PRODUKSI DAN PEMURNIAN ENZIM PEKTINASE
advertisement
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga PRODUKSI DAN PEMURNIAN ENZIM PEKTINASE (POLIGALAKTURONASE) DARI BAKTERI Pseudomonas stutzeri SKRIPSI NUR ROHISHOH DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI UNIVERSITAS AIRLANGGA 2012 Skripsi Produksi dan Pemurnian Enzim Pektinase (Poligalakturonase) dari Bakteri Pseudomonas stutzeri Nur Rohishoh ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga PRODUKSI DAN PEMURNIAN ENZIM PEKTINASE (POLIGALAKTURONASE) DARI BAKTERI Pseudomonas stutzeri SKRIPSI Sebagai Salah Satu Syarat untuk Memperoleh Gelar Sarjana Sains Bidang Kimia Pada Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Airlangga Disetujui oleh: Pembimbing I Pembimbing II Prof. Dr. Ni Nyoman Tri Puspaningsih, M.Si NIP. 19630615 198701 2 001 Dr. Endang Dewi Masithah, Ir., MP NIP. 19690912 199702 2 001 ii Skripsi Produksi dan Pemurnian Enzim Pektinase (Poligalakturonase) dari Bakteri Pseudomonas stutzeri Nur Rohishoh ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga HALAMAN PENGESAHAN NASKAH SKRIPSI Judul Penyusun NIM Tanggal ujian : Produksi dan Pemurnian Enzim Pektinase (Poligalakturonase) dari Bakteri Pseudomonas stutzeri : Nur Rohishoh : 080810123 : 16 Juli 2012 Disetujui oleh : Pembimbing I Pembimbing II Prof. Dr. Ni Nyoman Tri Puspaningsih, M.Si NIP. 19630615 198701 2 001 Dr. Endang Dewi Masithah, Ir., MP NIP. 19690912 199702 2 001 Mengetahui : Ketua Departemen Kimia Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Airlangga Dr. Alfinda Novi Kristanti, DEA NIP. 19671115 199102 2 001 iii Skripsi Produksi dan Pemurnian Enzim Pektinase (Poligalakturonase) dari Bakteri Pseudomonas stutzeri Nur Rohishoh ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga PEDOMAN PENGGUNAAN SKRIPSI Skripsi ini tidak dipublikasikan, namun tersedia di perpustakaan dalam lingkungan Universitas Airlangga, diperkenankan untuk dipakai sebagai referensi kepustakaan, tetapi pengutipan harus seizin penulis dan harus menyebutkan sumbernya sesuai kebiasaan ilmiah. Dokumen skripsi ini merupakan hak milik Universitas Airlangga. iv Skripsi Produksi dan Pemurnian Enzim Pektinase (Poligalakturonase) dari Bakteri Pseudomonas stutzeri Nur Rohishoh ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga KATA PENGANTAR Puji syukur kehadirat Allah SWT atas segala rahmat dan hidayah-Nya, sehingga penulis dapat menyelesaikan naskah skripsi dengan judul “Produksi dan Pemurnian Enzim Pektinase (Poligalakturonase) dari Bakteri Pseudomonas stutzeri” yang disusun sebagai syarat akademis untuk memperoleh gelar sarjana di Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Airlangga. Penulisan naskah skripsi ini tidak lepas dari bantuan dan dukungan dari berbagai pihak. Oleh karena itu, penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada: 1. Ibu Prof. Dr. Ni Nyoman Tri Puspaningsih, M.Si selaku dosen pembimbing I dan Ibu Dr. Endang Dewi Masithah, Ir., MP selaku pembingbing II yang telah meluangkan waktunya untuk memberikan bimbingan, masukan dan saran kepada penulis dalam penyusunan skripsi ini. 2. Ibu Dr. Afaf Baktir, MS selaku dosen penguji I dan bapak Drs. Hamami, M.Si selaku dosen penguji II atas masukan dan saran yang telah diberikan dalam perbaikan skripsi ini. 3. Ibu Dr. Alfinda Novi Kristanti, DEA selaku Ketua Departemen Kimia yang senantiasa memberikan motivasi kepada penulis. 4. Ibu Dra. Usreg Sri Handajani, M.Si selaku dosen wali atas bimbingan dan motivasi yang telah diberikan. 5. Seluruh dosen pengajar Program Studi S1 Kimia atas segala ilmu yang telah diberikan. 6. Bapak, ibu dan adik-adikku yang selalu memberikan dukungan, semangat dan doa kepada penulis selama menempuh pendidikan di Universitas Airlangga v Skripsi Produksi dan Pemurnian Enzim Pektinase (Poligalakturonase) dari Bakteri Pseudomonas stutzeri Nur Rohishoh ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga 7. Teman–teman angkatan 2008 dan semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu persatu yang selalu memberikan semangat kepada penulis dalam menyelesaikan skripsi ini. Penulis menyadari bahwa masih terdapat banyak kekurangan dalam penyusunan naskah skripsi ini. Oleh karena itu, penulis mengharapkan kritik dan saran yang bersifat membangun untuk kesempurnaan skripsi ini. Semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi semua pihak. Surabaya, Juli 2012 Penulis, Nur Rohishoh vi Skripsi Produksi dan Pemurnian Enzim Pektinase (Poligalakturonase) dari Bakteri Pseudomonas stutzeri Nur Rohishoh ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga Rohishoh, Nur, 2012, Produksi dan Pemurnian Enzim Pektinase (Poligalakturonase) dari Bakteri Pseudomonas stutzeri, Skripsi ini di bawah bimbingan Prof. Dr. Ni Nyoman Tri Puspaningsih, M.Si dan Dr. Endang Dewi Masithah, Ir., MP, Departemen Kimia, Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Airlangga, Surabaya. ABSTRAK Telah dilakukan produksi dan pemurnian enzim pektinase khususnya poligalakturonase dari bakteri Pseudomonas stutzeri. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui tingkat kemurnian enzim pektinase dan mengetahui berat molekul enzim pektinase melalui analisis SDS-PAGE. Proses pemurnian enzim diawali dengan pengendapan ammonium sulfat 70% dan diikuti dengan proses dialisis untuk menghilangkan sisa-sisa ammonium sulfat. Selanjutnya dilakukan kromatografi penukar anion dengan matriks DEAE Toyopearl 650 M, untuk memisahkan protein enzim berdasarkan muatannya. Enzim dielusi dengan larutan NaCl [0-1] M dalam buffer tris HCl pH 7 bergradien dari konsentrasi rendah ke tinggi. Hasil yang diperoleh menunjukkan terjadi peningkatan kemurnian enzim setelah dilakukan kromatografi penukar anion sebesar 77,7 kali dibandingkan ekstrak kasarnya. Hasil pemurnian enzim pektinase selanjutnya dikonfirmasi melalui analisis SDS-PAGE. Berdasarkan analisis SDS-PAGE, diperoleh 2 pita protein dengan berat molekul masing-masing pita yaitu 44,95 kDa dan 46,73 kDa. Kata kunci: pektinase, poligalakturonase, Pseudomonas stutzeri, kromatografi penukar anion, SDS-PAGE vii Skripsi Produksi dan Pemurnian Enzim Pektinase (Poligalakturonase) dari Bakteri Pseudomonas stutzeri Nur Rohishoh ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga Rohishoh, Nur, 2012, Production and Purification of Pectinase (Polygalacturonase) from Pseudomonas stutzeri, This final project is under the guidance of Prof. Dr. Ni Nyoman Tri Puspaningsih, M.Si and Dr. Endang Dewi Masithah, Ir., MP, Department of Chemistry, Faculty of Science and Technology, Airlangga University, Surabaya. ABSTRACT Polygalacturonase was one of types of pectinase from Pseudomonas stutzeri was partially purified by anion exchange chromatography. The objectives of this study are determining the purity level of pectinase and estimating the molecular weight of pectinase by SDS-PAGE analysis. The partial purification was started by 70% ammonium sulfate precipitation and followed by dialysis to remove the remains of ammonium sulfate. After that, the anion exchange chromatography with DEAE Toyopearl 650 M as matrix is used to separate the enzyme protein based on its anion. The enzyme was eluted with NaCl solution [0-1] M in Tris HCl buffer pH 7 from low to high concentration. The results of anion exchange chromatography indicated purification level 77.7 from crude extract. Based on SDS-PAGE analysis, the result of enzyme purification by anion exchange chromatography obtained two protein bands with molecular weight of protein bands are 44.95 kDa and 46.73 kDa. Keywords: pectinase, polygalacturonase, Pseudomonas stutzeri, anion exchange chromatography, SDS-PAGE viii Skripsi Produksi dan Pemurnian Enzim Pektinase (Poligalakturonase) dari Bakteri Pseudomonas stutzeri Nur Rohishoh ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga DAFTAR ISI HALAMAN JUDUL .................................................................................... HALAMAN PERNYATAAN ....................................................................... HALAMAN PENGESAHAN ....................................................................... LEMBAR PEDOMAN PENGGUNAAN SKRIPSI..................................... KATA PENGANTAR................................................................................... ABSTRAK .................................................................................................... ABSTRACT .................................................................................................. DAFTAR ISI ................................................................................................. DAFTAR GAMBAR..................................................................................... DAFTAR TABEL ......................................................................................... DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................. i ii iii iv v vii viii ix xi xiii xiv BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Masalah ............................................................... 1.2 Rumusan Masalah......................................................................... 1.3 Tujuan Penelitian .......................................................................... 1.4 Manfaat Penelitian ........................................................................ 1 5 5 5 BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Enzim .......................................................................................... 2.1.1 Mekanisme kerja enzim ...................................................... 2.1.2 Aktivitas enzim ................................................................... 2.1.2.1 Konsentrasi enzim.................................................... 2.1.2.2 Konsentrasi substrat ................................................. 2.1.2.3 Pengaruh suhu.......................................................... 2.1.2.4 Pengaruh pH ............................................................ 2.2 Pektin........................................................................................... 2.3 Enzim Pektinase........................................................................... 2.4 Pseudomonas stutzeri................................................................... 2.5 Pemurnian Enzim......................................................................... 2.5.1 Pemekatan enzim ............................................................... 2.5.2 Kromatografi kolom........................................................... 2.5.2.1 Kromatografi filtrasi gel........................................... 2.5.2.2 Kromatografi penukar ion ........................................ 2.5.2.3 Kromatografi afinitas ............................................... 2.5.2.4 Kromatografi interaksi hidrofobik ............................ 2.6 SDS-PAGE .................................................................................. 7 8 11 11 11 12 13 13 15 17 19 20 22 23 23 25 25 26 BAB III METODE PENELITIAN 3.1 Tempat dan Waktu Penelitian ....................................................... 3.2 Sampel, Bahan, dan Alat Penelitian .............................................. 3.2.1 Sampel penelitian ............................................................... 3.2.2 Bahan penelitian................................................................. 28 28 28 28 ix Skripsi Produksi dan Pemurnian Enzim Pektinase (Poligalakturonase) dari Bakteri Pseudomonas stutzeri Nur Rohishoh ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga 3.2.3 Alat penelitian .................................................................... 3.3 Prosedur Kerja.............................................................................. 3.3.1 Diagram alir penelitian........................................................ 3.3.2 Pembuatan media ................................................................ 3.3.2.1 Media padat ............................................................. 3.3.2.2 Media cair................................................................ 3.3.3 Kultivasi bakteri Pseudomonas stutzeri .............................. 3.3.4 Produksi enzim pektinase ................................................... 3.3.5 Uji aktivitas enzim pektinase .............................................. 3.3.6 Penentuan kadar protein ..................................................... 3.3.7 Pemurnian enzim pektinase ................................................ 3.3.7.1 Pengendapan dengan amonium sulfat ..................... 3.3.7.2 Dialisis ................................................................... 3.3.7.3 Pemurnian enzim pektinase dengan kromatografi penukar anion ......................................................... 3.3.8 Analisis SDS-PAGE........................................................... BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Hasil Produksi Enzim Pektinase dari Pseudomonas stutzeri.......... 4.2 Uji Aktivitas Enzim Pektinase ...................................................... 4.3 Uji Kadar Protein.......................................................................... 4.4 Hasil Pemurnian Enzim Pektinase ................................................ 4.4.1 Hasil pengendapan enzim pektinase dengan amonium sulfat.................................................................................. 4.4.2 Hasil dialisis enzim pektinase ............................................. 4.4.3 Hasil pemurnian enzim pektinase dengan kromatografi penukar anion .................................................................... 4.5 Hasil Analisis SDS-PAGE............................................................ 29 30 30 31 31 31 31 32 32 33 34 34 35 36 36 38 39 41 42 42 44 46 49 BAB V KESIMPULAN DAN SARAN 5.1 Kesimpulan .................................................................................. 53 4.2 Saran ............................................................................................ 53 DAFTAR PUSTAKA.................................................................................... 54 LAMPIRAN x Skripsi Produksi dan Pemurnian Enzim Pektinase (Poligalakturonase) dari Bakteri Pseudomonas stutzeri Nur Rohishoh ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga DAFTAR GAMBAR Nomor Judul Gambar Halaman 2.1 Model interaksi enzim substrat Lock and Key ............................ 10 2.2 Model interaksi enzim substrat Induced Fit. .............................. 10 2.3 Pengaruh konsentrasi enzim terhadap laju reaksi. ...................... 11 2.4 Pengaruh konsentrasi substrat terhadap laju reaksi..................... 12 2.5 Pengaruh suhu terhadap laju reaksi............................................ 13 2.6 Pengaruh pH terhadap laju reaksi .............................................. 13 2.7 Struktur molekul pektin ............................................................. 14 2.8 Mekanisme kerja enzim pektinase: pektin metil esterase (PME), pektin liase (PL), poligalakturonase (PG), dan pektat liase (PAL) ........................................................................................ 17 2.9 Uji pewarnaan gram negatif Pseudomonas stutzeri .................... 18 2.10 Pemisahan dengan dialisis ......................................................... 22 2.11 Kromatografi filtrasi gel ............................................................ 23 2.12 Kromatografi penukar ion (a); matriks penukar kation dan anion (b).................................................................................... 24 2.13 Kromatografi afinitas................................................................. 25 2.14 Teknik SDS-PAGE.................................................................... 27 3.1 Diagram alir penelitian ............................................................. 30 4.1 Isolat bakteri penghasil enzim pektinase .................................... 38 4.2 Hasil isolasi enzim pektinase, sebelum disentrifugasi (a) dan sesudah disentrifugasi (b) .......................................................... 39 Reaksi reduksi asam 3,5-dinitrosalisilat menjadi asam 3-amino5-nitrosalisilat............................................................................ 39 . 4.3 xi Skripsi Produksi dan Pemurnian Enzim Pektinase (Poligalakturonase) dari Bakteri Pseudomonas stutzeri Nur Rohishoh ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga 4.4 Optimasi pengendapan ekstrak kasar enzim pektinase dengan amonium sulfat.......................................................................... 44 4.5 Profil elusi enzim pektinase dengan kromatografi penukar anion 47 4.6 Hasil analisis SDS-PAGE; marker protein (M), ekstrak kasar enzim (CE), pengendapan dengan ammonium sulfat (AS), dialisis (D), dan 51 fraksi ke-18 kromatografi penukar anion ................................... xii Skripsi Produksi dan Pemurnian Enzim Pektinase (Poligalakturonase) dari Bakteri Pseudomonas stutzeri Nur Rohishoh ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga DAFTAR TABEL Nomor 4.1 Judul Tabel Halaman Pemurnian enzim pektinase (poligalakturonase) ........................ 48 xiii Skripsi Produksi dan Pemurnian Enzim Pektinase (Poligalakturonase) dari Bakteri Pseudomonas stutzeri Nur Rohishoh ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga DAFTAR LAMPIRAN Nomor Judul Lampiran 1 Pembuatan reagen 2 Pembuatan kurva standar asam galakturonat 3 Pembuatan kurva standar BSA (Bovine Serum Albumin) 4 Penentuan aktivitas poligalakturonase dengan metode DNS 5 Perhitungan kadar protein 6 Data optimasi pengendapan enzim dengan (NH4)2SO4 7 Hasil elusi kromatografi penukar anion 8 Pembuatan buffer sampel dan gel SDS-PAGE 9 Penentuan berat molekul relatif (Mr) protein enzim xiv Skripsi Produksi dan Pemurnian Enzim Pektinase (Poligalakturonase) dari Bakteri Pseudomonas stutzeri Nur Rohishoh ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga 1 BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Masalah Pengetahuan dan penggunaan enzim dalam berbagai bidang saat ini telah mengalami perkembangan yang sangat pesat. Enzim berfungsi sebagai katalis untuk proses biokimia yang terjadi di dalam maupun di luar sel. Melalui aktivitas katalitiknya, enzim mampu mempercepat reaksi 108 sampai 1011 kali lebih cepat dibandingkan dengan reaksi tanpa katalis (Poedjiadi, 1994). Hal ini menjadi salah satu alasan enzim banyak digunakan sebagai katalis pada laboratorium dan industri. Pektinase merupakan salah satu jenis enzim yang luas penggunaannya dalam bidang industri dan lapangan ilmu pengetahuan lainnya. Fakta menyebutkan bahwa 25% enzim pangan dunia yang digunakan dalam proses industri adalah pektinase (Tari et al., 2008). Enzim pendegradasi pektin ini digunakan dalam proses industri pangan khususnya industri sari buah-buahan dan sayuran, yang fungsinya antara lain untuk menjernihkan sari buah, menurunkan kekentalan, memudahkan penyaringan, mempercepat pengendapan sedimen, mempertahankan tekstur dan penampakan produk akhir, mencegah presipitasi pektin selama penyimpanan, dan meningkatkan efisiensi ekstraksi sari buah (Alkorta et al., 1998). Enzim pektinase dapat dihasilkan secara alami oleh bebarapa tanaman dan mikroba. Enzim pektinase yang diproduksi secara komersial umumnya dihasilkan 1 Skripsi Produksi dan Pemurnian Enzim Pektinase (Poligalakturonase) dari Bakteri Pseudomonas stutzeri Nur Rohishoh ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga 2 oleh mikroba. Hal tersebut disebabkan karena enzim dari mikroba memiliki kelebihan, di antaranya biaya produksi relatif ringan, dapat diproduksi dalam jumlah besar dan dalam waktu yang singkat, serta produktivitasnya lebih mudah ditingkatkan (Stanbury and Whitaker, 1995). Langkah pertama dalam pengembangan proses produksi enzim pektinase adalah mencari galur mikroba yang produktif menghasilkan enzim pektinase. Banyak penelitian sebelumnya menyebutkan bahwa spesies Aspergillus dan Rhizopus merupakan galur mikroba produktif dari jenis kapang yang menghasilkan enzim pektinase komersial dengan aktivitas pektinolitik tinggi dalam skala industri (Fawole and Odunfa, 2003). Tidak hanya dari jenis kapang, enzim pektinase juga banyak dihasilkan dari berbagai jenis bakteri seperti dari genus Pseudomonas dan Bacillus (Kobayashi et al., 2000). Beberapa jenis bakteri pektinolitik dapat diisolasi dari perairan tambak, di antaranya yaitu Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas pseudomallei, Pseudomonas fluorescens, Bacillus sp., Micrococcus sp., dan Flavobacterium sp. Bakteribakteri tersebut merupakan pengendali hayati dari pertumbuhan Microcystis aeruginosa yang merupakan alga pengganggu perairan tambak di mana dinding selnya sebagian besar tersusun atas pektin. Bakteri pektinolitik tersebut bekerja melalui aktivitas enzim ekstaseluler yang dihasilkan dari sel-sel bakteri untuk mendegradasi molekul pektin penyusun dinding sel Microcystis aeruginosa. Hal ini dibuktikan dengan penambahan ekstrak kasar enzim pektinase yang diproduksi dari isolat bakteri perairan tambak ke dalam kultur murni Microcystis aeruginosa Skripsi Produksi dan Pemurnian Enzim Pektinase (Poligalakturonase) dari Bakteri Pseudomonas stutzeri Nur Rohishoh ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga 3 dan terjadi penurunan kepadatan populasi Microcystis aeruginosa secara eksponensial hingga hari ke-14 (Masithah, 2008). Bakteri dengan genus Pseudomonas dipilih pada penelitian ini karena berdasarkan hasil penelitian Masithah (2008) menunjukkan bahwa isolat terbesar dari perairan tambak yaitu bakteri Pseudomonas sekitar 70-90% dan mempunyai aktivitas pektinase yang tinggi. Salah satu dari jenis bakteri tersebut yaitu Pseudomonas stutzeri. Bakteri jenis ini banyak ditemukan dalam perairan tambak udang dan lele dengan jumlah sekitar 97,81% (Rahardja, 2010). Bakteri Pseudomonas mampu menghasilkan enzim pektinase dengan jenis poligalakturonase (PG, EC 3.2.1.15), pektat liase (PAL, EC 4.2.2.2), dan pektin liase (PL, EC 4.2.2.10) (Masithah, 2008). Poligalakturonase mendegradasi asam poligalakturonat (poligalakturonat acid) yaitu pektin dengan derajat esterfikasi yang sangat tinggi (lebih dari 50%) atau disebut juga dengan asam pektinat. Poligalakturonase bekerja dengan memutus ikatan α-1,4 glikosidik pada rantai asam poligalakturonat secara hidrolisis (Ortega et al., 2004). Pektin liase mendegradasi pektin dengan derajat esterfikasi yang cukup tinggi (50%) sedangkan pektat liase mendegradasi pektin yang dengan derajat esterfikasi rendah atau yang tidak teresterfikasi. Pektin liase dan pektat liase bekerja dengan memutus ikatan α-1,4 glikosidik pada pektin melalui reaksi β-eliminasi (Mayans et al., 1997). Dari ketiga jenis enzim pektinase yang dihasilkan oleh isolat bakteri perairan tambak, poligalakturonase memiliki aktivitas tertinggi pada pH rendah (4-6). Poligalakturonase menunjukkan aktivitasnya dalam mendegradasi pektin Skripsi Produksi dan Pemurnian Enzim Pektinase (Poligalakturonase) dari Bakteri Pseudomonas stutzeri Nur Rohishoh ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga 4 lebih cepat dibanding dengan pektat liase dan pektin liase. Berdasarkan hasil karakterisasi, waktu inkubasi poligalakturonase lebih pendek (45 menit) dibanding dengan pektin liase (60 menit) dan pektat liase (90 menit). Sehingga produk yang dihasilkan lebih cepat melalui degradasi oleh poligalakturonase (Masithah, 2008). Ekstrak kasar enzim pektinase yang diproduksi dari berbagai isolat bakteri memiliki aktivitas yang sangat rendah. Hal ini disebabkan di dalam ekstrak kasar enzim masih mengandung beberapa protein maupun kontaminan selain protein target. Aktivitas spesifik dari suatu enzim dapat meningkat setelah dilakukan berbagai tahapan pemurnian enzim melalui pengendapan enzim dan serangkaian kromatografi kolom (Stryer, 2002). Aktivitas spesifik poligalakturonase meningkat 18,64 kali setelah pemurnian dengan kromatografi penukar anion (Yadav et al., 2008), 54,9 kali setelah pemurnian menggunakan kromatografi kolom afinitas Sephadex G-100 (Jacob et al., 2008), dan 61 hingga 3200 kali setelah pemurnian dengan kromatografi kolom afinitas Sepharose (Shen et al., 1995). Pada penelitian sebelumnya telah berhasil dilakukan isolasi dan karakterisasi enzim pektinase dari isolat bakteri perairan tambak yang meliputi pH optimum, suhu optimum, dan waktu inkubasi optimum (Masithah, 2008). Namun yang diperoleh masih dalam bentuk ekstrak kasarnya. Untuk meningkatkan aktivitas spesifik enzim pektinase khususnya poligalakturonase perlu dilakukan pemisahan dan pemurnian enzim. Tahap awal pemurnian ini Skripsi Produksi dan Pemurnian Enzim Pektinase (Poligalakturonase) dari Bakteri Pseudomonas stutzeri Nur Rohishoh ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga 5 dilakukan dengan pengendapan enzim menggunakan ammonium sulfat optimum, selanjutnya dilakukan dialisis dan kromatografi penukar anion. 1.2 Rumusan Masalah Berdasarkan latar belakang yang telah diuraikan, maka dapat dirumuskan permasalahan sebagai berikut : a. Bagaimanakah tingkat kemurnian enzim pektinase (poligalakturonase) yang diisolasi dari bakteri Pseudomonas stutzeri setelah dilakukan pemurnian dengan pengendapan ammonium sulfat, dialisis, dan kromatografi penukar anion? b. Berapakah perkiraan berat molekul enzim pektinase (poligalakturonase) dari bakteri Pseudomonas stutzeri? 1.3 Tujuan Penelitian Tujuan dari penelitian ini adalah : a. Mengetahui tingkat kemurnian enzim pektinase (poligalakturonase) yang diisolasi dari bakteri Pseudomonas stutzeri setelah dilakukan pemurnian dengan pengendapan ammonium sulfat, dialisis, dan kromatografi penukar anion. b. Memperkirakan berat molekul enzim pektinase (poligalakturonase) dari bakteri Pseudomonas stutzeri. Skripsi Produksi dan Pemurnian Enzim Pektinase (Poligalakturonase) dari Bakteri Pseudomonas stutzeri Nur Rohishoh ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga 6 1.4 Manfaat Penelitian Manfaat penelitian ini untuk memperoleh enzim pektinase (poligalakturonase) dengan tingkat kemurnian yang tinggi, sehingga dapat digunakan untuk perkembangan ilmu pengetahuan dan teknologi, serta dapat diaplikasikan dalam bidang industri yang memanfaatkan enzim pektinase. Skripsi Produksi dan Pemurnian Enzim Pektinase (Poligalakturonase) dari Bakteri Pseudomonas stutzeri Nur Rohishoh ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga 7 BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Enzim Enzim merupakan katalisator organik (biokatalisator) yang dihasilkan oleh sel hidup. Fungsi enzim yaitu mempercepat reaksi kimia 108 sampai 1011 di dalam maupun di luar sel dengan menurunkan energi aktivasi dan tanpa mengubah hasil akhir (produk). Enzim bekerja dengan urut-urutan yang teratur, mengkatalisis ratusan reaksi bertahap yang menguraikan molekul nutrien, reaksi yang menyimpan dan mengubah energi kimiawi, dan yang membuat makromolekul sel dari prekusor sederhana (Lehninger, 1993). Keunggulan enzim sebagai biokatalisator antara lain daya katalitik dan spesifitas yang tinggi, dapat bekerja pada kondisi suhu dan pH yang tidak eksterm, aktivitas katalitik beberapa enzim dapat dikendalikan dan dapat diproduksi sehingga memudahkan penyediaan (Stryer, 2002). Berdasarkan tempat digunakannya, enzim terdiri atas dua tipe yaitu enzim intraselular yang berfungsi di dalam sel dan enzim ekstraselular yang berfungsi di luar sel. Fungsi utama enzim intraselular adalah mensintesis bahan selular dan juga menguraikan nutrien untuk menyediakan energi yang dibutuhkan oleh sel. Sedangkan fungsi utama dari eksoenzim adalah melangsungkan terjadinya perubahan tertentu pada nutrien yang ada di sekitarnya sehingga memungkinkan nutrien tersebut memasuki sel (Pelczar dan Chan, 2007). Molekul-molekul enzim memiliki efisiensi yang tinggi dalam mempercepat reaksi pengubahan substrat 7 Skripsi Produksi dan Pemurnian Enzim Pektinase (Poligalakturonase) dari Bakteri Pseudomonas stutzeri Nur Rohishoh ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga 8 menjadi produk akhir. Namun, enzim bersifat tidak stabil, yakni aktivitasnya dapat berkurang atau rusak oleh berbagai faktor baik fisik maupun kimia. Molekul enzim adalah protein yang dihasilkan oleh sel hidup berupa protein globular yang terbentuk dari rantai polipeptida yang berlipat secara kompak. Konformasi tersier protein globular merupakan bentuk yang paling stabil karena ditunjang oleh berbagai ikatan yang menstabilkan struktur tersier protein. Jenis-jenis ikatan tersebut antara lain : ikatan hidrogen yang terdapat di antara gugus R residu asam amino rantai samping yang berdekatan, ikatan ion di antara gugus R yang berlawanan, interaksi hidrofobik dari gugus R asam amino hidrofobik dan ikatan kovalen berupa ikatan disulfida dari residu sistein (Ottoway dan Apps, 1984). 2.1.1 Mekanisme kerja enzim Mekanisme katalis enzim merupakan reaksi-reaksi yang melibatkan gugus-gugus fungsi dari residu asam amino yang terdapat pada sisi aktif enzim. Sebelum melakukan fungsi katalitiknya, enzim terlebih dahulu membentuk ikatan dengan substrat, seperti yang ditunjukkan oleh reaksi berikut: E+S kompleks ES EP E+P Setelah substrat terikat pada enzim, baru kemudian terjadi proses katalisis yaitu pembentukan ikatan kimia. Mengingat molekul enzim berukuran lebih besar daripada molekul substrat maka tidak seluruh bagian enzim dapat berhubungan dengan substrat. Hubungan antara substrat dengan enzim hanya terjadi pada bagian atau tempat yang disebut dengan sisi aktif (active site) (Poedjiaji, 1994). Skripsi Produksi dan Pemurnian Enzim Pektinase (Poligalakturonase) dari Bakteri Pseudomonas stutzeri Nur Rohishoh ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga 9 Ikatan yang terjadi antara enzim dan substrat merupakan ikatan yang lemah seperti ikatan elektrostatik, ikatan hidrogen, gaya Van Der Walls ataupun interaksi hidrofobik. Interaksi yang terjadi antara molekul enzim dan substrat melibatkan gugusan reaktif, baik dari enzim maupun dari substrat. Enzim hanya dapat mengikat substrat yang memiliki gugusan-gugusan reaktif yang sama. Gugusan reaktif enzim yang terlibat dalam pengikatan substrat disebut gugusangugusan pengikat (binding group). Proses katalitik melibatkan sejumlah gugusangugusan reaktif lain yang disebut gugusan katalitik (catalytic group). Gugusan tersebut terletak pada gugusan samping (Poedjiaji, 1994). Menurut Winarno (1990), ada dua model interaksi enzim substrat yaitu : 1. Model Lock and Key (lubang dan anak kunci) Model Lock and Key (lubang dan anak kunci) dikemukakan oleh Emil Fisher pada tahun 1890. Pada model ini, substrat harus mempunyai ukuran atau bentuk yang sesuai dengan sisi aktif enzim. Dalam model Fisher, tempat katalitik dianggap terbentuk terlebih dahulu agar sesuai dengan substratnya. Walaupun model Lock and Key ini merupakan model cetakan yang kaku, tetapi dapat dipakai untuk memahami sifat-sifat tertentu dari enzim, misalnya pengikatan secara berurutan dua atau lebih substrat atau kinetika suatu kurva kejenuhan substrat yang sederhana. 2. Model Induced Fit Daniel G. Koshland pada tahun 1958 mengemukakan bahwa ukuran atau bentuk sisi aktif enzim dapat mengalami modifikasi oleh adanya pengikatan substrat. Pada model ini, sisi aktif enzim diasumsikan cocok dengan Skripsi Produksi dan Pemurnian Enzim Pektinase (Poligalakturonase) dari Bakteri Pseudomonas stutzeri Nur Rohishoh ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga 10 substratnya sesaat setelah enzim mengikat substrat. Jadi substrat dianggap mampu menginduksi perubahan bentuk dalam sisi aktif enzim. Perubahan ini menempatkan residu asam amino pada sisi aktif enzim yang memungkinkan terjadinya pengikatan substrat selama proses katalisis. Gambar 2.1 Model interaksi enzim substrat Lock and Key (Stryer, 2002) Gambar 2.2 Model interaksi enzim substrat Induced Fit (Stryer, 2002) Struktur protein enzim dapat mempengaruhi aktivitas katalitik. Aktivitas katalitik enzim akan hilang bila terjadi denaturasi protein. Denaturasi protein adalah perubahan struktur protein yang menyebabkan hilangnya fungsi alamiah protein. Akibat yang ditimbulkan dari suatu denaturasi adalah hilangnya sifat Skripsi Produksi dan Pemurnian Enzim Pektinase (Poligalakturonase) dari Bakteri Pseudomonas stutzeri Nur Rohishoh ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga 11 biologis protein tersebut. Penyebab terjadunya denaturasi antara lain : kondisi pH ekstrem, suhu tinggi, dan pengaruh senyawa lain seperti detergen, pelarut organik, urea konsentrat, anion besar dari asam kuat dan ion chaotropic (I-, SCN-) (Ottoway dan Apps, 1984). 2.1.2 Aktivitas enzim Faktor-faktor yang mempengaruhi aktivitas enzim adalah konsentrasi enzim, konsentrasi substrat, suhu dan pH. 2.1.2.1 Konsentrasi enzim Kecepatan reaksi suatu enzim secara langsung dapat dipengaruhi oleh konsentrasi enzim. Jika konsentrasi enzim banyak, maka reaksi akan lebih cepat. Jika jumlah enzim dua kali lipat, maka kecepatan reaksi akan menjadi dua kali lipat. Jadi ada hubungan linier antara kecepatan reaksi enzim dengan jumlah enzim (Poedjiadi, 1994). Gambar 2.3 Pengaruh konsentrasi enzim terhadap laju reaksi (Poedjiadi, 1994) 2.1.2.2 Konsentrasi substrat Hasil eksperimen menunjukkan bahwa dengan konsentrasi enzim yang tetap, maka pertambahan konsentrasi substrat akan menaikkan kecepatan reaksi. Skripsi Produksi dan Pemurnian Enzim Pektinase (Poligalakturonase) dari Bakteri Pseudomonas stutzeri Nur Rohishoh ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga 12 Akan tetapi pada batas konsentrasi tertentu, tidak terjadi kenaikan kecepatan walaupun konsentrasi substrat diperbesar (Poedjiadi, 1994). Gambar 2.4 Pengaruh konsentrasi substrat terhadap laju reaksi (Poedjiadi, 1994) 2.1.2.3 Pengaruh suhu Reaksi yang menggunakan katalis enzim dipengaruhi oleh suhu. Pada suhu rendah reaksi berlangsung lambat, sedangkan pada suhu yang lebih tinggi reaksi berlangsung lebih cepat. Kenaikan suhu menyebabkan terjadinya proses denaturasi, maka bagian aktif enzim akan terganggu sehingga konsentrasi efektivitas enzim berkurang dan kecepatan reaksinya pun menurun. Kenaikan suhu sebelum terjadinya proses denaturasi dapat menaikkan kecepatan reaksi. Namun kenaikan suhu pada saat mulai terjadinya proses denaturasi akan mengurangi kecepatan reaksi. Oleh karena adanya dua pengaruh yang berlawanan, maka akan terjadi suatu titik optimum, yaitu suhu yang paling tepat bagi suatu reaksi yang menggunakan enzim tertentu (Poedjiadi, 1994). Skripsi Produksi dan Pemurnian Enzim Pektinase (Poligalakturonase) dari Bakteri Pseudomonas stutzeri Nur Rohishoh ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga 13 Gambar 2.5 Pengaruh suhu terhadap laju reaksi (Poedjiadi, 1994) 2.1.2.4 Pengaruh pH Enzim mempunyai pH tertentu yang pada pH tersebut aktivitas enzim optimum. Perubahan pH lingkungan berpengaruh terhadap efektivitas bagian aktif enzim dalam membentuk kompleks enzim substrat. pH yang rendah atau tinggi dapat menyebabkan terjadinya proses denaturasi dan mengakibatkan turunnya aktivitas enzim (Poedjiadi, 1994). Gambar 2.6 Pengaruh pH terhadap laju reaksi (Poedjiadi, 1994) 2.2 Pektin Pektin adalah komponen utama yang terdapat pada lamella tengah dan dinding sel primer tanaman (Alkorta et al., 1998). Pektin merupakan polisakarida Skripsi Produksi dan Pemurnian Enzim Pektinase (Poligalakturonase) dari Bakteri Pseudomonas stutzeri Nur Rohishoh ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga 14 yang tersusun atas residu asam D-galakturonat yang dihubungkan oleh ikatan α1,4 glikosidik (Quiroga et al., 2009). Menurut Nussinovitch (1997), komponen utama dari senyawa pektin tidak hanya asam D-galakturonat tetapi terdapat juga D-galaktosa, L-arabinosa, dan L-ramnosa dalam jumlah yang beragam dan terkadang terdapat gula lain dalam jumlah yang kecil. Beberapa gugus karboksilnya dapat teresterifikasi dengan metanol. Polimer asam galakturonat tersebut dapat berupa rantai lurus atau tidak bercabang. Gambar 2.7 Struktur molekul pektin (Alkorta et al., 1998) American Chemical Society telah menetapkan istilah baku untuk menyeragamkan pektin yang hingga kini masih dipakai (Nussinovitch, 1997), yaitu : 1. Substansi pektat merupakan kelompok zat turunan karbohidrat kompleks berbentuk koloid yang dihasilkan dari tumbuh-tumbuhan dan sebagian besar mengandung asam anhidrogalakturonat dalam suatu kombinasi turunannya menyerupai rantai. Gugus karboksil asam-asam poligalakturonat dapat teresterifikasi sebagian dengan gugus metil dan sebagian atau seluruhnya dapat dinetralkan oleh satu atau lebih jenis basa. 2. Protopektin adalah zat pektat yang tidak larut dalam air dan jika dihidrolisis menghasilkan asam pektinat atau pektin. Skripsi Produksi dan Pemurnian Enzim Pektinase (Poligalakturonase) dari Bakteri Pseudomonas stutzeri Nur Rohishoh ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga 15 3. Asam pektinat adalah istilah yang digunakan bagi asam poligalakturonat yang mengandung gugus metil ester dalam jumlah yang banyak (lebih dari 50%). Asam pektinat dalam keadaan yang sesuai mampu membentuk gel dengan ion-ion logam. 4. Pektin adalah istilah yang digunakan untuk asam-asam pektinat yang dapat larut dalam air dengan kandungan metil ester dan derajat netralisasi beragam dan dapat membentuk gel dengan asam dan gula pada kondisi yang sesuai. 5. Asam pektat adalah zat pektat yang seluruhnya tersusun dari asam poligalakturonat yang bebas dari gugus metil ester. 2.3 Enzim Pektinase Pektinase adalah enzim yang digunakan dalam degradasi molekul pektin (Jacob et al., 2008). Enzim pektinase dibagi menjadi tiga kelompok besar yaitu enzim yang melakukan deesterifikasi (pektinesterase), enzim yang melakukan depolimerisasi (hidrolase dan liase) dan protopektinase. Enzim deesterifikasi memotong ikatan ester antara gugus karboksil dari unit asam poligalakturonat dengan gugus metil. Enzim depolimerisasi membelah ikatan α-1,4 glikosidik pada senyawa pektin. Sedangkan protopektinase adalah enzim pektinase yang melarutkan protopektin (Alkorta et al., 1998). Berdasarkan cara kerjanya enzim depolimerisasi dibagi menjadi dua yaitu hidrolase dan liase. Hidrolase memotong ikatan α-1,4 glikosidik asam poligalakturonat dengan hidrolisis, sedangkan liase memotong ikatan α-1,4 glikosidik asam poligalakturonat dengan β-eliminasi pada posisi C(4) dan C(5). Skripsi Produksi dan Pemurnian Enzim Pektinase (Poligalakturonase) dari Bakteri Pseudomonas stutzeri Nur Rohishoh ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga 16 Pemecahan hidrolisa atau β-eliminasi dapat berlangsung secara acak (endo enzim) atau hanya memutus pada bagian ujung (ekso enzim) (Alkorta et al., 1998). Klasifikasi enzim pektinase berdasarkan mekanisme kerjanya pada molekul pektin, yaitu: pektinesterase atau pektin metilesterase (PME, EC 3.1.1.11), poligalakturonase (PG, EC 3.2.1.15), pektat liase (PAL, EC 4.2.2.2), dan pektin liase (PL, EC 4.2.2.10) (Debing et al., 2006). Pektinesterase atau pektin metilesterase (PME) merupakan enzim yang yang memutus ikatan antara gugus karboksil dengan gugus metil pada asam poligalakturonat teresterifikasi. Poligalakturonase (PG) merupakan golongan enzim hidrolase yaitu enzim yang menghidrolisis molekul pektin dengan derajat esterifikasi yang sangat tinggi dengan membuka ikatan α-1,4-glikosidik pada rantai asam poligalakturonat (Shen et al., 1995). Pektat liase (PAL) dan pektin liase (PL) merupakan enzim depolimerase yang memutus ikatan α-1,4-glikosidik pada asam poligalakturonat melalui mekanisme reaksi β-eliminasi menghasilkan oligogalakturonat dengan ikatan C4-C5 tak jenuh. Pektat liase bekerja pada pektin dengan derajat esterifikasi yang rendah atau tidak teresterifikasi dan memerlukan Ca2+ untuk meningkatkan aktivitasnya. Sedangkan pektin liase bekerja pada pektin dengan derajat esterifikasi yang cukup tinggi dan aktivitasnya tidak dipengaruhi oleh Ca2+ (Mayans et al., 1997). Skripsi Produksi dan Pemurnian Enzim Pektinase (Poligalakturonase) dari Bakteri Pseudomonas stutzeri Nur Rohishoh ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga 17 Gambar 2.8 Mekanisme kerja enzim pektinase: pektin metil esterase (PME), pektin liase (PL), poligalakturonase (PG), dan pektat liase (PAL) (Alkorta et al., 1998) 2.4 Pseudomonas stutzeri Pseudomonas stutzeri memiliki klasifikasi sebagai berikut: Skripsi Kingdom : Bacteria Filum : Proteobacteria Kelas : Gamma Proteobacteria Produksi dan Pemurnian Enzim Pektinase (Poligalakturonase) dari Bakteri Pseudomonas stutzeri Nur Rohishoh ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga 18 Ordo : Pseudomonadales Famili : Pseudomonadaceae Genus : Pseudomonas Spesies : Pseudomonas stutzeri Gambar 2.9 Uji pewarnaan gram negatif Pseudomonas stutzeri Pseudomonas stutzeri adalah bakteri gram negatif, berbentuk batang, dan memiliki flagel kutub tunggal. Bakteri ini berukuran 1-3 µm, berdiameter 0,5 µm, dan koloninya membentuk cakram. Pseudomonas stutzeri dapat ditemukan hampir di semua jenis perairan dan dapat tumbuh pada berbagai macam karbohidrat termasuk pati, pektin, dan maltosa. Bakteri ini biasanya hidup bersama-sama dengan bakteri Pseudomonas pseudomallei dalam habitatnya. Pada perairan tambak udang ditemukan sekitar 77% spesies Pseudomonas stutzeri dan 97,81% di perairan tambak lele dumbo (Rahardja, 2010). Hasil eksplorasi penelitian Herlina (2010) diketahui bahwa Pseudomonas stutzeri merupakan bakteri yang memiliki sifat proteolitik, amilolitik, pektinolitik, dan lipolitik. Selain itu, Pseudomonas stutzeri juga bersifat denitrifier (Van and Allen, 1995). Skripsi Produksi dan Pemurnian Enzim Pektinase (Poligalakturonase) dari Bakteri Pseudomonas stutzeri Nur Rohishoh ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga 19 2.5 Pemurnian Enzim Pemurnian bertujuan untuk memisahkan enzim yang diinginkan dari senyawa yang tidak dikehendaki. Tahap-tahap pemurnian tergantung dari tujuan akhir, apakah untuk tujuan komersial atau tujuan riset. Enzim yang kasar atau yang dimurnikan sebagian masih dapat dipakai untuk komersial, sedangkan enzim yang murni atau hampir murni digunakan dalam riset atau dipakai dalam produk analitik. Untuk tujuan riset, biasanya digunakan untuk mempelajari aktivitas enzim, struktur dan fungsinya. Jumlah dari protein yang telah dimurnikan tidak hanya bergantung pada material awal tetapi juga proses. Ada protein yang hilang pada setiap tahap pemurnian. Karena itu, untuk memaksimalkan proses diusahakan sesedikit mungkin tahap pemurnian yang digunakan (Harris dan Angal, 1993). Harris (1989) menyebutkan ada tiga strategi dalam pemurnian enzim yang harus diperhatikan : 1) kualitas ; perlu tindakan untuk mempertahanakan aktivitas protein dengan cara mengurangi proteolisis dan denaturasi, 2) kuantitas ; pemakaian akhir dari protein murni akan menentukan kualitas enzim yang diperlukan, 3) ekonomis merupakan kunci penting bila akan dipakai dalam industri atau diterapkan dalam skala laboratorium. Pemurnian protein dilakukan berdasarkan sifat kelarutan, ukuran, muatan afinitas pengikat spesifik dari protein itu sendiri. Oleh karena itu, campuran protein selanjutnya dipisahkan dengan berbagai seri pemisahan. Skripsi Produksi dan Pemurnian Enzim Pektinase (Poligalakturonase) dari Bakteri Pseudomonas stutzeri Nur Rohishoh ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga 20 2.5.1 Pemekatan enzim Pemekatan protein enzim merupakan tahap awal dari prosedur pemurnian enzim sebelum tahap pemurnian berikutnya atau dapat pula digunakan untuk keperluan analisis enzim (Harris, 1989). Pemekatan protein dapat dilakukan dengan dua metode, yaitu analitik dan preparatif (penyiapan). Metode analitik menggunakan pemekatan asam (asam trikloroasetat), pemekatan organik (aseton dan etanol), dan imunopresipitasi yang dapat menyebabkan denaturasi protein. Berbeda dengan metode analitik, metode preparatif tetap mempertahankan aktivitas protein. Pemekatan protein dengan metode preparatif misalnya pemekatan dengan garam, pemekatan dengan pelarut organik, pemekatan dengan polimer organik, ultrafiltrasi, dan dialisis (Bollag & Edelstein, 1991). Metode pemekatan protein enzim yang biasa dilakukan adalah dengan menggunakan garam ammonium sulfat dan pelarut organik aseton. Prinsip pemekatan dengan garam berdasarkan pada kelarutan protein yang berinteraksi polar dengan molekul air, interaksi ionik protein dengan garam, dan daya tolak menolak protein yang bermuatan sama. Kelarutan protein pada pH dan suhu tertentu meningkat pada kenaikan konsentrasi garam (salting in). Kenaikan kelarutan protein akan meningkatkan kekuatan ion larutan. Pada penambahan garam dengan konsentrasi tertentu kelarutan protein menurun (salting out). Molekul air yang berikatan dengan garam-garam semakin banyak yang menyebabkan penarikan selubung air yang mengelilingi permukaan protein. Peristiwa ini menyebabkan protein saling berinteraksi, beragregasi kemudian mengendap (Harris, 1989). Ammonium sulfat merupakan garam yang paling Skripsi Produksi dan Pemurnian Enzim Pektinase (Poligalakturonase) dari Bakteri Pseudomonas stutzeri Nur Rohishoh ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga 21 sering digunakan untuk mengendapkan protein karena memilki daya larut tinggi di dalam air, relatif tidak mahal, dan kestabilan protein di dalam larutan ammonium sulfat (2M-3M) tahan bertahun-tahun (Scopes, 1993). Pemekatan protein dengan menggunakan pelarut organik aseton berdasarkan pada pengurangan kelarutan protein dan konstanta dielektrika pelarut. Semakin banyak pelarut organik yang ditambahkan, semakin kurang daya solvasi air dan muatan pada permukaan molekul protein yang hidrofilik. Hal ini akan mengakibatkan molekul-molekul protein cenderung berinteraksi dengan sesamanya, hingga akhirnya protein mengendap. Prosedur pemekatan pelarut organik aseton dilakukan pada suhu di bawah 0oC. Pada suhu di atas 10oC, konformasi protein akan segera berubah yang memungkinkan molekul-molekul pelarut organik mendapatkan jalan masuk ke bagian dalam struktur protein, kemudian merusak interaksi hidrofobik dan akhirnya akan terjadi denaturasi (Harris, 1989; Scopes, 1993). Kelebihan garam yang terdapat dalam larutan enzim setelah tahap pemurnian dapat dihilangkan dengan cara dialisis, diafiltrasi, dan filtrasi gel. Pada tahap dialisis, protein ditempatkan di dalam kantung (membran) semipermeabel yang direndam di dalam larutan buffer tertentu. Molekul yang berukuran kecil akan keluar melalui membran, sedangkan molekul yang berukuran besar akan tertahan di dalam membran dialisis. Sedangkan diafiltrasi dilakukan dengan menggunakan air atau buffer yang ditambahkan ke dalam larutan protein, selanjutnya dikonsentrasikan dengan ultrafiltrasi sehingga prosesnya akan berjalan lebih cepat bila dibandingkan dengan dialisis. Skripsi Produksi dan Pemurnian Enzim Pektinase (Poligalakturonase) dari Bakteri Pseudomonas stutzeri Nur Rohishoh ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga 22 Tabung dialisis Larutan pekat Larutan buffer Gambar 2.10 Pemisahan dengan dialisis (Stryer,2002) Berbeda dengan dialisis dan diafiltrasi, penghilangan garam dengan filtrasi gel diterapkan untuk jumlah sampel yang sedikit, yaitu tidak melampaui 25-30% volume kolom untuk mendapatkan resolusi yang memadai antar protein dan garam. Pada umumnya matriks filtrasi gel yang biasa digunakan memiliki pori berukuran kecil, misalnya (Sephadex G-25) (Pharmacia). Kekurangan metode ini adalah terjadi pengenceran sampel protein. 2.5.2 Kromatografi kolom Kromatografi merupakanmetode utama dalam pemisahan senyawa organik yang mana senyawa tersebut terdistribusi di antara 2 fase, yaitu fase diam dan fase gerak. Fase gerak berupa pelarut dan molekul yang akan dipisahkan, sedangkan fase diam berupa padatan atau larutan yang mendukung padatan atau gel. Fase gerak bergerak kontinyu terhadap fase diam. Ada beberapa macam kromatografi kolom, antara lain kromatografi filtrasi gel, kromatografi penukar ion, kromatografi afinitas, kromatografi interaksi hidrofobik. Skripsi Produksi dan Pemurnian Enzim Pektinase (Poligalakturonase) dari Bakteri Pseudomonas stutzeri Nur Rohishoh ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga 23 2.5.2.1 Kromatografi filtrasi gel Kromatografi filtrasi gel merupakan teknik pemisahan protein dan makromolekul biologi lain berdasarkan ukuran molekul. Matriks filtrasi gel berupa gel yang berpori seperti dekstran, agarosa atau poliakrilamida. Contoh matriks komersial tersebut adalah Sepharose, Sephadex, dan Biogel, kemudian dikemas di dalam kolom dan dielusi dengan fase cair. Pori-pori matriks dapat menampung molekul berukuran lebih kecil. Molekul berukuran lebih kecil akan memasuki pori-pori matriks, namun molekul yang besar tidak terperangkap ke dalam pori kolom. Hasil yang dicapai adalah molekul besar akan keluar dari kolom lebih dulu dibanding molekul yang lebih kecil (Scopes, 1993). Polimer karbohidrat Molekul kecil melewati pori matriks Sampel protein Eksklusi molekul gel Molekul besar tertahan Gambar 2.11 Kromatografi filtrasi gel (Stryer,2002) 2.5.2.2 Kromatografi penukar ion Kromatografi penukar ion merupakan teknik pemisahan molekul-molekul ion polar yang didasarkan pada perbedaan muatan, yaitu antara molekul bermuatan di dalam larutan dengan senyawa yang tidak reaktif yang muatannya berlawanan sebagai pengisi kolom. Permukaan protein terdiri dari muatan positif dan negatif tergantung dari rantai samping asam amino asam atau basa. pH Skripsi Produksi dan Pemurnian Enzim Pektinase (Poligalakturonase) dari Bakteri Pseudomonas stutzeri Nur Rohishoh ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga 24 protein dengan jumlah muatan positif dan negatif sama disebut titik isoelektrik (pI). Titik isoelektrik sebagian besar protein di antara 5-9. Protein yang memiliki pH di atas pI akan bermuatan negatif, sedangkan pH di bawah pI akan bermuatan positif (Harris and Angal, 1993). Pengerjaan kromatografi penukar ion didahului dengan mengelusi protein enzim dengan pH buffer awal yang telah diatur. Protein diharapkan terikat kuat pada kolom dan protein lain dibiarkan terelusi terlebih dahulu. Protein yang terikat pada kolom dilepaskan dengan cara mengubah pH buffer atau kekuatan ion pelarut. Matriks penukar ion mengikat secara kovalen gugus fungsional yang bermuatan negatif pada penukar kation atau gugus fungsional yang bermuatan positif pada penukar anion. Matriks berupa polimer elastis dan mengandung senyawa resin sintetik terbuat dari bahan dekstran, selulosa atau sephadex. Contoh matriks penukar kation dan anion masing-masing adalah karboksimetil selulosa (CMC) dan dietilaminoetil (DEAE) selulosa (Scopes, 1993). Muatan positif berikatan dengan muatan negatif Muatan negatif keluar terlebih dahulu (a) (b) Gambar 2.12 Kromatografi penukar ion (a); matriks penukar kation dan anion (b) (Stryer,2002) Skripsi Produksi dan Pemurnian Enzim Pektinase (Poligalakturonase) dari Bakteri Pseudomonas stutzeri Nur Rohishoh ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga 25 2.5.2.3 Kromatografi afinitas Pemisahan protein dengan kromatografi afinitas berdasarkan interaksi spesifik di antara makromolekul biologi dengan pasangannya, sebagai contoh enzim dengan substrat atau inhibitor dan antibodi dengan antigen. Kromatografi afinitas menggunakan suatu ligan alami, yang secara khusus berinteraksi dengan protein yang diinginkan (Scopes, 1993). Ligan akan terikat secara kovalen pada matriks. Komponen protein yang memiliki afinitas spesifik terhadap ligan akan diserap, sedangkan komponen lainnya (protein kontaminan) yang tidak memiliki afinitas akan terelusi terlebih dahulu. Kompleks glukosa-protein menyerang residu glukosa Kompleks glukosa protein dibebaskan dari adisi glukosa Penambahan glukosa Gambar 2.13 Kromatografi afinitas (Stryer,2002) 2.5.2.4 Kromatografi interaksi hidrofobik Kromatografi interaksi hidrofobik banyak digunakan untuk pemisahan protein dan peptida. Pada kekuatan ion yang tinggi protein terikat kuat pada matriks melalui interaksi hidrofobik. Matriks bersifat nonpolar. Campuran protein dimasukkan ke dalam kolom dengan buffer konsentrasi garam tinggi. Setelah protein yang tidak terikat keluar terlebih dahulu, protein yang terikat dielusi dengan eluen yang polaritasnya diturunkan (konsentrasi garam lebih rendah) (O’Farrel, 1998). Kromatografi interaksi hidrofobik didasarkan pada gaya Van Skripsi Produksi dan Pemurnian Enzim Pektinase (Poligalakturonase) dari Bakteri Pseudomonas stutzeri Nur Rohishoh ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga 26 Der Waals antara protein dengan ligan yang terikat fasa diam yang dipengaruhi struktur air pada penambahan garam (Builder, 1993). 2.6 SDS – PAGE SDS-PAGE atau Elektroforesis gel poliakrilamida-sodium dodesil sulfat adalah teknik elektroforesis gel yang menggunakan poliakrilamida untuk memisahkan protein yang bermuatan berdasarkan berat molekulnya. Sodium Dodesil Sulfat (SDS) merupakan deterjen ionik yang dapat melarutkan molekul hidrofobik yang memberikan muatan negatif pada keseluruhan struktur protein. Cara kerja SDS-PAGE adalah dengan menghambat interaksi hidrofobik dan merusak ikatan hidrogen (Davis et al., 1994). Metode SDS-PAGE digunakan untuk memisahkan protein demi keperluan biokimia, genetika forensik, dan biologi molekuler (Boyer, 1993). Metode ini diawali dengan preparasi sampel untuk membuat sampel bermuatan sama sehingga muatan tidak memengaruhi pergerakan komponen sampel dalam gel. Preparasi dilakukan dengan cara mendenaturasi protein menggunakan SDS dan memutus ikatan disulfida pada struktur protein menggunakan beta-merkaptoetanol, bila perlu denaturasi didukung dengan memanaskan sampel. Selanjutnya gel poliakrilamida dibuat menggunakan cetakan gel membentuk lembaran segiempat dengan ketebalan tertentu. Setelah sampel dimasukkan dalam sumur gel, gel dialiri arus listrik sehingga komponen yang terdapat dalam sampel akan terpisah melewati matriks gel berdasarkan berat molekulnya (Davis et al., 1994). Skripsi Produksi dan Pemurnian Enzim Pektinase (Poligalakturonase) dari Bakteri Pseudomonas stutzeri Nur Rohishoh ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga 27 Untuk melihat pita komponen yang terbentuk, gel perlu diwarnai dengan pewarna khusus. Beberapa pewarna yang dapat digunakan dalam SDS-PAGE adalah Commasie Brilliat Blue dan Silver Salt Staining. Commasie Brilliant Blue mengikat protein secara spesifik dengan ikatan kovalen. Silver Salt Staining memiliki sifat lebih sensitif dan akurat namun membutuhkan proses yang lebih lama (Boyer, 1993). Campuran makromolekul Elektroforesis Pori-pori gel Gambar 2.14 Teknik SDS-PAGE (Stryer, 2002) Skripsi Produksi dan Pemurnian Enzim Pektinase (Poligalakturonase) dari Bakteri Pseudomonas stutzeri Nur Rohishoh ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga 28 BAB III METODE PENELITIAN 3.1 Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Kimia Organik dan Biokimia Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Airlangga. Waktu penelitian ini dimulai pada bulan Februari sampai dengan Juni 2012. 3.2 Sampel, Bahan, dan Alat Penelitian 3.2.1 Sampel Penelitian Sampel yang digunakan adalah isolat bakteri Pseudomonas stutzeri yang telah diisolasi dari perairan tambak yang mengalami blooming Microcystis aeruginosa di Gresik (Masithah, 2008). 3.2.2 Bahan Penelitian Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah bacto pepton, yeast extract, K2HPO4, CaCl2, MgSO4, Na2CO3, pektin, bacto agar, NaCl, substrat Polygalcturonic Acid (PGA-SIGMA), dinitrosalisilat, asam galakturonat, EDTA, HCl, NaOH, asam 3,5asam sitrat, Na2HPO4.7H2O, tris (hidroksimetil) aminometan, Bovine Serum Albumin (BSA), Coomassie brilliant blue G-250, etanol 96 %, asam fosfat 85%, DEAE-Toyopearl 650 M, metanol, asam asetat glasial, glisin, akuades, ammonium sulfat, ammonium persulfat (APS), sodium dodesil sulfat (SDS), N,N,N’,N’ tetrametil-etilendiamin (TEMED), akrilamid, bisakrilamid, marker protein LMW. 28 Skripsi Produksi dan Pemurnian Enzim Pektinase (Poligalakturonase) dari Bakteri Pseudomonas stutzeri Nur Rohishoh ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga 29 3.2.3 Alat Penelitian Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah labu Erlenmeyer 100 dan 250 ml, cawan petri, pipet mikro, autoclave (Ogawa Seiki, CO. LTD. Osk 6508), sentrifuge (Beckmann model TJ-6), shaker incubator (Heidolph Unimax 1010, Inkubator 1000), water bath (Sanyo Rikogaku-kikai), oven (Isotemp* oven model 655F), freezer, lemari es (Sharp matric), spektrofotometer UV-Vis (Shimadzu UV-1700), timbangan analitik (OHAUS), laminar air flow cabinet (Kottermann), pH meter (Metrohm 744), tabung Eppendorf, piranti elektroforesis Wealtec (Biorad), seperangkat alat kromatografi penukar ion, tabung selofan, dan alat-alat gelas yang biasa dipakai di laboratorium. Skripsi Produksi dan Pemurnian Enzim Pektinase (Poligalakturonase) dari Bakteri Pseudomonas stutzeri Nur Rohishoh ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga 30 3.3 Prosedur Kerja 3.3.1 Diagram alir penelitian Kultivasi isolat bakteri Pseudomonas stutzeri Produksi enzim pektinase dari bakteri Pseudomonas stutzeri Ekstrak kasar enzim pektinase Pengendapan dengan ammonium sulfat Penentuan Analisis : Uji aktivitas enzim aktivitas spesifik SDS-PAGE Dialisis Kromatografi penukar ion Gambar 3.1 Diagram alir penelitian Skripsi Produksi dan Pemurnian Enzim Pektinase (Poligalakturonase) dari Bakteri Pseudomonas stutzeri Nur Rohishoh ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga 31 3.3.2 Pembuatan media 3.3.2.1 Media padat Media padat terdiri dari 0,2 g bacto pepton, 0,2 g yeast extract, 0,1 g K2HPO4, 0,01 g CaCl2, 0,05 g MgSO4, 0,5 g Na2CO3, 1,0 g pektin, dan 1,5 g bacto agar. Semua bahan dilarutkan dengan 100 ml akuades dalam labu Erlenmeyer 250 ml. Kemudian labu Erlenmeyer ditutup dengan kapas dan alumunium foil lalu disterilkan dengan autoclave selama 45 menit pada suhu 121oC dan tekanan 1 atm. Setelah dikeluarkan dari autoclave campuran atau medium ditunggu sampai suam-suam kuku, lalu medium dituang ke dasar cawan petri dan dibiarkan sampai menjadi dingin dan memadat. 3.3.2.2 Media cair Media cair terdiri dari 0,2 g bacto pepton, 0,2 g yeast extract, 0,1 g K2HPO4, 0,01 g CaCl2, 0,05 g MgSO4, 0,5 g Na2CO3, dan 1,0 g pektin. Semua bahan dilarutkan dengan 100 ml akuades dalam labu Erlenmeyer 250 ml. Kemudian labu Erlenmeyer ditutup dengan kapas dan alumunium foil lalu disterilkan dengan autoclave selama 45 menit pada suhu 121oC dan tekanan 1 atm. 3.3.3 Kultivasi bakteri Pseudomonas stutzeri Bakteri Pseudomonas stutzeri asal isolat perairan tambak yang mengalami blooming Microcystis aeruginosa di Gresik dibiakkan dalam media padat yang mengandung pektin. Sebanyak satu ose koloni tunggal bakteri dipindahkan ke dalam media padat kemudian diinkubasi pada suhu kamar selama 24 jam. Selanjutnya dilakukan pengamatan adanya daerah bening (halo) di sekitar koloni Skripsi Produksi dan Pemurnian Enzim Pektinase (Poligalakturonase) dari Bakteri Pseudomonas stutzeri Nur Rohishoh ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga 32 kemudian dipilih salah satu isolat dengan daerah bening terbesar yang menunjukkan aktivitas pektinase tertinggi. Supaya zona bening yang terbentuk lebih jelas maka dilakukan pewarnaan pada media padat dengan Congo red. Bidang halo akan tampak berwarna kuning bening, sedangkan media berwarna merah kecoklatan. Selanjutnya koloni-koloni tunggal dari media pektin padat dibuat inokulum dengan cara memasukkan isolat bakteri ke dalam 20 ml media cair di Erlenmeyer 100 ml, diinkubasi pada suhu kamar selama 12 jam dengan kecepatan 150 rpm. 3.3.4 Produksi enzim pektinase Produksi enzim dilakukan dengan menumbuhkan 1% inokulum dalam 100 ml media pektin cair dan diinkubasi dengan shaker incubator pada suhu kamar dengan kecepatan 150 rpm. Panen dilakukan pada jam ke-12 dengan cara sentrifugasi 6000 rpm selama 15 menit, selanjutnya supernatan yang mengandung enzim pektinase diambil dan diuji aktivitasnya. 3.3.5 Uji aktivitas enzim pektinase Sebanyak 100 µL ekstrak enzim ditambah 100 µL substrat (1% asam poligalakturonat dalam buffer asetat pH 4,5) (Zheng et al., 2000), dimasukkan dalam tabung Ependorf dan diinkubasi dalam penangas air pada 40oC selama 30 menit. Sejumlah gula pereduksi yang terbentuk diukur aktivitas enzimnya menggunakan metode asam 3,5-dinitrosalisilat (DNS) yaitu dengan menambahkan 600 µL DNS ke dalam tabung, lalu dimasukkan dalam penangas air mendidih selama 15 menit bersama-sama dengan kontrol (mengandung 100 µL enzim ditambah 600 µL DNS dan 100 µL substrat tetapi tanpa inkubasi) Skripsi Produksi dan Pemurnian Enzim Pektinase (Poligalakturonase) dari Bakteri Pseudomonas stutzeri Nur Rohishoh ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga 33 kemudian didinginkan dalam air es selama 20 menit. Selanjutnya absorbansi diukur dengan Spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 546,5 nm dan dihitung aktivitasnya menggunakan persamaan berikut : Aktivitas enzim (unit/ml) = Keterangan : C = konsentrasi asam galakturonat T = waktu inkubasi Fp = faktor pengenceran BM asam galakturonat = 274 Sebagai standar digunakan asam galakturonat masing-masing dengan konsentrasi 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; dan 0,5 mg/ml. Sebanyak 1 ml larutan standar asam galakturonat ditambah dengan 3 ml larutan DNS dan dihomogenkan. Campuran kemudian dipanaskan dalam penangas air selama 15 menit dan didinginkan dalam air es selama 20 menit. Selanjutnya absorbansi diukur dengan Spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 546,5 nm. 3.3.6 Penentuan kadar protein Metode yang digunakan dalam menentukan kadar protein pada penelitian ini yaitu metode Bradford dengan menggunakan standar Bovine Serum Albumin (BSA). Langkah awal yang dilakukan yaitu menyiapkan reagen Bradford yang terdiri dari 50 mg Coomassie brilliant blue G-250 yang dilarutkan dalam 25 ml etanol 96%, kemudian ditambahkan 50 ml asam fosfat 85% dan diencerkan dengan akuades sampai volume 500 ml. Analisis sampel dilakukan dengan cara memasukkan 10 µL sampel dalam tabung Eppendorf kemudian ditambahkan Skripsi Produksi dan Pemurnian Enzim Pektinase (Poligalakturonase) dari Bakteri Pseudomonas stutzeri Nur Rohishoh ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga 34 akuades sampai volume 100 µL lalu ditambahkan reagen Bradford. Blanko yang digunakan terdiri dari 100 µL akuades dan 1 µL reagen Bradford. Setelah itu, larutan dihomogenkan dengan vortex kemudian absorbansi dibaca menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 595 nm. Standar BSA dibuat pada kisaran 100-500 µg/ml dari stok BSA dengan kadar 1 mg/ml. Dari stok tersebut dilakukan pengenceran dengan akuades untuk memperoleh konsentrasi yang diinginkan. Blanko yang digunakan adalah 100 µL akuades dan 1 ml reagen Bradford. Selanjutnya absorbansi dibaca menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 595 nm. 3.3.7 Pemurnian enzim pektinase Tahapan pemurnian enzim pektinase diawali dengan pemekatan pengendapan ammonium sulfat, dialisis menggunakan tabung selofan, dan selanjutnya dimurnikan kromatografi penukar anion menggunakan DEAEToyopearl 650 M (Tosoh, Jepang). Hasil pemurnian dianalisis dengan SDSPAGE. 3.3.7.1 Pengendapan dengan ammonium sulfat Tahapan awal pemurnian enzim adalah pemekatan garam. Ekstrak kasar enzim pektinase dari bakteri Pseudomonas stutzeri dengan berbagai prosentase kejenuhan ammonium sulfat untuk memperoleh kondisi optimum pengendapan pektinase. Prosentase kejenuhan ammonium sulfat yang digunakan dari 40-100%. Tabel kejenuhan ammonium sulfat yang digunakan berdasarkan Scopes (1993). Penentuan kadar kejenuhan ammonium sulfat yang optimum terlebih dahulu dilakukan dalam skala kecil di dalam ependorf. Sebanyak 1 ml ekstrak kasar Skripsi Produksi dan Pemurnian Enzim Pektinase (Poligalakturonase) dari Bakteri Pseudomonas stutzeri Nur Rohishoh ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga 35 enzim pektinase diendapkan dengan ammonium sulfat kemudian tabung dibolakbalik hingga garam larut dalam enzim pektinase. Selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 6000 rpm pada 4oC selama 20 menit. Setelah dilakukan sentrifugasi akan diperoleh endapan dan supernatan, endapan hasil sentrifugasi tersebut dilarutkan dalam buffer fosfat sitrat pH 7, kemudian diuji aktivitasnya. Setelah didapatkan kadar kejenuhan ammonium sulfat yang optimum, pengendapan enzim pektinase dilanjutkan dalam skala besar, yaitu sebanyak 500 ml ekstrak kasar enzim pektinase dijenuhkan dengan ammonium sulfat. Pengendapan dalam skala besar dilakukan dengan merendam ekstrak kasar enzim pektinase dalam penangas es, selanjutnya dimasukkan sejumlah ammonium sulfat sedikit demi sedikit secara perlahan sambil diaduk dengan pengaduk magnetik sampai ammonium sulfat larut dalam enzim. Enzim yang mengendap selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 6000 rpm pada 4oC selama 20 menit. Selanjutnya endapan enzim dilarutkan dalam buffer fosfat sitrat pH 7 hingga tepat larut, kemudian dilakukan dialisis menggunakan tabung selofan. 3.3.7.2 Dialisis Dialisis dilakukan dengan cara memasukkan fraksi enzim yang memiliki aktivitas optimum ke dalam tabung selofan yang salah satu ujungnya telah disimpul. Setelah setengah dari volume tabung terisi, maka ujung yang lain diikat. Tabung selofan yang telah terisi larutan enzim pektinase direndam dalam larutan 0,025 M buffer Tris-HCl pH 7,5 sambil diaduk perlahan dengan pengaduk magnetik dan setiap 2 jam dilakukan penggantian buffer. Dialisis dilakukan Skripsi Produksi dan Pemurnian Enzim Pektinase (Poligalakturonase) dari Bakteri Pseudomonas stutzeri Nur Rohishoh ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga 36 sampai fraksi enzim bebas ammonium sulfat. Proses dialisis selesai apabila fraksi enzim telah bebas dari ammonium sulfat yang ditandai dengan tidak terbentuknya endapan putih ketika larutan buffer ditetesi larutan BaCl2 atau tidak terbentuknya endapan coklat ketika larutan buffer ditetesi pereaksi Nessler. Setelah proses dialisis selesai, larutan enzim dikeluarkan dari tabung selofan dan diukur volumennya. Selanjutnya dilakukan uji aktivitas dan dilanjutkan dengan tahap pemurnian menggunakan kromatografi penukar ion. 3.3.7.3 Pemurnian enzim pektinase dengan kromatografi penukar anion Kromatografi penukar anion dilakukan dengan memasukkan kapas secukupnya ke dalam kolom. Sebanyak 1-2 ml matriks DEAE-Toyopearl 650 M dalam etanol dituangkan ke dalam kolom. Selanjutnya ke dalam matriks ditambahkan 10 ml larutan buffer Tris HCl pH 7. Sebanyak 2 ml enzim pektinase hasil dialisis dimasukkan ke dalam kolom. Fraksi enzim dipisahkan dengan mengalirkan eluen NaCl [0-1] M dalam buffer Tris HCl 7 dibuat bergradien dari konsentrasi rendah ke tinggi dalam kolom. Selanjutnya masing-masing fraksi diukur kadar protein dan aktivitasnya. 3.3.8 Analisis SDS-PAGE Penentuan berat molekul enzim pektinase dilakukan dengan analisis SDSPAGE berdasarkan prosedur Laemmli (1970). Gel yang digunakan terdiri dari 12% separating gel dan 5% stacking gel. Ke dalam tabung Eppendorf dimasukkan sampel (enzim 20 µL dan buffer sampel 5 µL). Campuran tersebut dipanaskan dalam penangas air mendidih selam 5 menit. Kemudian sampel dimasukkan ke dalam sumur stacking gel bersama-sama dengan marker protein. Skripsi Produksi dan Pemurnian Enzim Pektinase (Poligalakturonase) dari Bakteri Pseudomonas stutzeri Nur Rohishoh ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga 37 Selanjutnya piranti elektroforesis Biorad dipasang, dan 800 µL buffer elektroforesis pH 8,3 dituangkan ke dalam bejana elektroforesis. Proses elektroforesis berlangsung lebih kurang selama 2 jam pada tegangan 80 volt. Setelah proses elektroforesis selesai, gel elektroforesis dilepas dari cetakan dan jarak migrasi bromofenol biru diukur dari batas atas gel pemisah. Penampakan pita protein dilakukan dengan merendam gel elektroforesis dalam larutan staining yang mengandung Coomassie Blue 0,1 % selama 30 menit sambil digoyang konstan pada mesin penggoyang. Selanjutnya untuk mengetahui posisi enzim pektinase target dilakukan destaining yang mengandung 10% asam asetat glasial dan 10% metanol Proses ini dilakukan sampai diperoleh pita-pita protein berwarna biru dengan latar belakang jernih. Skripsi Produksi dan Pemurnian Enzim Pektinase (Poligalakturonase) dari Bakteri Pseudomonas stutzeri Nur Rohishoh ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga 38 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Hasil Produksi Enzim Pektinase dari Pseudomonas stutzeri Bakteri Pseudomonas stutzeri yang telah telah berhasil diisolasi dari perairan tambak di Gresik, diremajakan kembali pada media padat yang mengandung substrat pektin. Penggunaan substrat bertujuan agar dapat menginduksi bakteri untuk menghasilkan enzim pektinase. Bakteri yang tumbuh merupakan bakteri yang memanfaatkan pektin sebagai sumber karbon dengan cara mendegradasi pektin menjadi monomer-monomer asam galakturonat (Masithah, 2008). Tujuan peremajaan ini adalah untuk menumbuhkan kembali bakteri pada media yang baru dengan kebutuhan nutrisi yang cukup. Setelah diperoleh beberapa isolat tunggal, dilakukan seleksi isolat bakteri yang memiliki aktivitas pektinolitik tertinggi yang dapat dideteksi dengan adanya bidang halo yang paling besar di sekitar koloni bakteri. Bidang halo akan tampak berwarna bening setelah proses pewarnaan menggunakan Congo red, sedangkan media pektin akan berwarna merah kecoklatan. P-2 P-1 P-3 P-4 Gambar 4.1 Isolat bakteri penghasil enzim pektinase 38 Skripsi Produksi dan Pemurnian Enzim Pektinase (Poligalakturonase) dari Bakteri Pseudomonas stutzeri Nur Rohishoh ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga 39 Di antara keempat isolat bakteri pektinolitik pada Gambar 4.1, isolat bakteri dengan kode P-3 memiliki diameter bidang halo terbesar yang menunjukkan bahwa isolat bakteri tersebut memiliki aktivitas pektinolitik tertinggi (Masithah, 2008). Isolat dengan bidang halo terbesar (P-3) diinokulasi dalam media dengan penggoyangan menggunakan shaker 150 rpm pada suhu kamar selama 12 jam. Biakan inokulum dipindahkan ke dalam media produksi dan diinkubasi selama 12 jam dengan penggoyangan 150 rpm yang bertujuan agar proses aerasi merata di seluruh bagian media cair sehingga bakteri dapat tumbuh dengan baik. Enzim pektinase yang diproduksi terdapat pada bagian supernatan hasil sentrifugasi karena enzim pektinase merupakan enzim ekstraseluler (Alkorta et al., 1998). Supernatan (crude enzyme) endapan (a) (b) Gambar 4.2 Hasil isolasi enzim pektinase, sebelum disentrifugasi (a) dan sesudah disentrifugasi (b) 4.2 Uji Aktivitas Enzim Pektinase Enzim pektinase diuji aktivitas poligalakturonasenya pada substrat asam poligalakturonat (pektin teresterifikasi) menggunakan metode DNS. Substrat asam poligalakturonat didegradasi oleh poligalakturonase menjadi monomer- Skripsi Produksi dan Pemurnian Enzim Pektinase (Poligalakturonase) dari Bakteri Pseudomonas stutzeri Nur Rohishoh ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga 40 monomer asam galakturonat secara hidrolisis (Alkorta et al., 1998). Asam galakturonat merupakan gula pereduksi yang dapat mereduksi asam 3,5dinitrosalisilat menjadi asam 3-amino-5-nitrosalisilat (Zheng et al.,2000). Secara kualitatif, reaksi reduksi ini dapat dilihat dari perubahan warna campuran enzim pektinase, substrat asam poligalakturonat, dan reagen DNS yang berwarna kuning tua menjadi coklat tua. Reaksi yang terjadi sebagai berikut: COOH COOH OH O2N NO2 asam 3,5-dinitrosalisilat (kuning) OH gula pereduksi asam galakturonat O2N NH2 asam 3-amino-5-nitrosalisilat (coklat) Gambar 4.3 Reaksi reduksi asam 3,5-dinitrosalisilat menjadi asam 3-amino-5nitrosalisilat Pada pengukuran uji aktivitas enzim digunakan kontrol yang berfungsi sebagai pembanding banyaknya produk yang dihasilkan. Adapun komposisi kontrol sama dengan sampel enzim, perbedaannya terletak pada urutan penambahan komposisi dan proses inkubasi. Perlakuan pada sampel dimulai dari penambahan enzim dan substrat kemudian diinkubasi selama 30 menit pada suhu 40oC yang bertujuan agar enzim bereaksi dengan substrat secara optimal, selanjutnya ditambah dengan reagen DNS. Sedangkan pada kontrol, urutan penambahan komposisinya dimulai dari enzim kemudian reagen DNS dan terakhir substrat tanpa inkubasi. Hal ini bertujuan agar enzim tidak bereaksi dengan substrat. Substrat yang digunakan yaitu asam poligalakturonat yang Skripsi Produksi dan Pemurnian Enzim Pektinase (Poligalakturonase) dari Bakteri Pseudomonas stutzeri Nur Rohishoh ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga 41 merupakan substrat spesifik untuk aktivitas poligalakturonase. Pada pembuatan substrat asam poligalakturonat ditambahkan larutan EDTA 1 mM yang bertujuan untuk menghambat aktivitas enzim pektat liase dan pektin liase (Yadav et al., 2008). Uji aktivitas enzim dengan metode DNS yaitu dengan menginkubasi enzim yang telah ditambahkan dengan substrat selama 30 menit pada suhu 40 oC. Selama proses ini terjadi degradsi pektin oleh poligalakturonase menjadi monomer-monomer asam galakturonat yang merupakan salah satu jenis gula pereduksi. Setelah penambahan reagen DNS, dilakukan pemanasan dalam air mendidih yang bertujuan untuk mematikan enzim dan menyempurnakan reaksi antara gula pereduksi asam galakturonat dengan reagen DNS. Banyaknya gula pereduksi yang terbentuk diukur menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 546,5 nm. Satu unit aktivitas enzim pektinolitik didefinisikan sebagai jumlah enzim yang memproduksi 1 µmol produk asam galakturonat per satuan waktu untuk setiap ml enzim pada kondisi percobaan (Zheng et al., 2000). Aktivitas yang terukur pada ekstrak kasar enzim sebesar 0,15513 U/ml. 4.3 Uji Kadar Protein Penentuan kadar protein pada penelitian ini menggunakan metode Bradford. Pemilihan metode ini dikarenakan pengerjaannya yang sangat sederhana, cepat, sensitif, dan cukup akurat. Penentuan kadar protein ini digunakan untuk menghitung aktivitas spesifik dari suatu protein enzim. Skripsi Produksi dan Pemurnian Enzim Pektinase (Poligalakturonase) dari Bakteri Pseudomonas stutzeri Nur Rohishoh ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga 42 Beberapa reagen yang harus dipersiapkan adalah reagen Bradford dan standar Bovine Serum Albumin (BSA). Reagen Bradford ini terdiri dari 50 mg Coomassie brilliant blue G-250 yang dilarutkan dalam 25 ml etanol 96%, kemudian ditambahkan 50 ml asam fosfat 85% dan diencerkan dengan akuades sampai volume 500 ml (Bollag and Edelstein, 1991). Prosedur yang dilakukan yaitu menambahkan sampel enzim dengan reagen Bradford. Setelah dihomogenkan dengan vortex, diukur absorbansinya dengan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 595 nm. Pada penelitian ini, reagen Bradford dibuat dengan menambahkan asam fosfat yang bertujuan untuk memberikan respon yang lebih konsisten dengan protein lain dan merupakan reagen yang stabil (Scope, 1993). Kadar protein untuk ekstrak kasar enzim pektinase (poligalakturonase) yaitu 2,54132 mg/ml, sehingga diperoleh aktivitas spesifik ekstrak kasar enzim pektinase (poligalakturonase) sebesar 0.06104 U/mg. 4.4 Hasil Pemurnian Enzim Pektinase 4.4.1 Hasil pengendapan enzim pektinase dengan ammonium sulfat Enzim pektinase yang dihasilkan berupa ekstrak kasar yang merupakan campuran dari berbagai macam protein lainnya sehingga perlu dilakukan pemurnian untuk mendapatkan enzim yang lebih murni. Prosedur awal pemurnian yaitu dengan mengendapkan enzim pektinase menggunakan ammonium sulfat berdasarkan tabel Scopes (1993). Prinsip pengendapan dengan ammonium sulfat adalah salting out. Ion-ion dari garam ammonium sulfat sangat mempengaruhi kelarutan protein. Pada Skripsi Produksi dan Pemurnian Enzim Pektinase (Poligalakturonase) dari Bakteri Pseudomonas stutzeri Nur Rohishoh ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga 43 konsentrasi rendah ion-ion garam mengeilingi molekul protein enzim dan mencegah bersatunya molekul protein enzim sehingga protein berada dalam keadaan larut (salting in). Pada penambahan ammonium sulfat dengan konsentrasi tinggi, molekul air akan tertarik ke ion-ion garam sehingga molekul air yang berinteraksi dengan protein akan berkurang. Keadaan ini mengakibatkan terjadinya interaksi hidrofobik di antara sesama molekul protein enzim yang dapat menurunkan kelarutan protein sehingga protein mengendap (Scopes, 1993). Penambahan ammonium sulfat dalam ekstrak kasar enzim pektinase dilakukan sedikit demi sedikit disertai pengadukan dengan magnetic stirrer untuk mempercepat kelarutan ammonium sulfat dan menghomogenkan ammonium sulfat ke seluruh bagian ekstrak kasar enzim. Proses pengadukan secara perlahanlahan untuk menghindari terbentuknya buih, karena pembentukan buih ini merupakan indikasi enzim terdenaturasi (Suhartono, 1992). Ammonium sulfat yang ditambahkan dalam ekstrak kasar enzim antara 40-100%. Hasil penelitian Masithah (2008) menyebutkan enzim pektinase mengendap pada kejenuhan ammonium sulfat 70%. Enzim yang telah diendapkan memiliki aktivitas pektinolitik (aktivitas spesifik) lebih besar dibandingkan dengan ekstrak kasarnya. Hasil optimasi pengendapan enzim pektinase dengan ammonium sulfat disajikan pada Gambar 4.4. Skripsi Produksi dan Pemurnian Enzim Pektinase (Poligalakturonase) dari Bakteri Pseudomonas stutzeri Nur Rohishoh ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga 44 Gambar 4.4 Optimasi pengendapan ekstrak kasar enzim pektinase dengan ammonium sulfat Berdasarkan hasil penelitian, enzim pektinase memiliki aktivitas optimum pada pengendapan dengan 70% ammonium sulfat. Selanjutnya aktivitas enzim menurun karena enzim telah jenuh dengan ammonium sulfat. Enzim pektinase hasil pengendapan dengan amonium sulfat optimum memiliki aktivitas total sebesar 0.09204 U/ml. Besarnya kadar protein setelah pengendapan enzim ini sebesar 0,50964 mg/ml, sehingga diperoleh aktivitas spesifik enzim pektinase dengan jenis poligalakturonase sebesar 0,18059 U/mg. 4.4.2 Hasil dialisis enzim pektinase Tahap dialisis bertujuan untuk menghilangkan sisa-sisa garam ammonium sulfat dari enzim agar tidak menggangu aktivitas enzim . Enzim pektinase yang telah diendapkan dengan ammonium sulfat didialisis dalam buffer tris HCl 0,025 M pH 7,5 menggunakan tabung selofan (± 12 kD). Untuk menghindari kontaminasi dari bahan kimia, tabung selofan terlebih dahulu direbus selama 10 menit dalam larutan yang mengandung 10 mM NaHCO3 dan 1 mM EDTA lalu dicuci dan direbus kembali dengan akuades selama 10 menit sebanyak 2 kali. Skripsi Produksi dan Pemurnian Enzim Pektinase (Poligalakturonase) dari Bakteri Pseudomonas stutzeri Nur Rohishoh ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga 45 Untuk penyimpanan, tabung selofan direndam dalam larutan EDTA dan disimpan dalam suasana dingin (Harris dan Angal, 1993). Pada proses dialisis, molekul berukuran lebih kecil seperti garam ataupun ion pengganggu lainnya akan melewati pori-pori tabung selofan sampai konsentarsi di dalam dan di luar tabung mencapai nilai yang sama dan larutan buffer masuk ke dalam tabung menggantikan molekul kecil yang keluar (Boyer, 1993), sedangkan molekul-molekul protein yang berukuran lebih besar tertahan di dalam tabung selofan. Proses dialisis enzim pektinase berlangsung selama kurang lebih 10 jam di mana setiap 2 jam sekali buffer tris HCl diganti agar tidak terjadi penumpukan ammonium sulfat dalam buffer. Dialisis dihentikan setelah tidak ada lagi ammonium sulfat yang keluar dari tabung selofan. Hal ini dapat diidentifikasi dengan menambahkan beberapa tetes pereaksi Nessler pada buffer dialisis, jika sudah tidak terbentuk endapan coklat maka proses dialisis telah selesai. Identifikasi ammonium sulfat pada proses dialisis ini tidak menggunakan BaCl2 karena ion fosfat dari buffer fosfat sitrat yang digunkanan untuk melarutkan enzim pektinase akan membentuk endapan putih Ba3(PO3)2. Begitu pula dengan ion sulfat dari amonium sulfat akan membentuk endapan putih BaSO4, sehingga reagen BaCl2 ini kurang spesifik jika digunakan untuk mengidentifikasi adanya amonium sulfat dalam buffer selama proses dialisis. Setelah proses dialisis, diharapkan aktivitas spesifik dari enzim pektinase mengalami peningkatan. Berdasarkan hasil uji, diperoleh aktivitas total enzim Skripsi Produksi dan Pemurnian Enzim Pektinase (Poligalakturonase) dari Bakteri Pseudomonas stutzeri Nur Rohishoh ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga 46 0,07794 U/ml, kadar protein 0,25482 mg/ml, dan aktivitas spesifik enzim pektinase dengan jenis poligalakturonase sebesar 0,30585 U/mg. 4.4.3 Hasil pemurnian enzim pektinase dengan kromatografi penukar anion Tahap pemurnian enzim pektinase selanjutnya menggunakan metode kromatografi penukar anion. Kromatografi penukar anion digunakan untuk memisahkan protein berdasarkan muatannya (Stryer, 2002). Seperangkat alat kromatografi penukar ion terdiri dari kolom plastik transparan berukuran 5 ml yang dirangkai dengan selang yang menghubungkan eluen dengan kolom. Eluen yang digunakan adalah NaCl dalam buffer tris HCl pH 7 bergradien 0-1 M dan matriks yang digunakan adalah DEAE-Toyopearl 650 M dalam etanol. Preparasi kolom kromatografi penukar ion dilakukan dengan menyumbat ujung kolom dengan kapas untuk mencegah kebocoran matriks. Matriks DEAEToyopearl 650 M yang telah berada dalam kolom dikondisikan dengan mengalirkan 5 ml buffer tris HCl pH 7, karena pada pH 7 merupakan kondisi optimal dari enzim pektinase khususnya poligalakturonase (Pathak et al., 2000). Enzim pektinase dalam kolom penukar ion dielusi dengan NaCl dalam buffer tris HCl pH 7 yang dialirkan secara bergradien dari konsentrasi rendah ke tinggi. Perbandingan volume NaCl dan buffer tris HCl yang digunakan yaitu 1:1 (Yadav et al., 2008). NaCl 1 M dialirkan ke dalam buffer tris HCl disertai dengan pengadukan menggunakan magnetic stirrer yang bertujuan untuk menghomogenkan aliran gradien eluen. Protein enzim pektinase memiliki muatan negatif, karena pH enzim pektinase lebih besar daripada titik isoelektriknya (pI) (Pathak et al., 2000). Skripsi Produksi dan Pemurnian Enzim Pektinase (Poligalakturonase) dari Bakteri Pseudomonas stutzeri Nur Rohishoh ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga 47 Enzim pektinase yang bermuatan negatif akan diselimuti oleh komponen buffer tris HCl yang bermuatan positif (H+), sedangkan matriks DEAE yang bermuatan positif akan diselimuti oleh komponen dari buffer yang bermuatan negatif (Cl-). Interaksi antara enzim dan matriks DEAE akan terjadi di mana ion Cl- akan segera digantikan posisinya oleh enzim. Ion Cl- selanjutnya akan bergabung kembali dengan Htris+ menjadi Tris Cl yang tidak bermuatan. Peningkatan konsentrasi Tris Cl akhirnya dapat mengusir kedudukan enzim, sehingga enzim akan terelusi keluar kolom dengan fraksi yang berbeda-beda (Scopes, 1993). Peningkatan konsentrasi ion dalam penelitian ini dilakukan dengan gradien NaCl 0-1 M. Enzim pektinase yang telah dielusi, ditampung dalam botol untuk setiap 1 ml fraksi enzim yang dikeluarkan dari kolom. Fraksi enzim yang diperoleh sebanyak 22 botol dengan hasil uji sebagai berikut : Gambar 4.5 Profil elusi enzim pektinase dengan kromatografi penukar anion Hasil kromatografi penukar anion menunjukkan adanya 3 aktivitas enzim pektinase. Hal ini dapat dilihat pada Gambar 4.4, terdapat 3 puncak aktivitas enzim pektinase pada fraksi fraksi ke-9, ke-14 dan ke-18. Fraksi ke-9 dan ke-14 Skripsi Produksi dan Pemurnian Enzim Pektinase (Poligalakturonase) dari Bakteri Pseudomonas stutzeri Nur Rohishoh ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga 48 menunjukkan aktivitas spesifik yang lebih kecil, masing-masing yaitu (0,19212 U/mg) dan (0,39517 U/mg). Hal ini dapat diartikan aktivitas enzim pektinase pada fraksi ke-14 tidak hanya tidak hanya poligalakturonase melainkan juga enzim pektinase jenis lainnya seperti pektin liase dan pektat liase. Sedangkan pada fraksi ke-18 menunjukkan aktivitas spesifik yang paling tinggi (4,74208 U/mg), yang dapat diartikan bahwa sebagian besar enzim yang bekerja pada fraksi ke-18 adalah poligalakturonase. Kemurnian poligalakturonase pada fraksi ke-18 dapat dideteksi melalui analisis SDS-PAGE. Berdasarkan hasil serangkaian pemurnian enzim pektinase, dapat diinformasikan lebih lanjut melalui suatu tabel pemurnian sebagai berikut : Tabel 4.1 Pemurnian enzim pektinase (poligalakturonase) Tahap Pemurnian Volume (ml) Aktivitas Total (Unit) Protein Total (mg) Aktivitas Spesifik (U/mg) Hasil (%) Kemurnian Ekstrak kasar 500 0,15513 2,54132 0,06104 100 1 Pengendapan (NH4)2SO4 70% 50 0,09204 0,50964 0,18059 59,3 2,9 Dialisis 30 0,07794 0,25482 0.30585 50,2 5,0 Kromatografi penukar anion 5 0,06532 0,01377 4,74208 42,1 77,7 Pada Tabel 4.1 diinformasikan bahwa selisih tertinggi protein yang hilang pada setiap tahap pemurnian ditunjukkan pada saat dilakukan pengendapan enzim dengan amonium sulfat, yaitu sekitar 40,7%. Sedangkan pada tahap dialisis dan kromatografi penukar anion, protein yang hilang sekitar 9,1% dan 8,1%. Banyaknya protein yang hilang setelah dilakukan pengendapan enzim dengan amonium sulfat, dikhawatirkan masih banyak protein target yang tidak Skripsi Produksi dan Pemurnian Enzim Pektinase (Poligalakturonase) dari Bakteri Pseudomonas stutzeri Nur Rohishoh ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga 49 terendapkan karena tujuan dari pengendapan enzim ini yaitu memekatkan enzim dan memisahkanya dari molekul air (Scopes, 1993). Hal ini menunjukkan bahwa pengendapan enzim dengan amonium sulfat yang dilakukan pada satu titik kejenuhan yang dalam penelitian ini hanya dilakukan pada kejenuhan 70% belum memberikan hasil yang maksimal, sehingga perlu dilakukan fraksinasi enzim pektinase dengan amonium sulfat pada range kejenuhan tertentu untuk mendapatkan hasil pengendapan enzim dengan persentase yang lebih besar. Berdasarkan hasil pemurnian enzim dengan kromatografi penukar anion, diperoleh tingkat kemurnian enzim yang cukup tinggi yaitu 77,7 kali lebih murni dibandingkan dengan ekstrak kasarnya, sedangkan hasil pemurnian yang diperoleh sebesar 42,1%. Hasil pemurnian ini menunjukkan protein enzim pektinase telah terpisah dengan baik dari beberapa protein maupun kontaminan lainnya, walaupun kadar protein yang diperoleh cukup rendah dan masih dimungkinkan terdapat kontaminan yang belum terpisah dari protein enzim pektinase. 4.5 Hasil Analisis SDS-PAGE Hasil pemurnian enzim pektinase dapat dikonfirmasi melalui analisis SDS-PAGE untuk mengetahui seberapa murni enzim pektinase yang diperoleh berdasarkan data kualitatif yang ditunjukkan oleh hasil SDS-PAGE. Selain itu, hasil SDS-PAGE juga dapat digunakan untuk menentukan berat molekul dari protein enzim pektinase. Skripsi Produksi dan Pemurnian Enzim Pektinase (Poligalakturonase) dari Bakteri Pseudomonas stutzeri Nur Rohishoh ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga 50 Pada pembuatan gel SDS-PAGE baik stacking gel 5% maupun separating gel 12%, ditambahkan ammonium persulfat yang berfungsi sebagai inisiator polimerisasi dan TEMED (N,N,N’,N’-tetramethylen-ethylendiamine) yang berfungsi sebagai katalis untuk mempercepat pembentukan radikal SO4 (Janson, 1998). Sedangkan perlakuan terhadap sampel yaitu dengan menambahkan sampel buffer disertai dengan pemanasan untuk proses denaturasi. Sampel buffer mengandung beta-merkaptoetanol yang berperan untuk merusak struktur tiga dimensi protein dengan cara memecah ikatan disulfida yang tereduksi menjadi gugus sulfhidril. Adanya gliserol dalam buffer sampel berfungsi untuk meningkatkan berat jenis larutan sampel sehingga dapat masuk dengan mudah ketika diinjeksikan ke dalam sumur gel. Buffer sampel juga mengandung pewarna bromophenol blue yang berfungsi untuk membantu memonitor jalannya elektroforesis (Wilson dan Walker, 2000) Prinsip analisis SDS-PAGE yaitu pemisahan protein berdasarkan ukuran molekulnya. SDS (Sodium Dodesil Sulfat) merupakan deterjen ionik yang terdiri dari gugus hidrofobik yang kuat (suatu lipid) dan gugus yang sangat hidrofilik (gugus sulfat). Ujung hidrofobik SDS akan berinteraksi dengan asam amino hidrofobik suatu protein dan merusak struktur tersier protein menjadi linear sehingga pemisahan protein terjadi karena perbedaan berat molekul. Ujung hidrofilik SDS (gugus sulfat) yang bermuatan negatif akan mengelilingi protein dan membentuk komplek yang mengandung muatan negatif sehingga dapat dipisahkan dalam gel poliakrilamid dengan adanya aliran listrik (Boyer, 1993). Skripsi Produksi dan Pemurnian Enzim Pektinase (Poligalakturonase) dari Bakteri Pseudomonas stutzeri Nur Rohishoh ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga 51 Pergerakan protein dalam medan listrik hanya didasarkan pada ukuran molekul protein. Protein yang berukuran kecil akan bergerak lebih cepat dibandingkan dengan protein yang berukuran lebih besar. Massa molekul relatif (Mr) protein dapat diukur menggunakan protein standar (marker protein) yang yang telah diketahui Mr-nya dengan cara membandingkan nilai mobilitas relatif (Rf). Rf protein merupakan perbandingan jarak antara titik awal ke pita protein dengan jarak titik awal ke titik akhir elektroforesis (Wilson dan Walker, 2000). Marker protein yang digunakan yaitu LMW standard yang dapat mendeteksi berat molekul suatu protein antara 14,4-97,0 kDa. 1 M 2 CE 3 AS 4 D 5 F-18 97,0 kDa 66,0 kDa 2 pita protein 45,0 kDa 30,0 kDa 20,1 kDa Gambar 4.6 Hasil analisis SDS-PAGE; marker protein (M), ekstrak kasar enzim (CE), pengendapan dengan ammonium sulfat (AS), dialisis (D), dan fraksi ke-18 kromatografi penukar anion Berdasarkan hasil SDS-PAGE, sumur 1 merupakan marker protein yang sudah diketahui berat molekulnya sekitar 20,1-97,0 kDa. Pada sumur 2 merupakan ekstrak kasar enzim pektinase yang diisolasi dari bakteri Pseudomonas stutzeri., terlihat banyak pita-pita protein yang belum terpisah Skripsi Produksi dan Pemurnian Enzim Pektinase (Poligalakturonase) dari Bakteri Pseudomonas stutzeri Nur Rohishoh ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga 52 dengan jelas (smear). Hal ini mengindikasikan dalam ekstrak kasar pektinase masih terdapat berbagai macam protein kontaminan. Sumur 3 merupakan hasil pengendapan enzim dengan ammonium sulfat 70% yang dilanjutkan dengan hasil dialisis pada sumur 4. Pada sumur 2 pita protein terlihat tidak jelas sedangkan pada sumur 3 terdapat sekitar 4 pita protein dari hasil dialisis. Hasil pemurnian dengan kolom penukar anion pada fraksi ke-18 pada sumur 5 memperlihatkan dua buah pita protein yang saling berdekatan dengan berat molekul relatif (Mr) masing-masing pita sekitar 44,95 kDa dan 46,73 kDa. Dua pita protein yang diperoleh ini diduga sebagai pita-pita protein dari enzim pektinase (poligalakturonase) karena jaraknya yang sangat berdekatan, sehingga dapat diartikan enzim pektinase (poligalakturonase) merupakan isozim, yaitu enzim yang mengkatalisisi reaksi metabolisme yang sama tetapi mempunyai sifat, ukuran dan bentuk molekul yang beragam (polimorfik) dalam suatu organisme atau spesies (Micales and Bonde, 1995). Berat molekul relatif (Mr) enzim pektinase khususnya poligalakturonase berada pada kisaran 38-79 kDa (Tari et al., 2008), sehingga Mr dari kedua pita protein hasil analisis SDS-PAGE (44,95 kDa dan 46,73 kDa) sesuai dengan literatur dan merupakan Mr enzim pektinase (poligalakturonase) dari bakteri Pseudomonas stutzeri. Skripsi Produksi dan Pemurnian Enzim Pektinase (Poligalakturonase) dari Bakteri Pseudomonas stutzeri Nur Rohishoh ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga 53 BAB V KESIMPULAN DAN SARAN 5.1 Kesimpulan Berdasarkan hasil dan pembahasan dapat disimpulkan bahwa : 1. Tingkat kemurnian enzim pektinase (poligalakturonase) dari bakteri Pseudomonas stutzeri setelah dilakukan serangkaian tahap pemurnian sebesar 77,7 kali lebih murni dibandingkan ekstrak kasarnya. 2. Berat molekul enzim pektinase (poligalakturonase) dari Pseudomonas stutzeri yaitu sekitar 44,95 kDa dan 46,73 kDa. 5.2 Saran Penelitian selanjutnya perlu dilakukan fraksinasi enzim dengan ammonium sulfat pada range kejenuhan tertentu untuk mendapatkan hasil pengendapan enzim yang maksimal. Tahap pemurnian enzim dapat dilanjutkan menggunakan kromatografi kolom lainnya (kromatografi filtrasi gel, kromatografi afinitas, kromatografi interaksi hidrofobik). Selain itu, perlu juga dilakukan analisis zimogram untuk mendapatkan hasil pemisahan protein enzim yang yang lebih baik. 53 Skripsi Produksi dan Pemurnian Enzim Pektinase (Poligalakturonase) dari Bakteri Pseudomonas stutzeri Nur Rohishoh ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga 54 DAFTAR PUSTAKA Alkorta, I., Garbisu, C., Llama, M.J., and Serra, J.L., 1998, Industrial Application of Pektin Enzymes: A Review, Process Biochemistry, 33: 21-28. Boyer, RF., 1993, Modern Experimental Benjamin/Cummings PCI, California. Biochemistry, Jilid 2, The Bollag, D.M. and Edelstein, S.J., 1991, Protein Methods, Willey-liss, New York. Builder, E., 1993, Hydrophobic Interaction Chromatography : Principles and Methods, Amersham Bioscience, San Fransisco. Davis, L., Kuehl, M., and Battey, M., 1994, Basic Methods: Molecular Biology, Jilid 2, Appletn & Lange, Norwola. Debing, J., Peijun, L., Stagnitti, F., Xianzhe, X., and Li, L., 2006, Pectinase Production by Solid Fermentation from Aspergillus niger by a New Prescription Experiment, Ecotoxicology and Environmental Safety, 64: 244-250. Fawole, O.B. and Odunfa, S.A., 2003, Some Factors Affecting Production of Pectic Enzymes by Aspergillus niger, International Biodeterioration & Biodegradation, 52: 223-227. Harris, E.L.V., 1989, Concentration of The Extract, di dalam Harris E.L.V., Angal S, Editor Protein Purufication Methods, A Pratical Approach, IRL PC, Oxford. Harris, E.L.V. and Angal, S, 1993, Protein Purification Methods, A Pratical Approach, IRL Press, Oxford. Herlina, M.S., 2010, Isolasi Bakteri Indigen Sebagai Pendegradasi Bahan Organik Pada Pembenihan Ikan Lele Dumbo Sistem Resirkulasi Tertutup, Skripsi, Fakultas Perikanan Dan Kelautan, Universitas Airlangga, Surabaya. Jacob, N., Poorna, C.A., and Prema, P., 2008, Purification and Partial Characterization of Polygalacturonase from Streptomyces lydicus, Bioresource Technology, 99: 6697-6701. Janson, J.C., L.Ryden, 2008, Protein Purification Principles, High-Resolution Methods and Application, Second Edition, John Wiley and Sons, Inc : Canada. 54 Skripsi Produksi dan Pemurnian Enzim Pektinase (Poligalakturonase) dari Bakteri Pseudomonas stutzeri Nur Rohishoh ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga 55 Kobayashi, T., Hatada, Y., Suzumatsu, A., Saeki, K., Hakamada, Y., and Ito, S., 2000, Highly Alkaline Pectat Lyase Pel-4A from Alkaliphilic Bacillus sp. Strain P-4-N: Its Catalytic Properties and Deduced Amino Acid Sequence, Extremophiles, 4: 377-383. Lehninger, A. L., 1993, Dasar-Dasar Biokimia, Jilid 1, terjemahan Maggy Thenawijaya, Penerbit Erlangga, Jakarta. Laemmli, U.K., 1970, Cleavage of Structural Proteins during The Assembly of The Head of Bacteriophage T4, Nature, London 227 : 680-685. Masithah, E.D., 2008, Potensi Bakteri Pektinolitik Sebagai Kandidat Pengendali Blooming Microcystis aeruginosa, Disertasi, Program Pascasarjana, Universitas Airlangga, Surabaya. Mayans, O., Scott, M., Connerton, I., Gravesen, T., Benen, J., Visser, J., pickersgill, R., and Jenkins, J.,1997, Two Crystal Structures of Pektin Lyase A from Aspergillus Reveal a pH Driven Conformational Change and Striking Divergence in the Substrate-binding Clefts of Pektin and Pectate Lyases, Research Article, 5 (5): 677-689. Micales, J.A. and Bonde, M.R., 1995, Isozymes: Methods and Applications, di dalam: Singh RP, Singh US, Editors Molecular Methods in Plant Pathology, CRC Press-Lewis Publishers, Boca Raton. Nussinovitch, 1997, Hydrocolloid Aplications Gum Technology in The Food and Other Industries, Blackie Academic and Profesional, London. O’Farrel, P.A., 1998, Hydrophobic Interaction Chromatography, di dalam Repley R. and Walker JM., Molecular Biomethods Handbook, Humana Pr, Totowa. Ortega, N., de Diego, S., Perez-Mateos, M., and Busto, M.D., 2004, Kinetic Properties and Thermal Behaviour of Polygalacturonase Used in Fruit Juice Clarification, Food Chemistry, Burgos 88: 209-217. Ottoway, J.H., Apps, D.K., 1984, Biochemistry, Edisi ke-4, ELBS, Cambridge. Pathak, N., Mishra, S., and Sanwal, G.G., 2000, Purification and Characterization of Polygalacturonase from Banana Fruit, Phytochemistry, 54 : 147-152. Pelczar, M.J. dan Chan, E.C.S., 2007, Dasar-dasar Mikrobiologi, Jilid I, Penerjemah Hadiutomo, R.S., Imas, T., Tjitrosomo, S.S., dan Angka, S.L., UI-Press, Jakarta. Skripsi Produksi dan Pemurnian Enzim Pektinase (Poligalakturonase) dari Bakteri Pseudomonas stutzeri Nur Rohishoh ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga 56 Poedjiadi, A., 1994, Dasar-Dasar Biokimia, Universitas Indonesia Press, Jakarta. Purwani, N.N., 2006, Pemurnian Parsial Enzim Xilanase Asal Isolat Sumber Air Panas Pacet, Jawa Timur, Skripsi, Departemen Kimia, Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Airlangga, Surabaya. Quiroga, E.N., Sgariglia, M.A.., Molina, C.F., Sampietro, D.A., Soberon, J.R., and Vattuone. M.A., 2009, Purification and Characterization of an Exo-polygalacturonase from Pycnoporus sanguineus, Mycological Research, 113: 1404-1410. Rahardja, S.B., 2010, Efektifitas Bakteri Pseudomonas Sebagai Pengurai Bahan Organik (Protein, Karbohidrat, Lemak) pada Media Air Limbah Pembenihan Ikan Lele Dumbo (Clarias sp.) Sistem Sirkulasi Tertutup, Jurnal Ilmiah Perikanan dan Kelautan, Fakultas Perikanan dan Kelautan, Universitas Airlangga, Surabaya. Rani, H.C., 2009, Pemisahan Dan Pemurnian Kompleks Enzim Selulase Dari Bakteri Acidothermus cellulolitycus, Skripsi, Departemen Kimia, Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Airlangga, Surabaya. Scopes, R.K., 1993, Protein Purification Principle and Practice, Edisi Ke-3, Springer Verlag, New York. Shen, Z., Reese, J.C., and Reeck, G.R., 1996, Purification and Characterization of Polygalacturonase from the Rice Weevil, Sitophilus oryzae (Coleoptera: Curculionidae), Insect Biochemistry Molecular Biology, 26 (5): 427-433. Stanbury, P.F. and Whitaker, A., 1995, Principles of Fermentation Technology, Edisi Ke-2, Elsevier Science, Ltd., Oxford. Stryer, L., Tymoczko, J.L., and Berg, J.M. 2002, Biochemisty, Fifth Edition, W.H. Freeman, New York. Suhartono, M.T., 1992, Enzim dan Bioteknologi, PAU IPB, Bogor. Tari, C., Dogan, N., and Gogus, N., 2008, Biochemical and Thermal Characterization of Crude Exo-polygalacturonase Produced by Aspergillus sojae, Food Chemistry, 111: 824-829. Van Niel, C.B., and Allen, B.M., 1995, A Note on Pseudomonas stutzeri, Journal of Bacteriology, 64 : 413-422. Wilson, K., and Walker, J., 2000, Principles and Techniques of Practical Biochemistry 5th Edition, Cambridge University Press, Cambridge. Skripsi Produksi dan Pemurnian Enzim Pektinase (Poligalakturonase) dari Bakteri Pseudomonas stutzeri Nur Rohishoh ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga 57 Winarno, F.G., Fardias, S., 1990, Biofermentasi dan Biosintesa Protein, Edisi X, Penerbit Angkasa, Bandung. Zheng, Z., and Shetty, K., 2000, Solid State Production of Polygalacturonase by Lentinus edodes Using Fruit Processing Wastes, Process Biochemistry, 35 : 825-830. Yadav, S., Pramod, K.Y., Dinesh, Y., and Kapil, D.S., 2008, Purification and Characterization of An Alkaline Pectin Lyase from Aspergillus flavus, Process Biochemistry, 43 : (547-552). Skripsi Produksi dan Pemurnian Enzim Pektinase (Poligalakturonase) dari Bakteri Pseudomonas stutzeri Nur Rohishoh ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga LAMPIRAN Lampiran 1. Pembuatan reagen Larutan buffer fosfat sitrat Larutan stok A asam sitrat 0,1 M dibuat dengan cara menimbang 1,921 gram asam sitrat lalu dilarutkan dengan akuades dan diencerkan dalam labu ukur 100 mL hingga tanda batas. Larutan stok B Na2HPO4.7H2O 0,2 M dibuat dengan cara menimbang 5,365 gram lalu dilarutkan dengan akuades dan diencerkan dalam labu ukur 100 mL hingga tanda batas. Sebanyak X ml larutan A ditambah Y ml larutan B kemudian diencerkan dengan akuades sampai volume 100 ml. X 24,3 17,9 6,5 Y 25,7 32,1 43,6 pH 5 6 7 Larutan asam 3,5-dinitrosalisilat (DNS) Ditimbang dengan teliti 1 gram NaOH dilarutkan dengan 60 ml akuades, ditambahkan 18,2 gram garam Rochelle, 1 gram asam dinitrosalisilat (ditambahkan pelan-pelan sambil diaduk dengan magnetic stirrer), 0,2 gram fenol dan 0,05 gram natrium sulfit. Lalu dipindahkan secara kuantitatif ke dalam labu ukur 100 ml, diencerkan sampai tanda batas dan dikocok sampai homogen. Larutan NaCl 1 M Ditimbang sebanyak 5,85 gram NaCl kemudian dilarutkan dengan sedikit akuades, kemudian dituang secara kuantitatif ke dalam labu ukur 100 ml, dan diencerkan dengan akuades hingga tanda batas serta dikocok sampai homogen. Skripsi Produksi dan Pemurnian Enzim Pektinase (Poligalakturonase) dari Bakteri Pseudomonas stutzeri Nur Rohishoh
