridization ini bertujuan untuk memperjelas hasil amplifikasi PCR karena sampel yang digunakan merupakan bahan yang terproses tinggi sehingga kemungkinan DNA yang berada didalamnya sudah rusak. Setelah dilakukan pengujian menggunakan elektroforesis dan kit Olipro didapatkan hasil yang negatif pada semua sampel terhadap gen babi. Kata kunci: Cangkang kapsul, kit Qiagen, PCR, Southern hybridization, kit Olipro. PENDAHULUAN Kapsul adalah salah satu produk farmasi yang terbuat dari gelatin sapi dan gelatin babi, merupakan bahan yang sangat penting dalam mengemas sediaan obat (Sahilah, 2012). Kapsul yang berasal dari gelatin babi memiliki harga yang jauh lebih murah dibanding gelatin yang berasal dari sapi. Hal ini yang menyebabkan banyak produsen yang memilih cangkang kapsul yang terbuat dari gelatin babi daripada cangkang yang terbuat dari gelatin sapi (Gadri & Priani, 2012). Gelatin adalah produk alami yang diperoleh dari hidrolisis parsial kolagen. Gelatin terbuat dari bahan yang kaya akan kolagen seperti kulit dan tulang babi atau sapi (Junianto, et al., 2006; Martianingsih & Atmajaya, 2010; Cai, et al., 2011). Saat ini penggunaan gelatin sudah semakin luas untuk produk makanan, farmasi dan kosmetik. Hal ini disebabkan gelatin memiliki sifat sebagai bahan pembentuk gel, pengental, pengemulsi, penstabil dan pengikat. Penggunaan gelatin ini sangat luas sehingga kesempatan untuk penggunaan kapsul gelatin yang tidak halal juga sangat luas (Wiyono, 2001; Sahilah, et al., 2012). Oleh karena itu, identifikasi kandungan DNA babi pada makanan atau produk farmasi sangat penting dilakukan. Identifikasi ini biasanya dilakukan dengan real time PCR (Cai, 2012), kemometrik dan profil asam amino, PCR-RFLP (Lin, et al., 2005), dan amplifikasi segmen cytochrome b menggunakan PCR (Sahilah, et al., 2012; Primasari, 2011). Pada penelitian ini digunakan metode amplifikasi cytochrome b menggunakan PCR. Cytochrome b (cyt b) adalah salah satu bagian dari sitokrom yang terlibat dalam transportasi elektron dalam mitokondria. Gen sitokrom b dikodekan oleh DNA mitokondria. Sitokrom b dapat digunakan untuk membedakan jenis hewan berdasarkan urutan dan panjang basa (Dewi, 2011; Hapsari & Misrianti, 2007). PCR dapat digunakan untuk mengamplifikasi segmen DNA dalam jumlah jutaan kali hanya dalam beberapa jam. Teknik ini memiliki beberapa keunggulan, 116 ISSN: 2339-2592 Prosiding Seminar Nasional Perkembangan Terkini Sains Farmasi dan Klinik III 2013 salah satunya adalah dapat mendeteksi sampel dalam keadaan mentah maupun sudah mengalami proses pengolahan seperti kapsul (Handoyo & Rudiretna, 2001; Primasari, 2011). Southern hybridization adalah proses perpasangan antara DNA sasaran dan DNA pelacak (Suharsono and Widyastuti, 2006). Metode ini digunakan untuk produk yang telah mengalami proses pengolahan yang menyebabkan DNA yang berada didalam produk tersebut menjadi rusak sehingga tidak jelas hasilnya jika dilihat dengan menggunakan elektroforesis gel (Sahilah, et al., 2012). Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui ada atau tidaknya cangkang kapsul yang mengandung gen babi menggunakan metode Polymerase Chain Reaction (PCR) dan Southern Hybridization. Cangkang kapsul yang diuji dalam penelitian ini terdiri dari lima cangkang kapsul keras dan tiga cangkang kapsul lunak. METODE PENELITIAN Alat dan Bahan Metodologi Bahan Isolasi DNA DNA kapsul diisolasi dengan kit Qiagen. Sebanyak 50 mg kapsul cangkang keras dan lunak dipotong dan dimasukkan ke dalam tabung eppendrof 1,5 ml. PCR (eppendorf®), oven hibridisasi (Olipro Biotechnology®), orbital shaker (Labnet®), tabung (eppendorf®) 1.5 ml, tip eppendorf®(10 µl, 100µl, 1000µl), vortex maestronano spektrofotometer (Felt®), ® (maestrogen ), sentrifus (eppendorf®), inkubator autoklaf (Hirayama®), ® ® (Memmert ), oven (panasonic ), gelas ukur, erlenmeyer, tabung PCR (eppendorf®), collection tube (DNeasy® Tissue Kit (QIAGEN®)), QIAamp Spin column (DNeasy® Tissue Kit (QIAGEN®)) tabung mikrosentrifus, alumunium voil, pipet mikro (eppendorf®) 0,1-10 µl ; 10-100 µl ; 100 1000 µl, timbangan digital, mesin elektroforesis (Elite 300®), gel documentation system (Alpha Imager®), freezer (Dairei®), kotak es, parafilm, chip (Olipro Biotechnology®), beaker glass, falcon tube, kapsul, kontrol positif (DNA babi), kontrol negatif (Nucleas Free Water), kit isolasi DNeasy® Tissue (QIAGEN, Hilden, Germany; buffer ATL, buffer AL, proteinase k, buffer AW1, buffer AW2, buffer AE), mastermix PCR Olipro® (primer, dNTP, MgCl2, IC, dan buffer), DNA Taq Polymerase, aquades, DNA ladder 100bp (Pure Extreme®), loading dye (Pure Extreme®), etanol 100 %, serbuk agarosa, etidium bromida, Tris Acetate EDTA (TAE), kit hibridisasi (Olipro®) dan DNA removal (Oligon®). Amplifikasi PCR Kualitas dan kuantitas kemurnian DNA diuji menggunakan spektrofotometer maestronano (Maestrogen®). DNA disimpan pada suhu 20°C sampai akan digunakan untuk amplifikasi PCR. Proses amplifikasi DNA menggunakan reagen PCR (PCR mastermix 19,6 µl, Taq DNA polymerase 0,5 µl , templat DNA 10µl, dan nucleas free water 19,9 µl). Volume total dari tiap sampel adalah 50 µl. Kontrol negatif 10 µl nucleas free water dan kontrol positif 10 µl DNA babi. Proses amplifikasi dilakukan 47 siklus, denaturasi pada suhu 95°C selama 30 detik, annealing pada suhu 55°C selama 30 detik, pemanjangan pada suhu 72°C selama 30 detik, dan elongasi pada suhu 72°C selama 5 menit. Hasil PCR di elektroforesis menggunakan gel agarosa 2,5 % dan buffer TAE 1x pada 100 Volt selama 39 menit setelah proses PCR. 1µl loading dye dan 2 µl ladder ditambahkan ke dalam sumur agarosa. 5 µl sampel, positif kontrol dan 117 ISSN: 2339-2592 Prosiding Seminar Nasional Perkembangan Terkini Sains Farmasi dan Klinik III 2013 negatif kontrol ditambahkan dengan 1 µl loading dye. Larutan ini ditambahkan ke dalam sumur agarosa dan diwarnai dengan 0.5 µg/ml etidium bromida selama 5-10 menit. Hasilnya dilihat menggunakan gel documentation system. Pemisahan DNA ditentukan dengan ikatan DNA standar seperti DNA ladder 100 bp. Ukuran DNA babi adalah 276 bp. Southern hybridization Produk PCR diamplifikasi pada suhu 95°C selama 10 PCR. Proses hibridisasi menggunakan OLIPRO® Porcine Gene Biochip (OLIPRO, MY). Reagen yang digunakan adalah kit olipro. Regaen ini terdiri dari reagen A, B, C, D, E, F dan G. Hasil denaturasi dimasukkan ke dalam chip dan dicampur dengan kit olipro. Hasil southern hybridization dilihat menggunakan scanner olipro biotechnology®. OLIPRO® Porcine Gene Biochip (OLIPRO, MY) mengandung target pelacak yang spesifik terhadap cytochrome b. Hasil yang positif mengindikasikan bahwa sampel mengandung gen babi yang ditunjukkan oleh adanya dua titik vertical di bagian tengah chip. Sebaliknya, untuk hasil negatif tidak ada dua titik di bagian tengah chip. Kalau terdapat titik pada bagian internal control mengindikasikan bahwa proses PCR dan hibridisasi berhasil. HASIL DAN DISKUSI Sebanyak 8 jenis cangkang kapsul keras dan lunak dianalisis menggunakan PCR. Semua sampel menunjukkan hasil yang negative terhadap gen babi. Ini ditunjukkan oleh Gambar 1 setelah proses elektroforesis selesai. 500bp 200bp 100bp Gambar 1. 276bp 195bp Elektroforesis gel hasil PCR. LD : Ladder 100 bp; NC : control negatif; S1-S8 : sampel yang menunjukkan hasil negatif dan internal kontrol yang ditunjukkan oleh pita pada 195 bp; PC : positif kontrol yang ditunjukkan oleh pita pada 276 bp. Sedangkan hasil southern hybridization menggunakan kit Olipro ditunjukkan oleh Gambar 2. 118 ISSN: 2339-2592 Prosiding Seminar Nasional Perkembangan Terkini Sains Farmasi dan Klinik III 2013 Sampel S1 Sampel S2 SampelS3 Sampel S4 Sampel S5 Sampel S6 Sampel S7 Sampel S8 Gambar 2. PC NC Sampel S1-S5 : kapsul cangkang keras; sampel S6-S8 : kapsul cangkang lunak; PC : positif kontrol; NC : negatif kontrol. Proses PCR dilakukan pada suhu 95°C untuk denaturasi, 55°C annealing, 72°C pemanjangan, 72°C pemanjangan akhir dan 4°C pendinginan (Sahilah, et al., 2012). Penentuan suhu tersebut sudah melalui tahap pengujian yang berulang-ulang tergantung jenis sampel yang digunakan sehingga tidak diperlukan proses optimasi PCR serta efektifitas dalam pengerjaan PCR lebih tinggi. Sedangkan pada penelitian lain yang menggunakan PCR (Zetmi, 2012) harus melakukan optimasi terlebih dahulu untuk melihat suhu dan waktu optimum alat sesuai dengan jenis sampel yang digunakan. Amplikon PCR dilihat menggunakan gel elektroforesis menggunakan gel agarose 2,5% yang dilarutkan dalam buffer TAE selama 39 menit dengan tegangan 100 volt. Untuk proses southern hybridization digunakan metode OLIPRO, Sdn. Bhd.. Metode ini menggunakan OLIPRO Porcine Gene Biochip (OLIPRO, MY) yang memiliki sasaran yang spesifik terhadap cytochrome b. Reagen yang digunakan berasal dari OLIPRO yang diberi nama reagen A, B, C, D, E, F, dan G. Pada awalnya dilakukan denaturasi pada hasil amplifikasi PCR dengan suhu 950C selama 10 menit. Ini dilakukan karena DNA yang diperlukan untuk proses southern hybridization dalam bentuk single stranded sedangkan hasil PCR merupakan bentuk double stranded. Sehingga bentuk DNA ini harus dibuat menjadi single stranded melalui proses denaturasi. Setelah DNA diurai menjadi single stranded maka larutan DNA ini dimasukkan ke dalam chip yang ditambah dengan reagen A, pada proses ini terjadi ikatan antara DNA dari produk PCR dengan probe DNA yang ada pada membran chip. Hal ini terjadi karena produk PCR memiliki senyawa biotin yang berfungsi sebagai pengikat antara produk PCR dengan probe DNA membran melalui deteksi senyawa yang komplemen dengan produk PCR dan memberikan sinyal. Sinyal ini akan ditangkap oleh suatu enzim yaitu strep AP 119 ISSN: 2339-2592 Prosiding Seminar Nasional Perkembangan Terkini Sains Farmasi dan Klinik III 2013 (streptavidin alkalin fosfat) yang menandakan bahwa ikatan DNA produk dengan DNA membran berhasil. Hal ini terjadi karena strep AP memiliki afinitas tinggi terhadap biotin dan berikatan secara non kovalen. Setelah penambahan NBT/BCIP, maka strep AP akan berikatan dengan NBT/BCIP yang akan menghasilkan warna biru pada membran (Novel, 2011). Warna ini yang akan tampak pada membran ketika dilihat menggunakan scanner. Setelah melakukan proses Southern hybridization ini, semua sampel menunjukkan hasil yang negatif terhadap gen cytochrome b babi yang ditandai dengan tidak adanya terbentuk dua buah dot dibagian bawah chip secara vertikal. KESIMPULAN Kesimpulan yaitu lima cangkang kapsul keras dan tiga cangkang kapsul lunak yang diperiksa tidak ditemukan gen cytochrome b spesifik gen babi menggunakan Polymerase Chain Reaction hybridization. (PCR) dan Southern UCAPAN TERIMA KASIH Penelitian ini didukung dengan bantuan dana dari UKM (Fundamental Grant Research Scheme), Malaysia. Ucapan terima kasih kepada UKM dan Olipro Biotechnology Sdn. Bhd. untuk semua fasilitas lab dalam penelitian ini. DAFTAR PUSTAKA Cai, H., Gu, X., Scanlan, M.S., Ramatlapeng, D. H & Lively, C. R. 2012. Real-time PCR assays for detection and quantitation of porcine and bovine DNA in gelatin mixtures and gelatin capsules. Journal of Food Composition and Analysis 2154: 1-5. Dewi, C. 2011. Aplikasi pengunaan gen sitokrom b dengan teknik polymerase chain reaction (PCR) sebagai pendeteksi campuran daging tikus pada produk bakso (skripsi). Bogor : Institut Pertanian Bogor. Gadri, A & Priani, S. E. 2012. Stabilitas Kadar dan Laju Disolusi Ketoprofen dalam Sediaan Kapsul Gelatin dan HPMC-Karagenan. Prosiding SnaPP: Sains, Teknologi dan Kesehatan. Handoyo, D & Rudiretna, A. 2001. Prinsip umum dan pelaksanaan polymerase chain reaction (PCR). Unitas, Vol. 9, No. 1, 17-29. Hapsari, A & Misrianti, R. 2007. Gen sitokrom b sebagai penanda molekuler untuk mendeteksi cemaran daging tikus pada bakso. Laporan Penelitian Biologi Molekuler. Bogor : Institut Pertanian Bogor. Junianto, Haetami. K., & Maulina. I. 2006. Produksi Gelatin dari Tulang Ikan dan Pemanfaatannya Sebagai Bahan Dasar Pembuatan Cangkang Kapsul. Laporan Penelitian hibah Bersaing IV tahun I. Bandung : Universitas Padjajaran. Lin, W. F., Shiau, C. Y & Hwang, D. F. 2005. Identification of Four Thunnus Tuna Spesies Using Mitochondrial Cytochrome b Gene Sequence and PCR-RFLP Analysis. Journal of Food and Drug Analysis, Vol. 13 No. 4, Pages 382-387. Martianingsih, N & Atmajaya, L. 2010. Analisis Sifat Kimia, Fisik dan Termal Gelatin Dari Ekstraksi Kulit Ikan Pari (Himantura gerrardi) Melalui Variasi Jenis Larutan Asam. Prosiding KIMIA FMIPA – ITS. 120 ISSN: 2339-2592 Prosiding Seminar Nasional Perkembangan Terkini Sains Farmasi dan Klinik III 2013 Novel, S. S., Safitri, R., Harijanto, S. H & Nuswantara, S. 2011. Perbandingan Beberapa Metode Molekuler dalam Uji DNA HPV (Human Papilloma Virus). CDK 186/ Vol. 38 no.5. Olipro, MY. 2009. Olipro™ Porcine Gene Chip, diakses 3 Maret 2013 dari http://www.oliprobiotech.com Primasari, A. 2011. Sensitivitas gen sitokrom B (cyt B) sebagai marka spesifik pada genus rattus dan mus untuk menjamin keamanan pangan produk asal daging (tesis). Bogor : Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Sahilah, A. M., Mohd. Fadly, L., Norrakiah, A. S. Aminah, A.,Wan Aida, W. M. Ma’aruf, A. G and Mohd. Khan, A. 2012. Halal market surveillance of soft and hard gel capsules in pharmaceutical products using PCR and southern-hybridization on the biochip analysis. International Food Research Journal 19(1): 371-375. Suharsono & Widyastuti, U. 2006. Pelatihan Singkat Teknik Dasar Pengklonan Gen. Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi – Lembaga Penelitian dan Pemberdayaan Masyarakat IPB dengan DIKTI – DIKNAS, Bogor. Wiyono, V.S. 2001. Gelatin halal gelatin haram. Jurnal Halal LPPOM-MUI, No 36. Zetmi. 2012. Deteksi Gen Sitokrom b Babi Pada Steak Daging Sapi Yang Kemungkinan Tercampur Daging Babi Menggunakan Metode Polymerase Chain Reaction (PCR) (skripsi). Padang: Universitas Andalas. 121
