4 Bab II Tinjauan Pustaka II.1 Stroke Stroke didefinisikan sebagai

Bab II Tinjauan Pustaka
II.1 Stroke
Stroke didefinisikan sebagai penyakit yang disebabkan oleh penggumpalan darah
di otak (cerebral stroke) yang dapat
mengakibatkan kelumpuhan (disability)
bahkan kematian (Sharma et al., 2005). Selain itu, ada yang mendefinisikan
bahwa stroke merupakan proses matinya sebagian sel otak akibat gangguan suplai
darah yang membawa oksigen dan nutrisi sehingga aliran darah menuju otak
terhambat akibatnya otak tidak dapat berfungsi secara normal.
Sistem metabolisme otak secara umum sangat dipengaruhi oleh kadar glukosa dan
oksigen, dimana glukosa berperan sebagai sumber energi. Sistem kerja otak dan
saraf, dipengaruhi oleh norepinephrine yang berperan sebagai produk intermediate
dari dopa dan dopamine. Dopamine dapat pula berperan sebagai inhibitor pada
reaksi penguraian norepinephrin. Produk akhir dari sistem metabolisme dopamine
ini akan diubah menjadi asam homovanilat dan diekskresikan ke dalam urine.
Selain itu, terdapat pula acetylcholine yang berperan dalam neurotransmitter,
terbentuk dari asetil KoA. Serotonin (5-hydroxytrytamine, %-HT) terbentuk dari
presinapsis serotoninergic neurons dari asam amino trytophan yang memiliki inti
hydroxytryptophan. Selain itu, terdapat gamma-aminobutyric acid (GABA) yang
terbentuk dari asam amino glutamat melalui proses dekarboksilasi, berperan
dalam sistem neurotransmitter sekitar 30 sampai 40 persen dari seluruh fungsi
otak. Selain itu terdapat sistem neurotransmitter lain, yaitu glycine dapat berperan
sebagai inhibitor neurotransmitter dan substansi P (Privitera and Kohler, 2001).
Penyakit stroke terjadi akibat hambatan pada pembuluh darah arteri (hambatan
arteri menuju otak dan pengerasan arteri yang menuju otak) serta kerusakan arteri
(hemorrhagia) yang dapat menimbulkan perdarahan otak. Pada dasarnya, terdapat
tiga tahap yang terjadi pada proses kerusakan otak akibat hambatan pada arteri,
yaitu
induksi
yang
menimbulkan
depolarisasi
membran
neuron
yang
menyebabkan pelepasan glutamat akibatnya neuron didekatnya tereksitasi secara
berlebihan dan influks ion Ca2+ dan Na+ secara abnormal, penumpukkan ion Ca2+
4
intrasel yang menyebabkan pelepasan glutamat tambahan, serta kadar Ca2+ yang
tinggi akan mengaktifkan enzim nuklease, prortease, dan fosfolipase bergantung
pada konsentrasi Ca2+. Dalam hal ini, glutamat berperan penting dalam regulasi
otak secara keseluruhan sehingga disebut glutamat cascade (Murray et al., 2000).
Kerusakan pada saraf pengontrol menuju otak, mengakibatkan kelemahan dan
juga kerusakan dari sistem syaraf menuju otak. Hal ini diduga pula dapat timbul
akibat adanya sel darah putih yang tercampur dalam cairan cerebrospinal
(Katzung, 2001).
Penyakit stroke dapat ditimbulkan oleh rokok, tekanan darah tinggi, kolesterol,
aktifitas fisik yang tidak seimbang, obesitas, dan diabetes mellitus (Sharma,
2005). Hambatan yang terjadi pada pembuluh darah arteri menuju otak terjadi
karena terbentuknya lapisan clots (trombosis) dalam pembuluh darah kapiler
menuju otak setelah kurun waktu yang cukup lama sehingga dapat berpengaruh
pada tekanan darah. Orang-orang yang rentan terserang penyakit stroke, yaitu
orang-orang yang memiliki tekanan darah tinggi dan orang-orang yang lanjut usia.
Stroke secara umum, terbagi menjadi dua bagian, yaitu ischaemic stroke
(penghambatan pembuluh darah otak) dan haemorrhagic stroke (perdarahan otak),
namun terdapat pula berbagai jenis stroke yang lain (Stöppler, 2008).
Istilah ischaemic digunakan utuk menjelaskan ketidakseimbangan aliran darah
menuju organ atau bagian tubuh lain akibatnya terjadi kekurangan oksigen dan
nutrisi sehingga sel akan mati. Pada kasus ischemia stroke terjadi akibat arteri
yang menyuplai darah ke otak terhambat akibat terdapat blood clots sehingga sel
otak akan mati. Penyakit ischaemic stroke merupakan penyakit stroke yang paling
umum diderita, jumlahnya hampir sekitar 80 sampai 85 persen dari penderita
stroke (Department for Work and Pensions, 2000).
Embolic stroke terjadi akibat blood clots yang ikut aliran darah menuju arteri
jantung akibatnya terjadi penyumbatan pembuluh darah di jantung. Semakin
banyak blood clots yang beredar dalam pembuluh darah sehingga sampai ke
dalam arteri otak dan menghambat aliran darah.
5
Trombolitik stroke terjadi akibat blood clots dalam arteri jaringan lemak, yang
disebut atheroma (pengerasan pembuluh arteri). Jika atheroma membesar
meyebabkan darah yang mengalir dalam pembuluh darah menempel pada dinding
arteri sehingga terbentuk blood clots.
Haemorrhagic stroke terjadi akibat neuron berkontak dengan darah sehingga
menimbulkan perdarahan di sekitar jarigan otak akibatnya suplai darah menuju
otak berkurang dan dapat mengurangi keseimbangan fungsi neuron. Pada
akhirnya dapat menimbulkan kematian. Pada umumnya, penyakit stroke jenis ini,
menyerang 15-20 persen penderita stroke.
Pengobatan stroke yang paling umum yaitu dengan terapi trombolitik untuk
menghancurkan blood clots yang masuk ke dalam pembuluh darah. Dalam hal ini,
penggunaan lumbrokinase sebagai obat dalam proses penyembuhan penyakit
stroke yaitu dengan melisiskan fibrin sehingga aliran darah menjadi lebih lancar.
Peningkatan fibrinolitik merupakan terapi efektif untuk penyakit trombotik untuk
memperkecil efek biokimia glutamat cascade (Murray et al., 2000). Aktifator
plasminogen atau t-PA, urokinase, dan streptokinase semua mengaktifkan sistem
fibrinolitik. Sebaliknya, penurunan fibrinolisis melindungi bekuan darah dari lisis
dan mengurangi perdarahan dari kegagalan hemostasis (Katzung, 2001).
II.2 Pembekuan Darah
Homeostasis merupakan penghentian spontan perdarahan dari pembuluh darah
yang rusak. Sel-sel endotel vaskular normal tidak bersifat trombogenik dan
platelet darah yang bersirkulasi dan faktor pembekuan darah secara normal tidak
menempel pada sel tersebut sampai keadaan tertentu. Platelet merupakan pusat
hemostasis normal.
Dalam proses pembekuan darah terjadi akibat transformasi fibrinogen yang larut
menjadi fibrin yang tidak larut (Gambar II.7). Dalam hal ini, fibrinopeptida akan
dibuang dari fibrinogen sehingga memudahkan fibrinogen untuk bergabung
dengan fibrinogen yang lain membentuk fiber (Mathews et al., 2000).
6
Gambar II.1 Mekanisme Pembentukkan Fiber dari Monomer Fibrin
(Mathews et al., 2000)
Pembekuan darah dan pembentukan trombus harus dibatasi pada area yang sekecil
mungkin untuk mendapatkan hemostasis lokal sebagai respon terhadap
perdarahan tanpa mengakibatkan meluasnya pembekuan atau gangguan aliran
darah. Pada dasarnya terdapat dua sistem utama yang mengatur mekanisme
fibrinolitik, yaitu penghambatan fibrin dan fibrinolisis. Proses utama dari
fibrinolisis, yaitu perubahan plasminogen non aktif menjadi enzim proteolitik
plasmin. Sel-sel yang terluka menyebabkan aktifator plasminogen aktif. Plasmin
membentuk kembali trombus dan membatasi pengembangan trombosis melalui
pencernaan proteolitik dari fibrin (Katzung, 2001).
II.3 Cacing Tanah L. rubellus
II.3.1 Anatomi dan taksonomi
Cacing tanah L. rubellus dikenal pula sebagai Red worm, Blood Worm, Red
Wiggler (Gambar II.1). Adapun ciri-ciri umum dari cacing tanah spesies L.
rubellus, yaitu panjang 60–150 cm dan diameter 4–6 mm, jumlah segmen 95
sampai 145, posisi klitelum pada segmen ke-26, menghasilkan 79–106 kokon
setiap tahun untuk satu ekor cacing, bersifat hermaprodit, dan memiliki bagian
dorsal berwarna merah kecoklatan. Cacing tanah ini memiliki habitat di daerah
lembab dan biasanya berada di dalam tanah, apabila hendak mencari makan maka
akan muncul ke permukaan tanah (Edwards and Lofty, 1972).
7
Gambar II.2. Cacing tanah L. rubellus
Cacing tanah merupakan kelompok eukariot yang paling sederhana. Adapun
taksonomi dari cacing tanah L. rubellus, yaitu:
Kingdom
: Animalia
Filum
: Annelida
Kelas
: Clitellata
Subkelas
: Oligochaeta
Ordo
: Haplotaxida
Famili
: Lumbricidae
Marga
: Lumbricus
Spesies
: L. rubellus
Cacing tanah Lumbricus rubellus termasuk dalam kelompok famili Lumbricidae,
dimana spesies cacing lain yang termasuk kelompok ini, meliputi Allolobophora
sp., Aporrectodea caliginosa, Aporrectodea trapezoids, Aporrectodea tuberculata,
Aporrectodea rosea, Dendrobaena octaedra, Dendrodrilus rubidus rubidus,
Dendrodrilus rubidus tenuis ,Eisenia andrei , Eisenia foetida, dan Eisenia
japonica (Blakemore, 2003).
II.3.2 Lumbrokinase
Cacing tanah sangat bermanfaat bagi kehidupan manusia, salah satu diantaranya,
yaitu kemampuan dalam memproduksi enzim lumbrokinase yang sering
digunakan sebagai obat stroke karena memiliki kemampuan fibrinolitik. Selain
itu, lumbrokinase ini mendukung stabilitas koagulasi darah pada tingkat normal,
dapat meningkatkan aktifitas fibrinolitik yang mirip fungsinya dengan
8
nattokinase, dan mempertahankan viskositas darah pada tingkat normal (Allergy
Research Group, 2005).
Asal nama lumbrokinase diberikan berdasarkan sumber cacing yang memproduksi
enzim tersebut, yaitu Lumbricus rubellus (Mihara et al., 1991). Lumbrokinase
sendiri, pada dasarnya terbagi dalam enam kelompok enzim, yaitu F-III-2, F-III-1,
F-II, F-I-2, F-I-1, and F-I-0. Adapun karakteristik dari enzim ini, yaitu stabil pada
suhu di bawah 60oC dan memiliki rentang pH antara 2 dan 11, dan memiliki
aktivitas fibrinolitik (Nakajima et al., 2003).
Lumbrokinase merupakan kelompok protease yang memiliki aktifitas tripsin dan
enzim mirip kimotripsin, namun ada pula sebagian yang bersifat enzim mirip
elastase. Berdasarkan hasil fraksinasi, lumbrokinase terbagi menjadi enam jenis,
yaitu kelompok I fraksi F-I-0, F-I-1, dan F-I-2 memiliki aktivitas enzim mirip
kimotripsin, kelompok II fraksi tidak terbagi, dan kelompok III fraksi F-III-1 dan
F-III-2 memiliki aktivitas enzim mirip tripsin, sedangkan kelompok II termasuk
dalam kelompok elastase (Mihara et al., 1991).
Apabila ditinjau dari komposisi asam amino menunjukkan bahwa lumbrokinase
ini termasuk dalam kelompok protease serin, yang memiliki sejumlah residuresidu asparagin dan aspartat cukup tinggi sedangkan residu-residu prolin dan
lisin berada dalam jumlah sedikit serta memiliki aktifitas fibrinolitik (Nakajima, et
al., 2003). Selain itu, keberadaan autolisat dari cacing ini dapat bermanfaat
sebagai antioksidan dan juga sumber protease yang hampir sama dengan saus
kedelai (Nakajima et al., 2000).
Cacing tanah famili Lumbricidae terdiri dari beberapa jenis, hal ini tidak menutup
kemungkinan ditemukannya enzim fibrinolitik asal cacing tanah spesies yang lain,
misalnya: enzim fibrinolitik cacing tanah (earthworm fibrinolytic enzyme-3 atau
EFE-3, database GenBank nomor kode AY438622) yang berasal dari cacing tanah
Eisenia foetida yang memiliki tingkat homologi yang tinggi dengan protease asal
cacing tanah L. rubellus F-III-1 dan F-III-2 (Dong et al., 2004).
9
Kemudian terdapat penelitian lebih lanjut mengenai enzim fibrinolitik asal cacing
tanah E. foetida yang dikenal sebagai earthworm fibrinolytic enzyme-2 atau EFE2. Enzim fibrinolitik yang memiliki spesifisitas sisi hidrolitik untuk ikatan peptida
dan memiliki aktifitas mirip tripsin dan elastase (Zhao, 2003).
Seperti telah diungkapkan sebelumnya, lumbrokinase yang dihasilkan oleh cacing
tanah L. rubellus tidak terlalu banyak, namun tingkat kebutuhan lumbrokinase ini
semakin meningkat. Terbukti dengan tingginya angka kematian mencapai 26
miliar setiap tahunnya akibat penyakit stroke. Oleh karena itu, dilakukan berbagai
upaya untuk meningkatkan produksi lumbrokinase. Ekspresi lumbrokinase pada
E. coli menunjukkan lumbrokinase rekombinan memiliki aktifitas enzimatik yang
rendah setelah denaturasi dan renaturasi. Oleh karena itu, dilakukan ekspresi
lumbrokinase dari cacing tanah pada Pichia pastoris yang menunjukkan homologi
yang cukup tingi dengan lumbrokinase lain yang terdapat dalam Gene bank, yaitu
F-III-1, F-III-2, EFE3-1, dan 1T4 yang berasal dari L. rubelllus, PI239 yang
berasal dari L. bimastus, dan EFE-3 yang berasal dari E. foetida. Namun
demikian, masih dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai optimasi dan
karakterisasi dari lumbrokinase hasil ekspresi ini (Ge et al., 2005).
Lumbrokinase memiliki aktifitas fibrinolitik yang sangat bermanfaat dalam
pengobatan penyakit stroke dan juga tumor. Lumbrokinase G-90 yang diekstrak
dari cacing tanah E. foetida memiliki kemampuan dalam membantu aktifitas
fibrinolitik penderita tumor yang sangat dipengaruhi oleh lokasi tumor dan juga
konsentrasi dari enzim yang ditambahkan (Hrzenjak et al., 1998). Selain itu,
enzim yang diproduksi cacing tanah Lumbricus rubellus ini sangat berguna dalam
pengobatan radang otak, dimana akan mempengaruhi sistem koagulasi darah dan
aktifitas fibrinolitik sehubungan dengan peningkatan aktifitas t-PA (Jin et al.,
2000).
Kelompok protease Ef P-III-1 selain dapat berperan dalam aktifitas fibrinolitik
juga berperan dalam aktifitas fibrinogenesis. Dalam hal ini, penelitian dilakukan
10
pada cacing tanah Eisenia foetida, yang menunjukkan enzim tersebut dapat
mengaktifasi plasminogen dan melepaskan plasmin aktif, hal ini memiliki
kesamaan fungsi dengan t-PA (Jing et al., 2007).
II.3.3 Aktifitas Cacing tanah L. Rubellus dalam Perombakan Bahan Organik
Cacing tanah termasuk dalam kelompok jasad hidup yang berperan dalam
perombakan bahan organik, disamping itu, terdapat pula protozoa, ganggang,
cendawan, dan bakteri. Salah satu aktifitas dari jasad hidup dalam tanah ini, yaitu
melakukan proses mineralisasi (dekomposisi) bahan organik yaitu menghancurkan
bahan organik yang berasal dari hewan maupun tumbuhan menjadi senyawa
anorganik sederhana. Proses perombakan bahan organik dan perubahan nitrogen
organik menjadi nitrogen anorganik oleh jasad hidup tanah, meliputi aminisasi,
amonifikasi, nitrifikasi, dan denitrifikasi (Sarief, 1986).
Aminisasi merupakan proses penghancuran senyawa protein yang berasal dari
bahan organik menjadi senyawa nitrogen amino. Protein yang terkandung dalam
bahan organik, bervariasi. Asam amino ini, kemudian akan diuraikan menjadi
amonia. Ammonifikasi, yaitu pembentukkan amonia dapat terjadi dalam keadaan
aerob maupun anaerob. Proses amonifikasi sangat penting bagi pertumbuhan
tanaman. Ammonia dapat berada bebas dalam tanah atau akan diubah mejadi
nitrat (NO3). Energi yang dperleh dari proses nitrifikasi dimanfaatkan oleh
mikrorganisme nitrifikasi untuk pertumbuhan dan perkembangbiakannnya. Dalam
situasi normal, nitrogen dapat diproses menjadi bentuk ammonium atau bentuk
nitrat yang tersedia bagi tanaman. Apabila dalam keadaan yang kurang baik,
misalnya kondisi air tanah yang kurang, akan terjadi reduksi nitrat menjadi nitrit,
amonia atau nitrogen, yang disebut denitrifikasi (Sarief, 1986).
Proses denitrifikasi dalam tanah terjadi karena adanya kerjasama cacing tanah dan
juga mikroba tanah. Kemampuan mikroba tanah lain dalam memproduksi N2O
terjadi dalam lingkungan yang memiliki C/N ratio yang tinggi, biasanya terdapat
dalam saluran pencernaan hewan lain yang lebih tinggi tingkatannya. Saluran
pencernaan acing tanah memiliki C/N ratio 7. Dalam hal ini, mikroba tanah
11
menggunakan saluran pencernaan cacing tanah sebagai lingkungan dalam
memproduksi N2O. Hal ini terbukti dengan tingginya konsentrasi N2O pada
saluran pencernaan cacing tanah, meningkat mulai dari ujung anterior sampai
saluran pencernaan bagian tengah dan menurun pada bagian posterior. Hal ini
menunjukkan bahwa saluran pencernaan cacing tanah merupakan lingkungan
yang tepat bagi mikroba untuk memproduksi N2O (Horn et al., 2003).
II.4 Deoxyribonucleic Acid (DNA)
Setiap makhluk hidup memiliki asam deoksiribonukleat (deoxyribonucleic acid,
DNA), baik prokariot maupun eukariot. Pada organisme prokariot, kromosom
merupakan molekul tunggal DNA berukuran besar DNA, sedangkan pada
organisme eukariot mengandung lebih banyak molekul DNA dibandingkan
organisme prokariot. DNA sendiri merupakan molekul yang sangat panjang terdiri
dari ribuan deoksiribonukleotida yang tergabung dalam suatu urutan yang bersifat
khas pada setiap organisme. Struktur molekul DNA, yaitu heliks ganda (Gambar
II.2).Asam deoksiribonukleat merupakan polimer yang tediri dari molekulmolekul deoksiribonukleotida yang terbentuk dari ikatan antara atom C nomor 3
dan atom C nomor 5 pada molekul deoksiribosa dengan perantara gugus fosfat,
sehingga membentuk rantai polinukleotida yang panjang.
Molekul DNA memiliki basa pirimidin (sitosin dan timin) dan purin (adenin dan
guanin). Antara basa-basa yang terdapat pada asam nukleat ini membentuk ikatan
hidrogen (H-N dan O-H). Keempat basa berada dalam nisbah yang berbeda pada
berbagai DNA organisme dan saling berhubungan secara kuantitatif, DNA yang
diisolasi dari berbagai jaringan spesies yang sama memiliki komposisi yang sama,
komposisi basa DNA bervariasi dari satu spesies ke spesies lain, komposisi basa
DNA pada spesies tertentu tidak berubah dengan pertambahan umur organisme,
perubahan tingkat nutrisi, atau perubahan lingkungan, serta jumlah residu adenin
pada semua DNA sama dengan residu timin, dalam hal ini tidak tergantung
dengan spesies (Chargaff et al. ,1940 dalam Lehninger, 1982).
.
12
Gambar
II.3.
Struktur DNA dan basa penyusun
http//cnx.org/content/m12382/latest/).
DNA
(Sumber:
Adapun sifat-sifat molekul DNA yang laun, yaitu molekul DNA bersifat sangat
rapuh, sehingga molekul DNA tidak mudah diisolasi dalam bentuk utuh, karena
mudah terpotong dengan gaya mekanik. Perlakuan mengaduk larutan DNA dapat
menyebabkan molekulnya terfragmentasi.
Fungsi dari DNA adalah untuk menyimpan informasi genetik secara lengkap yang
diperlukan untuk mencirikan struktur semua protein dan RNA setiap spesies
sehingga dapat membuat program biosintesis sel pada saat yang tepat dan
komponen jaringan secara teratur, selain itu untuk menentukan aktifitas organisme
sepanjang siklus hidupnya, dan menentukan kekhasan organisme tertentu.
II.5 Ribonucleic Acid (RNA)
Asam ribonukleat (ribonucleic acid, RNA) merupakan suatu polimer yang terdiri
atas molekul-molekul ribonukleotida yang terbentuk dari ikatan antara atom C
nomor 3 dengan atom C nomor 5 pada molekul ribose dengan perantara gugus
fosfat (Gambar II.3). Basa penyusun yang terdapat dalam RNA berbeda dengan
DNA, pada kelompok pirimidin (sitosin dan urasil) dan purin (adenin dan guanin).
Jumlah guanin dalam molekul RNA tidak sama dengan sitosin, demikian pula
adenin tidak harus sama dengan urasil (Poedjiadi, 1994).
13
(1)
(2)
Gambar II.4 Struktur RNA dan basa penyusun RNA. (1) Basa penyusun RNA,
(2) Struktur dari tRNA (Sumber: http://library.thinkquest.org)
Pada dasarnya RNA terdiri dari beberapa jenis, yaitu RNA pembawa pesan
(mRNA), RNA transfer (tRNA), dan RNA ribosom (rRNA). Selain itu, terdapat
pula RNA inti heterogen (hnRNA) dan RNA inti kecil (snRNA), pada umumnya
RNA tambahan ini terdapat pada eukariot (Lehninger, 1972). Jumlah RNA
terbesar yaitu sekitar 75 persen terdapat dalam sitoplasma sel yang terletak di
dalam ribosom (rRNA). Dalam inti sel juga terdapat RNA yang berjumlah sekitar
15 persen dari seluruh RNA dalam sel, sedangkan mRNA memiliki jumlah paling
sedikit sekitar 5 persen dari jumlah RNA total dan mudah terdegradasi
Setiap komponen RNA memiliki peranan penting pada proses translasi dengan
struktur yang khas, misal pada tRNA merupakan satu untai ribonukleotida tapi
dalam konformasi yang berlipat-lipat berupa loop (Gambar II.3), berperan dalam
membawa asam amino ke dalam ribosom dan menerjemahkan sandi genetik pada
mRNA ke dalam urutan asam amino pada protein. Sedangkan rRNA merupakan
komponen utama ribosom dan menyusun hampir 65 persen berat ribosom
berperan dalam struktur dan fungsi biosintesis ribosom. mRNA berperan sebagai
cetakan yang digunakan oleh ribosom untuk melangsungkan proses translasi
informasi genetik menjadi urutan asam amino protein (Mathews et al., 2000).
14
II.6 Mekanisme Transkripsi dan Translasi
Dalam proses biosintesis protein, terdapat mekanisme transkripsi dan translasi.
Pada tahap transkripsi molekul DNA berperan sebagai pemberi informasi genetik
kepada molekul RNA dengan bantuan RNA polimerase holoenzim. Namun
demikian, tidak seluruh molekul DNA yang ditranskripsi. Oleh karena itu,
transkripsi DNA bersifat sangat selektif yang diatur oleh deret pengatur spesifik
yang menunjukkan awal dan akhir potongan DNA yang akan ditranskripsi.
Proses transkripsi terdiri dari 3 tahap, yaitu inisiasi, elongasi, dan terminasi
(Gambar II.4). Pada tahap inisiasi, RNA polimerase holoenzim berikatan dengan
DNA sehingga untaian DNA (promoter). Dalam promoter ini, mengandung urutan
DNA spesifik, seperti TATA Box (Pribnow box) atau CAAT (pada eukariot).
Kemudian, terdapat pula faktor sigma yang merupakan protein berfungsi dalam
menstabilkan polymerase dan mengunci DNA untuk melakukan proses
transkripsi.
Akibatnya,
untaian
DNA
akan
membuka
lebar
sehingga
memungkinkan untuk berpasangan dengan DNA komplemennya. Pada tahap
inisiasi pula, ujung 5’ dari mRNA akan melakukan capping dengan 7methylguanosine yang berfunsi dalam mejga kestabilan mRNA dan melindungi
dari eksonulease. Pada ujung 3’, mRNA akan mengalami poliadenilasi dengan
urutan AAUAAA yang dikenal sebagai poliadenilat polymerase dan terjadi proses
pembuangan intron, yang disebut juga splicing. Sebelumnya, terjadi penambahan
poli A pada ujung 3’. Pada tahap elongasi, terjadi produksi RNA dengan arah
pemanjangan dari ujung 5’ menuju ujung 3’ serta koreksi cetakan, dalam hal ini
memperbaiki kerangka baca basa yang salah.. Proses terminasi, terjadi apabila
terdapat stop signal, biasanya pada daerah yang kaya akan urutan nkleotida GC
diikuti oleh oligo A. Pada tahapan ini, dihasilkan urutan RNA yang sama dengan
templat DNAnya dan proses transkripsi akan berhenti. RNA akan siap digunakan
pada proses translasi. Pada organisme prokariot, tanskripsi berlangsung di
sitoplasma, sedangkan pada organisme eukariot, transkripsi berlangsung di
nucleus (Lewin, 1997).
15
(1)
(2)
Gambar II.5 (1) Mekanisme pada proses transkripsi, (2) Splicing
(Sumber: www.geneticengineering.org)
Pada tahap translasi, molekul RNA menerjemahkan informasi genetika ke dalam
proses pembentukkan protein (Gambar II.5). Dalam tahap ini terjadi pengikatan
asam amino, sesuai pesan yang diberikan oleh DNA. Biosintesis protein
berlangsung dalam ribosom, yaitu suatu partikel yang terdapat dalam sitoplasma.
Proses yang terjadi dalam biosintesis protein, meliputi aktifasi asam amino,
inisiasi rantai polipeptida, pemanjangan, terminasi, dan pelipatan serta
pengolahan.
Pada proses translasi diawali dengan inisiasi pembentukkan unit kecil ribosom
yang kemudian akan mengenali mRNA melalui urutan tertentu, yaitu inisiator
kodon AUG, yang akan dibawa oleh tRNA. Kemudian sub unit ribosom besar
akan membentuk komplek dengan komplek inisiasi sebelumnya. Kemudian tRNA
akan membawa asam amino lainnya dipasagkan degan kodon berikutnya, setelah
posisi kodo inisiator. Selama fase elongasi, ribosom akan melanjutkan pembacaan
kodon dari ujng 5’ ke ujung 3’ dan terjadi pembentukkan asam amino yang
bersamaan dengan pembentukkan ikatan peptida. Sedangkan pada tahap
terminasi, proses akan berhenti apabila terdapat stop kodon , yaitu UAA, UAG,
UGA, diikuti dengan pelepasan rantai polipeptida (Mathews et al., 2000).
16
Gambar II.6 Mekanisme pada proses translasi
(Sumber: www.geneticengineering.org)
II.7 Metode Polymerase Chain Reaction
Metode PCR (polymerase chain reaction) merupakan metode yang digunakan
untuk memperbanyak urutan nukleotida tertentu dengan katalis enzim secara
eksponensial dalam kondisi in vitro. Metode ini, pertama kali dikembangkan oleh
Kary B. Mullis pada tahun 1985.
Komponen utama dalam proses PCR, adalah templat DNA (DNA cetakan), yaitu
fragmen DNA yang akan diperbanyak, oligonukleotida primer yang merupakan
urutan
oligonukleotida
pendek
untuk
mengawali
sintesis
DNA,
deoksiribonukleotia (dNTP), dan DNA polimerase yang berperan sebagai katalis
reaksi sintesis DNA.
Proses yang terjadi dalam PCR terbagi dalam 3 tahap, yaitu denaturasi,
penempelan, dan pemanjangan atau elongasi (Gambar II.5). Pada tahap denaturasi
templat DNA akan terpisah menjadi rantai tunggal, biasanya dilakukan pada suhu
95oC selama 1–2 menit, kemudian proses penempelan dimana terjadi proses
penempelan primer pada rantai DNA tunggal. Primer akan membentuk jembatan
hidrogen dengan cetakan pada daerah urutan yang saling berkomplemen. Selain
itu, dalam penentuan suhu penempelan berhubungan pula dengan titik leleh
17
primer. Proses perbanyakan sangat efisien pada suhu rendah namun dapat
menimbulkan penempelan primer pada tempat yang salah (mispriming). Pada
suhu penempelan yang sangat tinggi, spesifisitas amplifikasi akan meningkat tapi
efisiensinya akan menurun. Setelah tahapan penempelan, dilakukan proses
elongasi dimana DNA polimerase akan melakukan polimerasi rantai DNA baru
berdasarkan informasi baru yang terdapat pada cetakan DNA. Setelah tahapan
polimerasi, rantai DNA baru akan membentuk jembatan hidrogen dengan DNA
cetakan. Selanjutnya produk amplifikasi yang dihasilkan akan kembali menuju
tahapan denaturasi dan seluruh proses akan berulang sebanyak siklus yang
digunakan dalam proses amplifikasi, biasanya 25–30 kali siklus (Sambrook and
Russel, 2001) Pada umumnya DNA polimerase yang sering digunakan dalam
proses PCR, yaitu polimerase Taq (Yuwono, 2006).
Gambar II.6 Aktifitas yang Terjadi pada Proses PCR
(Sumber: www.wikipedia.org)
Seiring dengan perkembangan zaman, teknik PCR semakin maju, sehingga
ditemukan pula variasi teknik PCR, diantaranya transkriptase balik-PCR (RTPCR), dimana dalam prosesnya menggunakan transkriptase. Enzim ini merupakan
DNA polimerase yang menggunakan RNA sebagai cetakan untuk menyintesis
18
DNA komplemen (cDNA) yang komplemen dengan molekul RNA tersebut.
Transkriptase yang banyak digunakan dalam proses RT-PCR, yaitu berasal dari
avian myoblastic virus (AMV). Reaksi transkripsi balik dapat dilakukan dengan
beberapa macam primer, yaitu :
a. Oligo (dT) sepanjang 12–18 nukleotida yang akan menempel pada ekor poli
(A) pada ujung 3’ mRNA. Primer semacam ini biasanya menghasilkan cDNA
yang lengkap.
b. Heksanukleotida acak yang akan melekat pada cetakan mRNA yang
komplementer pada bagian manapun. Primer semacam ini akan menghasilkan
cDNA yang tidak lengkap.
c. Urutan nukleotida spesifik yang dapat digunakan secara selektif untuk
menyalin mRNA tertentu.
19