fnaialab llrniab - Fakultas Pertanian Universitas Haluoleo

fnaialab llrniab
AGR,IPLf]S
ISSN Og5+ ^, O72g
Adoutlah, Nla'ruf Tafsln, Amlnuddln Parakkasl, Andt Nlurft
: PENGARUH
SUPLEMENTASI BERBAGAI SERAT KOMERSIL TERHADAP KADAR KOLESTEROL
SERUM DAN DAGING PADA MENCIT (Musmusculuc)
A. Bahrun z RESPON TANAIvIAN
KEDELAI (Glyicine max L. Merr) TERHADAP SISTEM
PENGAIRAN.
NIuhIdTn : TOLERAT{SI BEBERAPA VARIETAS KEDELAI TERHADAP CEKAMAI{ ALU.
MINIUM PADA STADIA BIBIT
Takdlr Salll, Nlohamad Agvs Settadt, Srlhadl Agungprlyono, Nlozes R. Toehhere
dan Artef Boedtono : PENGARUH PENGERINGBEKUAN TERHADAP PERUBAHAI{
MORFOLOGI SPERMATOZAA DOMBA
Nluhammod Tauftk dan Syalr : ISOLASI DNA PLASMID DENGAN METODE MINIPREP
QIAPREP (ISOLATING BACTEARIA PLASMID BY MINIPREP QIAPREP)
IUIuKhtaT : PROSPEK PENGEMBANGAN AGRIBISNIS KARAMBA JARING APUNG
IKAI{ KERAPU TIKUS (Cromileptes altiuelis) DI KECAMATAN SOROPIA
Gusno Ff.S. dan Abdul Rahman: AIIALISIS PROTEIN DAN ISOZIM PLANLET PISAhIG
BARAT.IGA}I HASIL INDUKSI FILTRAT FOC DAN BDB SECARA IN-YITRO
L.IW. HaTofah : PRODUKTIVITAS PEKERJA DAN STRATEGI KEBIJAKAN
PEMBANGUNAN SEKTOR PERTANIAN (STUDI PADA MASYARAKAT PEDESAAN
DI PROVINSI SULAWESI TENGGARA)
Hg/MflTUI Ho,dTN' : DESKRIPSI DAN KLASIFIKASI PISANG LOKAL ASAL KABUPATEN
BUTON PROVINSI SULAWESI TENGGARA
ISKAndaT : PENGARUH PENYAJIAN PESAN PUPUK AGRODYKE DAN PENGGUNAI{N
VISUALISASI MELALUI VIDEO TERHADAP PENINGKATAN PENGETAHUAI{ PETAI{I
Ayub NI. Padanssran : ANALISIS PERTUMBUHAN DAN KEBUTUHAI{ INVESTASI
OPTIMAL SEKTOR PERTANIAN DI SULAWESI TENGGARA
Husna, Robtatul Adau:tyah, Ls Ode Altmuddtn dan Fatsol Danu Tuheteru :
STATUS KEANEKARAGAMAN CENDAWAN MIKORIZA ARBUSKULA (CMA)
PADA EMPAT TANAMAN LOKAL SULAWESI TENGGARA
DAFTAR ISI
Halaman
PENGARUH SUPLEMENTASI Bf,RBAGAI Sf,RAT KOMERSIL TERHADAP
KADAR KOLESTEROL SERUM DAN DAGING PADA MENCIT
(Mus masculus)
Adawtyah, Ma'ruf Tafsln, Amlnuddln Parakkasi, Andi
RESPON TANAMAN KEDELAI (Glyictne max
L
Murfi
* 89
'85
Merr) TORIIADAP SISTEM
PENGA,IRAN.
A.
Bahrun
90-97
TOLERANSI BEBERAPA VARIETAS KEDELAI TERHADAP CEKAMAN
ALUMINIUM PADA STADIA BIBIT
Muhidln.....
98
H Pf, NG ERING BI]KUAN TERHADAP PERU BAHAN MORI'OLOG I
SPERMATOZOA DOMBA
TaWir Saill, Mohamad Agus Setiodi, Srlhadi Agungpriyono, Mozes R.Toelihere dan
Arlef Boedlono. ..........
107
TSOLASI DNA PLASMID DENGAN METODDE MINIPREP QIAPREP
(ISOLATING BACTEARIA PLASMID BY MINIPREP QIAPREP)
MahantmadTautihdanSyair ........
ll8-122
-
106
Pf, NGARU
_tt7
PROSPEK PENGEMBANGAN AGRIBISNIS KARAMBA JARING APUNG
IKAI{ KERAPU TIKUS (Cromilqta altlvelis) DI Kf,CAMATAN SOROPIA
Mukhtar
123
-
133
- 137
138
-
148
149
*
157
158-
166
167
-
172
173
- lg2
132
ANALISIS PROTDIN DAN ISOZIM PLANLET PISANG BARANGAN HASIL
INDUKSI FILTRATFOC DAN BDBSECARA IN-VITRO
Rahman...................
PRODUKTIVITAS PEKERJA DAN STRATEGI
Gusna H.S, dan Abdul
KEBIJAKAN
PEMBANGUNAN SEKTOR PERTANIAN (STUDI PADA MASYARAKAT
PEDESAAN DI PROVINSI SULAWESI TENGGARA)
L.M. Harafah
..................
DESKRIPSI DAN KLASIFIKASI PISANG LOKAL ASAL KABUPATEN
BUTON PROVINSI SULAWESI TENGGARA
Hamlrul Hadini .. .... ..... . ...
PENGARUH PENYAJIAN Pf,SAN PUPUK AGRODYKE DAN PENGGUNAAN
VIDEO TERHADAP PENINGKATAN
PENGETAHUAN PETANI
VISUALISASI MELALUI
Is
kandar..........
ANALISIS PERTUMBUHAN DAN KEBUTUHAN INVE.STASI OPTIMAL
SEKTOR PERTANIAN DI SULAWESI TENGGARA
Ayub M.
Padangaran
...........:..........
STATUS CENDAWAN MIKORIZA ARBUSKULA (CMA) PADA EMPAT
TANAMAN LOKAL SULAWEST TENGGARA
Husna, Robidul Adowiyah, La Ode Albnuddin dan Faisol Danu
Tuhderu
AGRIPLUS, Volume 16 Nomor: 02 Mei 2006, ISSN 085+0U8
ISOLASI DNA PLASMID DENGAI\I METODDE MINIPREP QIAPREP
(ISOLATING BACTEARIA PLASMID BY MINIPRNP QIAPREP)
OIeh : Muhammad TauJik dan Syair
I)
ABSTRACT
Plasmids are relatively small, circular r,rolecules of DNA that carry genes both for their own
replication and usually carry genes that confer drug resistance. The aim of this experiment was to isolate
plasmid of bactearia. A research conducted in Laboratory of Microbiolog5r, Medicine Faculty, Hasanuddin
University, Makassar. Ten samples of bacteria were used. The isolation methode used was to isolation with
Miniprep qiaprep. The results showed that the methode was good use for isolation DNA plasmid of group of
Corynebacteria. Whereas plasmid was not founded from sample group of Lactobacillus.
Key words: Corynebcrterir, DNA Plasmid, Isolation, Lectobacillus, and miniprep qiaprep.
PENDAHULUAN
Di
dalam sel bakteri terdapat kromosom sebagai pembawa informasi genetik.
Molekul DNA kromosom berbentuk lingkaran
yang berukuran amat besar dan teletak dalam
inti. Selain itu juga mengandung molekul
DNA yang disebut plasmid. Plasmid terdapat
bebas dalam sitoplasma sel bakteri. DNA
Plasmid bakteri berbentuk sirkuler yang
berukuran sekitar I kilobasa (kb) sampai lebih
dari 400 kb atau bisa disebut megaplasmid.
Prefiifelder (1987) melaporkan bahwa ukuran
plasmid antara 0.2-4% dari ukuran kromosom
bakteri. Plasmid dapat bereplikasi sendiri,
artinya tidak tergantung pada kromosom
inang. Kemampuan plasmid untuk bereplikasi
sendiri disebut automous replication. Menurut
Hayes (1986) rekombinasi beberapa plasmid
dapat berintegrasi dengan kromosom dengan
demikian plasmid dapat berstatus sebagai
plasmid dan kromosom. Dalam keadaan
berintegrasi dengan kromosom, replikasinya
dikontrol oleh kromosom.
Plasmid bakteri dapat berpindah dari
satu sel ke sel lain. sehingga dapat mengakibatkan terjadinya proses transfer gen diantara sel-sel tersebut dan plasmid bertanggungjawab terhadap keragaman genetik
bakteri. Plasmid dapat juga menyandikan gengen yang berhubungan dengan kemampuan sel
inang untuk beradaptasi terhadap
kondisi
lingkungan yang baru dan mempengaruhi sifat
fenotipe dari inangnya. (Campbell. 1981).
Mekanisme replikasi plasmid secara
umum sama dengan replikasi kromosom.
Pada beberapa plasmid, replikasi terjadi
dengan dua arah dan pada plasmid lain terjadi
dengan satu arah (Watson et al., 1983).
Replikasi pada plasmid maupun kromosom
membutuhkan beberapa fungsi replikasi yang
umum mengawali polimerisasi. Plasmid high
copy number pada Escherichia coli selain
membutuhkan enzin DNA polimerase III juga
membutuhkan enzin DNA polimerase I untuk
memulai replikasinya. DNA plasmid bereplikasi dalam keadaan tetap bulat melingkar, dan
dapat diisolasi dalam bentuk relaxation
complex, dimana DNA terikat pada proteinprotein. Bila kompleks ini dipanaskan atau
ditambahkan alkali, enzim proteolitik ataupun
detergen, akan terjadi relaksasi dan terbentuklah nrc& DNA yang bulat melingkar
(Dale 1994).
Isolasi DNA plasmid dapat dilakukan
dengan memanfaatkan sifat fisik dari molekul
DNA supercoil. Molekul-molekul ini lebih
kompak daripada nick atau linear dupleks dan
pada ultta sentrifugasi lebih cepat diendapkan.
Ukuran molekul-molekul DNA plasmid dapat
dibedakan dengan pemisahan menggunakan
agarose gel' elektroforesis. Dan setelah dilakukan pewarnaan dengan ethidium bromide,
molekul-molekul DNA dapat dilihat dibawah
sinar ultra violet. Teknik ini memberikan
kesempatan untuk dapat mempelajari/
menganalisa enzim endonuclease maupun
enzim lain dalam plasmid (Brown l99l).
t) Sn/ Pengajar Jurusan Budlda;a Peranidn Fdkultas Perlanian llniversilas Haluoleo, Kerdari.
ut
119
Elemen genetik pada plasmid dapat
dipindahkan dari satu sel ke sel lain dengan
konjugasi dan tansformasi. Apabila transfer
DNA plasmid terjadi oleh adanya kontak antar
sel bakteri maka peristiwa ini disebut
konjugasi. plasmid diklasfikasikan menjadi
konjugatif plasmid dan nonkonjugatif plasmid.
Pada plasmid konjugatif terdapat tra gen,
sedangkan pada plasmid non konjugatif tidak
ada. Adanya gen tra tersebut plasmid dapat
ditransfer dari satu sel ke sel lain. Mobilisasi
plasmid nonkonjugatif dapat dimediasi oleh
plasmid konjugatif (Goto 1990).
DNA plasmid dapat diisolasi dari sel
bakteri inangnya dengan beberapa cara.
Kualitas dan kuantitas DNA plasmid yang
diperoleh sangat bergantung dengan metode
yang digunakan. Saat ini, telah dikembangkan
metode isolasi DNA plasmid menggunakan
Kit (QIAprep Miniprep) yang telah dijual
bebas. Metode ini sangat mudah dan cepat
serta dapat menghasilkan DNA yang cukup
banyak. Oleh karena itu tujuan penelitian ini
adalah mengisolasi DNA plasmid bakteri
asam laktat dan bakteri patogen dengan
metode (QIAprep Miniprep).
Metode Isolasi DNA Plasmid Bakteri
di
pada 13.000 rpm sampai terbentuk pelet
berwana putih. Supernatan dipindahkan ke
dalam spin kolom QiAprep. dengan cara
dekantasi atau dipipet. Tabung disentrifugasi
13.000 rpm selama I menit. Cairan di dasar
kolom dibuang. Kolom dicuci dengan menambahakan 0,5 ml bufer PB dan disentrifugasi I menit 13.000 rpm. Setelah sentri-
fugasi cairan di
dasar kolom dibuang dan
ditambahkan 0,75 ml bufer PE dan
disentrifugasi selama 1 menit pada 30.000
rpm. Tahap aklrir kolom dimasukkan ke
dalam tabung ependorf baru dan ditambahkan
50 pl bufer EB atau akubidest, inkubasi
selama I menit dan sentrifugasi selama
menit dengan kecepatan 13.000 rpm.
I
Penyiapan Agarose Gel
(Sambrook et al.1989)
Pencetak gel dibersihkan dan dikeringkan dan diletakkan pada permukaan
meja yang datar. Sisir gel di letakkan di
bagian atas dan bagian tengah aparatus
pencetak gel dengan menggunakan waterpas
untuk mengetahui aparatus pencetak gel dalam
BAHAI\I DAN METODE
Penelitian dilaksanakan
250 pl bufer P1. Kemudian ditambahkan lagi
350 p! bufer N3 dan dihomogenkan dengan
membolak-balikkan tabung 5-6 kali.
Selanjutnya disentrifugasi selama l0 menit
Labora-
torium Mikobiologi Fakultas Kedokteran,
Universitas Hasanuddin. Metode isolasi DNA
plasmid menggunakan kit (QIAprep Miniprep)
yang tekniknya lebih sederhana dan hasilnya
lebih murni. Isolat bakteri yang digunakan
adalah L. bulgaris, C. ferundii (isolat A), L.
acedo/hilus, C. ferundii (isolat B), L. cassei,
C. ferundii (isolat C), L. lactis (isolat Al), C.
ferundii (isolat D), L. lactis (isolat A2), dan C.
ferundii (isolat E).
Prosedur kerja sebagai berikut: Kultur bakteri
dimasukkan ke dalam tabung ependorf
sebanyak 1 ml kemudian untuk memisahkan
medium dengan sel bakteri dilakukan sentrifugasi 12.000 rpm selama 5 menit. Pellet yang
diperoleh dilarutkan dengan menambahkan
AGRIPLUS, Yolume 76 Nomor
keadaan seimbang. Pada penelitian ini satu
lembar agarose ukuran l0 X l5 cm digunakan
satu sisir gel pada bagian. Bufer elektroforesis
(TBE 0,5 x) digunakrrn untuk membuat gel
dan mengisi tangki elektroforesis. Gel dibuat
dengan rnenimbang I g agarose yang kemudian di larutkan ke dalam gelas kimia yang
telah berisi 50 rnl bulbr l'BE 0,5 X schingga
konsentrasi yang di gunakan adalah 2%.
Campuran tersebut dipanaskan dengan &ol
plate saynbil diadLrk sampai agarose larut.
Mendinginkan campuran tersebut dan setelah
dingin dituang ke dalam aparatus pencetak
gel.
Diperhatikan jangan sampai
ada
gelembung udara yang terbentuk. Gel akan
mengeras setelah 30-45 menit pada suhu
ruang. Secara hati-hati Sisir gel dilepaskan
dan gel diletakkan ke dalam tangki elektro-
foresis. BufTer elektrotbresis ditambahkan
sampai gel terendam (tinggi buffer kurang
: 02 Mei 2006, ISSN 085NU8
120
lebih I mm di atas permukaan gel). Sampel
DNA plasmid bakteri dan loading dye dicampur masing-masing 12 pl dan 3 pl secara
berturut-turul dengan bantuan mikropipet
sampel DNA diisikan ke dalam sumur gel.
Tutup tangki elektroforesis, dan aparatus
elektroleresis dihubungkan dengan aliran
listrik sehingga DNA akan bergerak ke arah
anoda. Aparatus elektroforesis diaktifkan pada
75 volt sampai loading dye yang berwarna
biru berada kira-kira 5 mm dari bagian bawah
gel. Tahap akhir, aliran listrik dimatikan dan
tutup tangki eletroforcsis dibuka, kemudian
gel diangkat dari tangki dan direndam dalam
etirlium bromida selama l0 menit untuk
diamati di bawah cahaya ultraviolet.
Visualisasi gel pada transiluminator dan
Gambar
l.
Hasil elektroforesis gel
agarose
menunjukkan adanya DNA plasmid
pada kelompok bakteri Citrobacter sp
(kolom 2,4,6,8, dan l0). Keterangan:
kolom 1 sampai l0 secara berturutturut adalah: L. bulgaris, C. ferundii
(isolat A), L. acedo/hilus, C. ferundii
(isolat B), L. cassei, C. ferundii (isolat
C), L. lactis (isolat Al), C. ferundii
(isolat D), L. Iactis (isolat A2), dan C.
ferundii (isolat E).
membuat foto gel.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Pada penelitian ini berhasil diisolasi
DNA plasmid isolat bakteri yang digunakan.
Visualisasi pada agarose gel elektroforesis
mendapatkan pita-pita yang
menunjukkan adanya DNA plasmid yang
Hasil isolasi menggunakan metode
Miniprep berhasil mendeteksi DNA plasmid
bakteri kelompok Citrobacter sp. tetapi DNA
plasmid semua isolat asal bakteri asam laktat
(BAL) tidak berhasil diisolasi (Gambar I
kolom l, 3, 5, 7 dan 9). Hasil ini berbeda
dengan yang telah dilaporkan oleh Stanisch
juga berhasil
diisotasi namun belum diketahui berapa
ukuran dari DNA plasmid rersebut (Gambar
1). Pada gambar tersebut terlihat adanya
plasmid-plasmid pada bakteri Citrobacter
.ferundii (isolat A pada kolom 2), C. ferunrtii
(isolat R pada kolonr 41, C. ferundii (isolat C
pada kolorn 6), Citrohut.tcr .farundii (isolat D
pada kolorn 8) dan ('. ./arwulii(isolat E pada
(1984) bahwa Lactobacillus mempunyai
plasmid. Kemungkinan tidak adanya plasmid
yang berhasil diisolasi pada sampel tersebut
adalah adanya mekanisme curing plasmid.
Curing plasmid merupakan proses hilangnya
plasmid secara spontan dari sel bakteri. proses
kolorn l0).
tersebut dapat diakibatkan karena penambahan
bahan kirnia atau secara fisik. Dapat juga
terjadi karena penghambatan replikasi pada
DNA plasmid yang tidak disertai dengan
penghambatAn terhadap replikasi kromosom,
sehingga dalam beberapa periode keturunan
plasmid akan hilang dari sel (Dale 1994).
Selain itu sampel BAL berasal atau diisolasi
dari makanan (media) yang telah difermentasi.
Diduga selama proses pertumbuhan BAL
tidak pernah atau sangat jarang
AGRIPLUS, Volume 16 l\fomor
:
02 Mei 2006, ISSN 0g54-0129
terpapar
121
dengan antibiotik. Sementara kelompok bak-
dalam ultra-sentrifugasi atau terkena
teri Citrobacter mungkin diisolasi dari bahan
yang sering terpapar dengan antibiotik sehingga hasil elektroforesis menunjukkan adanya plasmid. Adanya plasmid pada kelompok
bakteri Citrobacter juga dimungkinkan karena
termasuk kelompok bakteri patogen. Seperti
diketahui bahwa plasmid bakteri membawa
gen yang mensandikan ketahanan terhadap
antibiotik' atau bakteriosin (plasmid R)
(Savagado 2004). Keberdaan gen tersebut
merupakan salah satu strategi dari bakteri
untuk mempertahankan keberadaannya.
Umumnya bakteri patogen memiliki satu atau
beberapa plasmid yang berfungsi untuk bertahan pada kondisi yang tidak menguntungkan
atau pada media yang mengandung antibiotik.
lakuan elektroforesis oleh suatu medan listrik.
Oleh karena itu fragmen-fragmen DNA dapat
dipisahkan dengan elektroforesis yaitu suatu
proses dimana medan listrik digunakan untuk
menggerakkan fragmen-fragmen DNA melalui ge-gel agarose yang berpori. Fragmenfragmen yang lebih kecil bergeiak lebih cepat
daripada fragmen-fragmen yang lebih besar,
sehingga ukuran besarnya fragmen dapat
diperkirakan dengan membandingkan posisiposisinya dalam gel dengan posisi molekulmolekul DNA yang telah diketahui ukurannya.
KESIMPULAN DAN SARAN
Plasmid R membuat sel inang menjadi resisten
terhadap satu atau beberapa antibiotih dan
dapat dipindahkan dari satu sel ke sel lain
yang tidak mempunyai plasmid R, serta dapat
berpindah dengan sendirinya dari satu sel ke
lain. Adanya plasmid pada genus tersebut juga
telah dilaporkan oleh Stanisch
(1984).
R dari
Keberhasilan mengisolasi plasmid
Citrobacter memungkinkan untuk mengembangkan menjadi vektor bagi DNA
rekombinan, plasmid dengan gen resisten
dapat digunakan sebagai penanda seleksi
dalam rekayasa genetik (Becker et al.2Q00).
Beberapa peneliti melaporkan bahwa untuk
mengekstraksi DNA bakteri perlu memper-
hatikan media tumbuh yang digunakan,
spesifikasi dan sensitivitas, dan kecepatan
Isolasi DNA plasmid menggunakan
metode QIAprep Miniprep
bakteri Citrobacter Sp, sedangkan pada
kelompok bakteri Lactobacillus sp tidak
ditemukan adanya plasmid. Perlu penelitian
lanjutan menggunakan teknik ekstraksi yang
lebih (modifikasi) sesuai dengan karakater
bakteri gram positif.
DAFTAR PUSTAKA
Becker WM, Kleinsmith LJ, Hardin J. 2000. The
worl of the cell. The
Cumming Publishing
AGRfPLUS, Volume 16 Nomot
Benjamin/
Company.
Amsterdam.8TSp
Brown TA. 1991. Pengantar Kloning
Gen.
Yayasan Essential Medica Yogyakarta.
274p
Campell
sumuran tempat memasukkan sampel. Diduga
ukuran DNA plasmid bakteri tersebut cukup
besar yang ditunjukkan dengan pergerakan
yang lambat pada saat diberi medan listrik 70
volt. Watson et al (1992) menguraikan bahwa
DNA supercoil mendapatkan konfigurasi yang
lebih padat daripada ekuivalennya yang
relaxed. Jadi DNA supercoil bergerak lebih
cepat daripada DNA relaxed bila diendapkan
berhasil
mendeteksi adanya plasmid pada kelompok
senhifugasi menentukan keberhasilan ekstasi
(Louws dan Cuppels 2001; Ogunbanwo 2003).
Hasil elektroforesis selama kurang
lebih 1 jam dengan konsentrasi agar ZYo
menunjukkan bahwa DNA plasmid bakteri
Citrobacter masih berada sedikit dibawah
per-
'4,. 1981. Evolutionary significance of
accessory DNA elements in bacteria.
Annual Review of Microbiology 35:5583
Dale
iW.
1994, Molccular Genetics
Jhons Wiley & Sons. 287p
of
Bacteria.
Louws FJ and Cuppcls.200l . Moleculer
Technique s. Di dalam: Schaad NW,
Jones JB, and Chun
W. editor: Plant
: 02 Mei 2006, ISSN 085+0U8
122
Pathogenic Bacteria.
Minnesota. Hlm.32 l -337
Goto
M.
1990. Fundamental
APS
Savagado 2004. Antimicrobial activities of
lactic acid bacteria strains isolated from
Burkina Faso Fermented Milk. Pakistan Journal
of Nutrition 3 (3):174-179
Press.
.
of Bacterial
plant
pathology. Academic Press. 342p
Stanisich
Watson JD, Witkowski J, Gilman M, and Zoller
M. 1992. Recombinant DNA. Second
Edition. Scientific American Books. New
VA.
in Microbiology 17:5-33 '
York. 626 p.
Torres-Pacheco
ST. 2003. lnfluence of cultural
condition on the production of
Ogunbanwo,
Sambrook
Bartletl Pul., Inc. Boston.
Hal:247-280.
AGRIPLUS,Volume 16 Nomot
Gatzon-Tiznado JK,
RiveraBustamante. 1996. Detection and Distribution
of Geminiviruses in Mexico and the Souther
United States. Phytopathology 86: 1 I 86-1 192.
Preifelder D. 1987. Plasmids. Microbial Genetics.
&
IJA,
Brown 4., Beccera Flora Dan
bacteriocin by Lactobacillus brevis
OGl. African Journal of Biotechnology
vol.2(7):179-184
Jones
1984. Identification and analysis of
plasmid at the genetic level. Di dalam:
Bennett PM and Grisnted J . Methods
J, Frietsch EF, Maniatis T. 1989.
Molecular Cloning. A Laboratory
Manual. Second Edition. CSH Cold
Spring Harbor Laboratory Press.
:
02 Mei2006, ISSN0SS+0128