LO Synthetic Medicine with Microorganism

Synthetic Medicine with Microorganism
Senin, 04 oktober 2010
Prof. Dr. Sudjadi
. Kes
SYNTHETIC MEDICINE
WITH MICROORGANISM
Kuliah terakhir, rekamannya gak bunyi, inilah derita saya….
PART A
Rekayasa genetika memainkan peran yang sangat penting, tidak hanya dalam
penelitian ilmiah, tetapi juga dalam diagnosis dan pengobatan penyakit. Dalam upaya
melakukan rekayasa genetika, manusia menggunakan DNA rekombinan.
DNA rekombinan adalah alat dalam memahami struktur, fungsi, regulasi gen dan
produk nya. Jadi DNA rekombinan merupakan kumpulan metode untuk mengkombinasikan
gen-gen.
Tujuan dari teknologi DNA rekombinan meliputi:
- Mengidentifikasi gen
- Mengisolasi gen
- Memodifikasi gen
- Mengekspresikan kembali gen di host lain
Langkah-langkah ini memungkinkan para ilmuwan dan dokter untuk:
- Mengidentifikasi gen baru dan protein yang disandi
- Untuk memperbaiki endogenous genetic defects
- Untuk memproduksi sejumlah besar produk-produk gen tertentu seperti hormon,
vaksin, dan agen biologis lainnya yang kepentingan medis
Contoh proses:
BERPIKIR TENTANG INI?
 DNA ligase digunakan untuk apa? Digunakan menyambung DNA
 Apakah enzim retriksi? Enzim yang digunakan untuk memotong DNA
 Mengapa Plasmid 'digunakan sebagai vektor kloning’? Untuk mengklonkan gen atau
mengklonkan fragmen DNA, atau mengubah sifat bakteri.
 Produksi Insulin Manusia pada E.coli
Block 7 Genetic and Molecular Biology | softfile edition | Editor : wiki
1
Synthetic Medicine with Microorganism
PART B
Prinsip Kloning
Enzim restriksi alias ‘gunting’ DNA hanya akan memotong DNA pada tempat tertentu saja,
yaitu jika ia menemukan susunan palindrom, urutan basa yang jika dibaca dari kedua utas
DNA akan tetap sama. Perhatikan contoh sekuen berikut ini:
5'-GATATC-3'
::::::
3'-CTATAG-5'
Baik di atas maupun bawah memiliki sekuen yang sama bukan (dibaca dari 5′ ke 3′)? Nah, di
sekuen palindrom seperti itulah enzim restriksi akan bekerja.
Setiap enzim restriksi hanya dapat memotong pada susunan palindrom tertentu. Misalnya
enzim EcoRI akan bekerja jika menemukan urutan GAATTC.
Block 7 Genetic and Molecular Biology | softfile edition | Editor : wiki
1
Synthetic Medicine with Microorganism
PEMOTONGAN HpaI
Pemotongan EcoRI
Vektor digunakan untuk memperkuat satu molekul DNA ke dalam banyak salinan.
Sebuah fragmen DNA harus dimasukkan ke dalam vektor kloning. Sebuah vektor kloning
adalah molekul DNA yang memiliki asal replikasi dan mampu bereplikasi dalam sel bakteri.
Kebanyakan vektor adalah plasmid rekayasa genetika atau fag. Ada juga vektor kosmid,
kromosom bakteri buatan, dan kromosom ragi buatan.
Block 7 Genetic and Molecular Biology | softfile edition | Editor : wiki
1
Synthetic Medicine with Microorganism
Plasmid merupakan molekul DNA yang berantai ganda, berbentuk lingkaran yang
tertutup, dapat bereplikasi sendiri diluar kromosom dan tidak mengandung gen-gen esensial.
Jumlah plasmid di dalam sel berbeda-beda, tergantung spesies organismenya.
Plasmid pBR322 merupakan contoh plasmid yang digunakan sebagai vektor kloning.
Plasmid pBR322 mengandung gen penyandi resistensi terhadap ampisilin dan
tetrasiklin. Adanya gen resistensi terhadap antibiotik yang di dalamnya mengandung situs
enzim restriksi yang akan memudahan dalam menyeleksi plasmid rekombinan, dengan
adanya enzim yang hanya memotong bagian gen yang resistens terhadap antibiotik.
Misalnya, enzim BamHI yang akan memotong plasmid pBR322 pada bagian gen yang
resistensi terhadap tetrasiklin (gen TetR). Proses pemotongan plasmid bukanlah sesuatu yang
mudah. Ada dua kemungkinan setelah pemotongan, yaitu:
1). Plasmid pBR322 yang tersambung kembali membentuk lingkaran seperti semula, dan
2). Plasmid rekombinan yaitu plasmid pBR322 yang telah disisipi dengan DNA asing.
Plasmid pBR322 yang telah kehilangan bagian yang resistensi terhadap tetrasiklin
kemudian disisipi dengan fragmen dari DNA asing. Plasmid pBR322 ini kemudian dimasukkan
ke dalam sel inangnya yaitu E. coli. Pengujian lebih lanjut apakah plasmid ini telah tersisipi
oleh fragmen DNA asing atau tidak adalah dengan mendedahkannya pada medium ampisilin,
untuk kemudian memplatingnya ke dalam medium tetrasiklin dan ampisilin. Koloni E. coli
yang telah kehilangan marker tetrasiklin akan sensitif tetrasiklin, sedangkan pada medium
ampisilin, koloni ini tetap tumbuh karena masih resistensi ampisilin.
Block 7 Genetic and Molecular Biology | softfile edition | Editor : wiki
1
Synthetic Medicine with Microorganism
Block 7 Genetic and Molecular Biology | softfile edition | Editor : wiki
1
Synthetic Medicine with Microorganism
Rekayasa genetika telah diizinkan
Isolasi jumlah besar protein murni:
Insulin, hormon pertumbuhan, folliclestimulating hormon, serta protein lainnya,
kini tersedia sebagai produk rekombinan.
Dokter tidak lagi harus bergantung pada
produk-produk biologi kemurnian rendah dan
aktivitas spesifik dari persiapan batch
konsisten untuk mengobati pasien mereka.
PART C
Studi Kasus: Penggunaan DNA rekombinan untuk Menghasilkan Insulin Manusia
Block 7 Genetic and Molecular Biology | softfile edition | Editor : wiki
1
Synthetic Medicine with Microorganism
Mengapa mensintesis insulin manusia?
-
Sistem kekebalan tubuh pasien 'tidak menghasilkan antibodi terhadap insulin manusia
seperti yang mereka lakukan dengan insulin sapi atau babi
-
Perlunya metode yang lebih handal dan berkelanjutan untuk memperoleh produk
Gen insulin terdapat di kromosom 11 dengan ukuran yang cukup kecil. Ada 2 rantai yaitu
rantai A dengan 21 asam amino dan lainnya yaitu rantai B dengan 30 asam amino. Dua rantai
terhububung oleh ikatan disulfida.
Block 7 Genetic and Molecular Biology | softfile edition | Editor : wiki
1
Synthetic Medicine with Microorganism
Gambar di atas adalah struktur pro insulin. Terjadi ikatan antara rantai A dan B oleh
ikatan disulfide. Kemudian terjadilah proteolytic cleavage (pemotongan) sehingga
menghasilkan insulin yang aktif.
mRNA insulin hanya terdapat di pancreas. Setelah mRNA yang terdapat di pancreas
diambil, kemudian diubah menjadi DNA rantai ganda, kita masukkan DNA tersebut ke dalam
suatu vektor yaitu plasmid. Lalu plasmid dimasukkan ke dalam E.Coli dan nantinya akan
menghasilkan mRNA yang akan memproduksi insulin dalam jumlah banyak.
Penemuan Insulin manusia (Humulin) merupakan produk farmasi pertama untuk DNA
rekombinan oleh Eli Lilly yaitu pada tahun 1986.
24 aaSignal peptide leader telah ditambahkan ke dalam ujung 5 '. Lalu sekresi insulin
ke medium bukan retensi di dalamnya badan inklusi (Melepaskan pemimpin Sinyal sebagai
insulin diangkut melintasi membran sel). Rantai Adisintesis di salah satu strain E. Coli. Rantai B
disintesis dalam E. coli strain yang berbeda. Rantai yang dimurnikan secara terpisah kemudian
bergabung bersama-sama. Menggunakan teknik Continuous culture.
Human Growth Hormone (HGH) (somatotropin)
HGH mendorong pertumbuhan tubuh secara keseluruhan dengan meningkatkan
pengambilan asam amino oleh sel, sintesis protein dan lemak untuk energi pemanfaatan.
Kurangnya produksi HGH oleh kelenjar pituitari = dwarfisme
-
Wajah chubby
-
"Baby fat" di sekitar pinggang
-
Sifat tubuh yang tidak biasa sebagai orang dewasa, hanya 4 meter.
-
IQ = Normal
HGH membantu anak-anak mencapai tinggi berukuran normal.
Block 7 Genetic and Molecular Biology | softfile edition | Editor : wiki
1
Synthetic Medicine with Microorganism
Block 7 Genetic and Molecular Biology | softfile edition | Editor : wiki
1
Synthetic Medicine with Microorganism
Block 7 Genetic and Molecular Biology | softfile edition | Editor : wiki
1