plagiat merupakan tindakan tidak terpuji plagiat
advertisement
PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI AKTIVITAS SITOTOKSIK EKSTRAK METANOLIK DAUN ROSEMARY (Rosmarinus officinalis L.) TERHADAP SEL KANKER PAYUDARA T47D MELALUI REGULASI EKSPRESI RESEPTOR ESTROGEN-! (ER!) SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Farmasi Disusun Oleh: Clara Dewi Anggraeni 118114122 FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA 2015 ! ! PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI AKTIVITAS SITOTOKSIK EKSTRAK METANOLIK DAUN ROSEMARY (Rosmarinus officinalis L.) TERHADAP SEL KANKER PAYUDARA T47D MELALUI REGULASI EKSPRESI RESEPTOR ESTROGEN-! (ER!) SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Farmasi Disusun Oleh: Clara Dewi Anggraeni 118114122 FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA 2015 ! i PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI Persetujuan Pembimbing AKTIYITAS SITOTOKSIK EKSTRAK METAIYOLIK DAUN ROSEMARY (Rosmarinus ofJieinarrs L.) TERIIADAP SEL KAIIKER PAYI]DARA T47D MELALUI REGULASI EKSPRESI RESEPTOR ESTROGEN-c (ERcr) Skripsi yang diajukan oleh Clara Dewi Anggraeni MM : ll8ll4l22 telah disetujui oleh Pembimbing (Agustina Setiawati, M.Sc., Apt.) tanggal 2Maret2015 : : PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI Pengesahan Skripsi Beriudul AKTTVITAS SITOTOKSIK EKSTRAK METAI\IOLIK DAT]N ROSEMARY (Rosmarinus offtcinalis L.) TERIIADAP SEL KAIIKER PAYI]DARA T47D MELALTJI REGULASI EKSPRESI RE,SEPTOR ESTROGEN-cI @Rc) Oleh: Clara Dewi Anggraeni NIM: ll8ll4122 Diperhhankan di hadapan Panitia Penguji Skripsi Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Padatanggal: 10 Maret 2015 Metgetahui FakrdAs Farmasi itas Sanata Dharma (Aris Widayati, M.Si., Ph.D., Apt.) Panitia Penguji Skripsi l. Agustina Setiawati, M.Sc., Apt. 2. Enade Perdana Istyastono, Ph.D., Apt. 3. Damiana Sapta Candrasari, S.Si., M.Sc. lll PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI HALAMAN PERSEMBAHAN “Wherever your heart is, there you will find your treasure.” Paulo Coelho – The Alchemist Kupersembahkan karya ini kepada: Papa Alyosius Bekti Subagyo dan Mama Ambrosia Sariningsih Mbak Maria Erika Sariputranti dan Mas Christian J.P. Willy Resubun Kakak Felisitas Kanyamurti Cyrillus Dirga Sakti Adhyastha Resubun ! iv PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI PERNYATAAI\ KEASLIAN KARYA Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa slaipsi yang telah saya tulis ini, tidak memuat karya atau bagian karya orang laiq kecuali yang sudatr disebutkan dalarn hrtipan dan daftar pustakq seperti layalrrya karya ilmiah. Apabila dikennrdian hari ditemukan indikasi plagirisme dalam naskah tersebut, saya bersedia menanggung segala sanksi sesuai peraturan per,undangundangan yang berlaku. Yogyakarta, 2 Maret 2015 Penulis PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI LEMBAR PERNYATAAI\ PERSETUJUAI\ PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAI\ AKADBMIS Yang bertanda tangan di bawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata Dharma: Nama : Clara Dewi Anggraeni NIM : ll8ll4l22 Demi perkembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta,karya ilmiah saya yang berjudul: AKTIVITAS SITOTOKSIK EKSTRAK METANOLIK DAUN ROSEMARY (Rosmarinus officinalk L.) TERIIADAP SEL KANKER PAYUDARA T4TD MELALUI REGULASI EKSPRESI RESEPTOR ESTROGEN-a (ERc) beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan hak kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta untuk menyimpan, mengalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pangkalan data, mendistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikannya di internet dan media lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta ijin dari saya maupun memberikan royalti kepada saya selama tetap mencantumkan nama saya sebagai penulis. Demikian pernyataan ini saya buat dengan sebenarnya. Dibuat di Yogyakarta Pada tanggal : 2 Maret 2015 Yang menyatakan (ClaraDewi Anggraeni) VI PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI PRAKATA Puji syukur pada Tuhan Yesus Kristus atas berkat dan rahmat-Nya yang melimpah, sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “Aktivitas Sitotoksik Ekstrak Metanolik Daun Rosemary (Rosmarinus officinalis L.) terhadap Sel Kanker Payudara T47D melalui Regulasi Ekspresi Reseptor Estrogen-α (ERα)” dengan baik. Skripsi ini disusun untuk memenuhi salah satu persyaratan memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) program studi Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Penulis menyadari bahwa pelaksanaan dan penyusunan skripsi ini tidak lepas dari bantuan dan campur tangan dari berbagai pihak. Oleh karena itu, pada kesempatan yang indah ini penulis hendak mengucapkan terima kasih kepada: 1. Ibu Aris Widayati, M.Si., Ph.D., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma. 2. Ibu Agustina Setiawati, M.Sc., Apt. selaku Dosen Pembimbing dan Dosen Penguji Skripsi ini serta selaku Kepala Laboratorium Fakultas Farmasi, atas bimbingan, bantuan, dukungan, kesabaran, dan motivasi selama pelaksanaan dan penyusunan skripsi juga ijin yang diberikan sehingga penulis dapat menggunakan sarana dan prasarana untuk kepentingan skripsi ini. 3. Bapak Enade Perdana Istyastono, Ph.D., Apt. selaku Dosen Penguji Skripsi dan telah memberikan saran kepada penulis. 4. Ibu Damiana Sapta Candrasari, S.Si., M.Sc. selaku Dosen Penguji Skripsi dan telah memberikan saran kepada penulis. 5. Bapak Ipang Djunarko, M.Sc., Apt. selaku Dosen Pembimbing Akademik yang sudah memberi dukungan dengan sabar selama saya menempuh studi. 6. Seluruh Dosen dan Karyawan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma atas ilmu, arahan, dan bimbingan yang dibagikan. ! vii PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 7. Prof. dr. Supargiyono, Ibu Rumbi dan Ibu Juju selaku Supervisor dan Teknisi Laboratorium Parasitologi Fakultas Kedokteran Umum Universitas Gadjah Mada Yogyakarta yang telah membantu dan membimbing selama pelaksanaan penelitian penulis dengan sabar. 8. Keluarga terkasih, Papa Aloysius Bekti Subagyo, Mama Ambrosia Sariningsih, Mbak Erika Sariputranti, Mas Christian John Phillips Willy Resubun, Kakak Felisitas Kanyamurti, Cyrillus Dirga Sakti Adhyastha Resubun atas segala bantuan dalam bentuk materi dan moril, kepercayaan, dukungan dan doa yang tiada henti sehingga penulis dapat menyelesaikan studi dengan tepat waktu dan dapat membanggakan keluarga. 9. Sahabat dari Tim Skripsi Pasti Sukses yaitu Andung Panjalu dan Winda Sekarjati yang telah mengerahkan segala pikiran dan usaha dengan penuh semangat agar dapat mengenakan toga bersama tepat waktu. 10. Teman-teman FSM C 2011 dan FST B 2011 atas kebersamaan yang indah dalam perjuangan ini. 11. Rekan, kerabat, dan sahabat yang tidak dapat saya sebutkan satu per satu sejak bangku sekolah hingga saat ini atas bantuan dan penghiburannya yang hangat. Penulis menyadari masih banyak kekurangan dalam penyusunan skripsi ini, sehingga membutuhkan saran dan kritik yang membangun untuk perubahan yang lebih baik. Semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi pembaca. Yogyakarta, 2 Maret 2015 Penulis ! viii PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI DAFTAR ISI HALAMAN JUDUL ................................................................................................ i HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ..................................................... ii HALAMAN PENGESAHAN ................................................................................ iii HALAMAN PERSEMBAHAN............................................................................. iv PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ..................................................................v LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN ...................................................... vi PRAKATA ............................................................................................................ vii DAFTAR ISI .......................................................................................................... ix DAFTAR TABEL ................................................................................................. xii DAFTAR GAMBAR ........................................................................................... xiii DAFTAR LAMPIRAN ........................................................................................ xvi INTISARI ............................................................................................................ xvii ABSTRACT ......................................................................................................... xviii BAB I. PENGANTAR .............................................................................................1 A. Latar Belakang .............................................................................................1 1. Rumusan Masalah ............................................................................3 2. Keaslian Penelitian ...........................................................................3 3. Manfaat Penelitian ...........................................................................4 B. Tujuan Penelitian .........................................................................................4 1. Tujuan Umum ..................................................................................4 2. Tujuan Khusus .................................................................................4 ! ix PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA......................................................................5 A. Kanker dan Karsinogenesis ..........................................................................5 B. Kanker Payudara ..........................................................................................7 C. Model Sel Kanker Payudara ........................................................................8 D. Reseptor Estrogen-α dan Tamoxifen ...........................................................9 E. Apoptosis dan Nekrosis..............................................................................11 F. Uji Sitotoksik .............................................................................................15 G. Annexin V Fluos ........................................................................................17 H. Imunositokimia ..........................................................................................18 I. Tanaman Rosemary dan Ekstrak Metanol Daun Rosemary ......................19 J. Landasan Teori ...........................................................................................21 K. Hipotesis .....................................................................................................22 BAB III. METODE PENELITIAN........................................................................23 A. Jenis dan Rancangan Penelitian .................................................................23 B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional ............................................23 1. Variabel Utama ..............................................................................23 2. Variabel Pengacau ..........................................................................23 3. Definisi Operasional.......................................................................24 C. Bahan Penelitian.........................................................................................25 D. Alat Penelitian ............................................................................................25 E. Tata Cara Penelitian ...................................................................................26 1. Pengumpulan Tanaman ..................................................................26 2. Determinasi Tanaman ....................................................................26 ! x PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 3. Penyiapan Simplisia .......................................................................26 4. Ekstraksi Simplisia Daun Rosemary ..............................................27 5. Panen Sel ........................................................................................28 6. Preparasi Larutan Uji .....................................................................28 7. Pengujian Viabilitas Sel dengan Metode MTT ..............................28 8. Pengujian Apoptosis Sel dengan Metode Annexin V Fluos ..........29 9. Pengujian Ekspresi ERα dengan Metode Imunositokimia ............30 F. Tata Cara Analisis Hasil.............................................................................31 1. Analisis Nilai IC50 .........................................................................31 2. Analisis Apoptosis Sel ...................................................................31 3. Analisis Ekspresi ERα ..................................................................31 BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ..............................................................33 A. Determinasi Tanaman dan Ekstraksi Daun Rosemary ...............................33 B. Uji Sitotoksik Ekstrak Metanol Daun Rosemary dengan Metode MTT ....35 C. Pengujian Apoptosis Sel dengan Metode Annexin V Fluos ......................39 D. Pengujian Ekspresi ERα dengan Metode Imunositokimia .......................42 BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN ................................................................48 A. Kesimpulan ................................................................................................48 B. Saran ...........................................................................................................48 DAFTAR PUSTAKA ............................................................................................49 LAMPIRAN ...........................................................................................................54 BIOGRAFI PENULIS ...........................................................................................61 ! xi PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI DAFTAR TABEL Tabel 1. Hasil Uji Sitotoksik .............................................................................36 Tabel 2. Hasil Uji Apoptosis Dengan Metode Annexin V Fluos ......................40 Tabel 2. Hasil Uji Imunositokimia ....................................................................43 ! xii PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI DAFTAR GAMBAR Gambar 1. Skema signaling ERα ....................................................................10 Gambar 2. Tiga jalur utama apoptosis ..............................................................12 Gambar 3. Proses apoptosis..............................................................................13 Gambar 4. Proses nekrosis ...............................................................................14 Gambar 5. Mekanisme reaksi pada pembentukan kristal formazan .................16 Gambar 6. Tanaman rosemary .........................................................................19 Gambar 7. Skema ekstraksi simplisia daun rosemary ......................................27 Gambar 8. Struktur senyawa dalam ekstrak dan ligan ERα .............................34 Gambar 9. Kristal formazan yang terbentuk pada uji MTT .............................35 Gambar 10. Hasil uji sitotoksik ..........................................................................37 Gambar 11. Hasil uji Annexin V Fluos ..............................................................40 Gambar 12. Hasil uji imunositokimia ................................................................43 ! xiii PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI DAFTAR LAMPIRAN Lampiran 1. Sertifikat determinasi tanaman rosemary .......................................55 Lampiran 2. Seri kadar ekstrak metanol daun rosemary dan tamoxifen .............56 Lampiran 3. Hasil analisis IC50 ekstrak dengan Program R ..............................57 Lampiran 4. Hasil analisis IC50 tamoxifen dengan Program R ...........................58 Lampiran 5. Lapang pandang preparat ekstrak dan tamoxifen ...........................59 Lampiran 6. Lapang pandang preparat kontrol sel..............................................60 ! xiv PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI INTISARI Kanker payudara merupakan penyakit yang kompleks dan heterogen. Penyakit ini terus berkembang dan diperkirakan dalam 20 tahun ke depan insidensinya meningkat. Kanker payudara memiliki karakter ekspresi berlebih reseptor estrogen alfa (ERα) yang dapat dihambat dengan pengobatan standar yaitu tamoxifen. Dewasa ini muncul efek samping dan resistensi terhadap pengobatan tamoxifen. Oleh sebab itu dibutuhkan agen kemoprevensi kanker payudara yang selektif terhadap ERα. Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui efek pemberian ekstrak metanol daun rosemary (Rosmarinus officinalis L.) terhadap model sel kanker payudara T47D yang dapat mengekspresikan ERα. Pengujian awal dilakukan untuk mengetahui viabilitas sel dengan metode 3-[4,5-Dimethylthiazol-2-Yl]-2,5 Diphenyl Tetrazolium Bromide (MTT). Kemampuan apoptosis ekstrak diuji dengan metode Annexin V Fluos dan uji imunositokimia untuk mengetahui kemampuan penekanan ekstrak terhadap ekspresi ERα sel T47D. Ekstrak metanol daun rosemary menunjukkan efek sitotoksik dengan nilai IC50 13,95 !g/mL yang dihitung secara statistik dengan Program R. Ekstrak metanol daun rosemary dapat menginduksi apoptosis 19,68%, nekrosis 77,33%, dan dapat menekan ekspresi ERα 91-93% pada sel T47D. Kata kunci: ! Daun rosemary, Rosmarinus officinalis L., kanker payudara, T47D, ERα. xv PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI ABSTRACT Breast cancer is a complex and heterogeneous disease. This disease is rapidly grow and predicted in the next 20 years the incidence increases. Breast cancer has overexpression of estrogen receptor alpha (ERα) characteristic that can be inhibited by a standard treatment, tamoxifen. Today tamoxifen treatment arises side effect and resistance problem. Therefore chemoprevention agent for breast cancer selective ERα is highly needed. This study was conducted to determine the effect of the methanol extract of rosemary (Rosmarinus officinalis L.) against T47D breast cancer cells model that express ERα. Preliminary study was conducted to determine cell viability by 3-[4,5-dimethylthiazol-2-Yl]-2.5 Diphenyl Tetrazolium Bromide (MTT). Furthermore, apoptosis cells were assayed by Annexin V Fluos and immunocytochemistry to know suppression abilty of rosemary methanol extract againts ERα expression. Methanol extract of rosemary leaves showed a cytotoxic effect with IC50 13,95 !g/mL which calculated statistically by R program. Rosemary methanol extract induced apoptosis 19,68%, necrosis 77,33%, and suppressed ERα expression to 91-93%. Keywords: ! Rosemary leaves, Rosmarinus officinalis L., breast cancer, T47D, ERα. xvi PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI BAB I PENGANTAR A. Latar Belakang Kanker payudara merupakan keganasan non-kulit yang sering terjadi pada wanita. Wanita yang hidup hingga usia 90 tahun memiliki kemungkinan satu dari delapan mengidap kanker payudara. Pada tahun 2001, hampir 240.000 wanita didiagnosis kanker payudara, dan lebih dari 40.000 meninggal akibat penyakit ini. Jumlah wanita penderita kanker payudara diperkirakan meningkat tiga kali lipat dalam 20 tahun ke depan (Kumar, dkk., 2004). Pengobatan kanker payudara yang berkembang dewasa ini terbagi atas terapi locoregional, kemoterapi dan kanker payudara triple negatif, dan terapi bertarget reseptor estrogen (Sledge, dkk., 2014). Pengobatan kanker payudara tidak selalu berhasil pada tiap subjek dikarenakan faktor heterogenisitas tingkat genetik. Semakin kompleksnya arah perkembangan kanker payudara dapat memunculkan resistensi terhadap pengobatan yang tersedia (Roche dan Vahdat, 2010). Maka dibutuhkan agen kemoprevensi untuk mencegah berkembangnya kanker payudara sedini mungkin. Perilaku pencegahan penyakit melalui makanan, bahan tambahan, mikronutrien dan senyawa alami terus dikembangkan. Perilaku ini disebut kemoprevensi dan substansi yang digunakan disebut agen kemopreventif. Kemoprevensi merupakan penggunaan 1 agen alami atau sintesis yang PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI ! 2 membalikkan, menghambat, atau mencegah perkembangan kanker. Tujuan utama dari kemoprevensi adalah menunda terjadinya kanker dan juga menurunkan angka kejadiannya. Kemopreventif yang berhasil membutuhkan penggunaan agen yang mampu menghambat tahapan molekuler spesifik pada jalur karsinogenesis. Studi selama empat dekade terakhir menunjukkan bahwa agen kemopreventif alami dan sintetis mampu menghambat karsinogenesis melalui dua jalur utama yaitu menginhibisi aktivasi karsinogen dan induksi enzim pemetabolisme xenobiotik sehingga dapat melindungi dari efek toksik lingkungan. Di samping itu, agen kemopreventif memiliki target molekuler seperti protein yang terlibat dalam progresi dan proliferasi siklus sel, protein anti apoptosis, transport obat; multi drug resistance (MDR); multi-drug resistance-related protein (MRP), jalur faktor pertumbuhan, jalur aktivasi NF-!B, angiogenesis, protein inflamasi seperti COX2 (Sharma, 2012). Daun rosemary berpotensi untuk dikembangkan sebagai agen kemopreventif pada kanker payudara. Abe dkk. (2002) berhasil mengekstraksi daun rosemary menggunakan pelarut metanol dan menganalisis kandungan kimianya antara lain asam betulinat, asam oleanolat, dan asam ursolat. Menurut hasil studi penelitian Bishaye dkk. (2011) asam betulinat pada T47D dan asam ursolat pada MCF-7 memiliki aktivitas antiproliferatif dan induksi apoptosis, dan menurut Liu dkk. (2014) asam oleanolat pada MCF-7 juga memiliki efek yang sama. Beberapa penelitian telah membuktikan aktivitas antikanker komponen dalam ekstrak metanol daun rosemary pada MCF-7 atau T47D akan tetapi uji aktivitas sitotoksik ekstrak metanol daun rosemary pada sel T47D sebagai model ! PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 3 kanker payudara belum pernah dilakukan. Pada penelitian ini, dilakukan penelusuran mekanisme molekuler aktivitas sitotoksik ekstrak metanol daun rosemary terhadap sel T47D. Sel kanker payudara T47D yang merupakan golongan luminal A banyak digunakan karena mengekspresikan ER α yang berlebih, sehingga ideal untuk penelitian ini (Holliday dan Speirs, 2011). Dengan demikian, diharapkan penelitian ini dapat memberikan kontribusi dalam penemuan agen kemopreventif bagi kanker payudara. 1. Rumusan masalah Apakah ekstrak metanol daun rosemary (Rosmarinus officinalis L.) mempunyai aktivitas sitotoksik, induksi apoptosis, dan berpengaruh terhadap ekspresi protein ERα terhadap sel kanker payudara T47D serta berapa IC50 ekstrak tersebut? 2. Keaslian penelitian Penelitian ekstrak metanol daun rosemary (Rosmarinus officinalis L.) yang pernah dilakukan adalah “Inhibitory Effects of Rosemary Extracts, Carsonic Acid and Rosmarinic Acid on the Growth of Various Human Cancer Cell Lines” oleh Ozlem Yesil-Celiktas, Canan Sevimli, Erdal Bedir, Fazilet Vardar-Sukan (2010). Daun rosemary diekstraksi dengan supercritical CO2 menggunakan metanol, senyawa aktif yang ditemukan adalah asam karsonik dan asam rosmarinik diujikan pada NCI-H82, DU-145, Hep-3B, K-562, MCF-7, PC-3, MDA-MB-231 dengan metode MTT. Ekstrak metanol daun rosemary dinyatakan berpotensi sebagai kandidat antikanker. ! PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 4 Sejauh penelusuran pustaka yang dilakukan peneliti, penelitian tentang Uji Aktivitas Ekstrak Metanolik Daun Rosemary (Rosmarinus Officinalis L.) terhadap Sel Kanker Payudara T47D melalui Regulasi Ekspresi Reseptor Estrogen-α (ERα) belum pernah dilakukan. 3. Manfaat penelitian a. Manfaat Teoretis. Penelitian ini dapat bermanfaat bagi pengembangan ilmu pengetahuan khususnya ilmu kefarmasian mengenai informasi tentang kemopreventif terkait ekstrak metanol daun rosemary (Rosmarinus officinalis L.), sehingga dapat pula menjadi sumber acuan yang dapat digunakan untuk penelitian selanjutnya. b. Manfaat Praktis. Penelitian ini diharapkan dapat membuktikan secara ilmiah khasiat dari ekstrak metanol daun rosemary (Rosmarinus officinalis L.) yang berpengaruh pada viabilitas, induksi apoptosis, dan mendeteksi ekspresi protein sel kanker payudara T47D. B. Tujuan Penelitian 1. Tujuan umum Penelitian ini bertujuan untuk membuktikan ekstrak metanol daun rosemary (Rosmarinus officinalis L.) memiliki aktivitas sebagai agen kemopreventif. 2. Tujuan khusus Mengetahui kemampuan ekstrak metanol daun rosemary (Rosmarinus officinalis L.) untuk menginduksi sitotoksik, apoptosis, dan mempengaruhi ekspresi ERα sel kanker payudara T47D, serta nilai IC50 ekstrak tersebut. ! PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI ! BAB II PENELAAHAN PUSTAKA A. Kanker dan Karsinogenesis Kanker dikarakterisasi oleh pertumbuhan yang tidak terkontrol dan akuisisi metastatik. Pada banyak kasus, aktivasi onkogen dan atau deaktivasi gen tumor supresor mengarah pada progresi siklus sel yang tidak terkendali dan mekanisme inaktivasi apoptosis. Pada tumor ganas terjadi penurunan afinitas antar jaringan spesifik ikatan sel-sel dengan reseptor dan peningkatan jumlah reseptor pergerakan sel. Aktivasi membran metalloprotease membuka jalur fisik metastatik persebaran sel kanker yang semakin lebar. Perubahan genetik yang terjadi antara lain mutasi, translokasi dan delesi kromosom, disregulasi ekspresi atau aktivitas jalur sinyal. Studi terkini menyebutkan bahwa perubahan epigenetik merupakan ciri kanker karena sifatnya sebagai sel pencetus kanker dan inisiator karsinogenesis (Sarkar, dkk., 2013). Proses karsinogenesis diawali dengan tahap inisiasi neoplasia di mana perubahan yang tidak terbalikan terjadi pada sel somatik. Inisiasi terjadi karena adanya ketidakstabilan sel yang disebabkan oleh paparan karsinogen sehingga terjadi mutasi pada gen dan terbentuk neoplastik. Aktivasi onkogen berperan penting dalam transformasi neoplastik, seperti mutasi gen tumor menyebabkan perubahan respon seluler yang mengacu pada disregulasi gen pada jalur kontrol sinyal biokimia sehingga terjadi gangguan 5! proses alami komunikasi, PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 6 perkembangan, dan diferensiasi sel. Sel yang mengalami transformasi akan terus membelah diiringi dengan mutasi lanjutan sebelum manifestasi lesi ganas (Devi, 2005). Tahap kedua karsinogenesis adalah promosi di mana sel yang mengalami transformasi terstimulasi untuk melakukan proliferasi lebih lanjut hingga muncul ketidakseimbangan seluler. Tahap ini membutuhkan transformasi yang didorong oleh paparan karsinogen dalam jangka panjang. Ketiga adalah progresi, atau biasa disebut konversi sel pre-neoplastik. Sel pre-neoplastik bertransformasi ke tahap perkembangan keganasan, diikuti oleh akumulasi mutasi gen dan luasnya klon sel pre-neoplastik (Devi, 2005). Tahap keempat adalah angiogenesis tumor, pertumbuhan tumor perlu didukung oleh faktor pertumbuhan dan pembuangan molekul toksik yang efisien juga asupan darah yang mencukupi. Faktor pendukung tersebut disalurkan oleh pembuluh darah, akan tetapi pembuluh darah pada jaringan normal dan tumor berbeda. Pembuluh tumor sering melebar, saccular dan berliku-liku dapat pula mengandung sel-sel tumor dalam lapisan endotel pembuluh. Aliran darah di tumor mungkin lebih lambat dibandingkan dengan jaringan normal yang berdekatan dan mikrovaskuler tumor dapat menunjukkan hiperpermeabilitas protein plasma. Tahap kelima adalah metastasis tumor, ketika progresi tumor terus berkembang, sel akan terlepas dari massa tumor dan menginvasi jaringan terdekat. Sel yang lepas tersebut juga akan masuk ke dalam sirkulasi darah dan limfa sehingga masuk ke jaringan atau organ lain kemudian berkembang. Hal ini menyebabkan metastase yang jauh, menghasilkan kanker yang menyebar luas (Devi, 2005). ! PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI B. 7 Kanker Payudara Kanker payudara dapat muncul akibat akumulasi kerusakan genetik. Beberapa gen bertanggung jawab terhadap sebagian besar kanker payudara herediter, tapi banyak gen predisposisi bertanggung jawab terhadap kasus sporadik. Mutasi yang terjadi pada gen predisposisi seperti p53, BRCA1 dan BRCA2 yang cenderung bertindak melalui perbaikan DNA mempengaruhi kestabilan gen. Studi mengenai kanker sporadis menyatakan bahwa abnormalitas genetik yang luas terlibat dalam perkembangan penyakit kanker payudara (Mallon, dkk., 2000). Subtipe molekuler kanker payudara yang dikenal baik adalah luminal, dengan cirinya yaitu sensitif terhadap hormon estrogen maupun progesteron. Subtipe luminal dapat dibagi menjadi dua yaitu luminal A dan luminal B. Secara prognosis subtipe luminal B dapat dikenali dengan ko-ekspresi HER2 selain ER dan PR, berlawanan dengan luminal A yang HER2 negatif. Subtipe molekuler berhubungan dengan tumor lokal yang kambuh, respon terhadap pengobatan sistemik neoadjuvant, pola metastatik dan kelangsungan hidup sel kanker. Subtipe molekuler dapat dihubungkan dengan perbedaan faktor resiko, sehingga dapat mengidentifikasi perbedaan biologis proses neoplastik dengan bermacam tindakan klinis dan reaksi pengobatan. Faktor molekuler yang memiliki peran pada perkembangan sel kanker payudara yang telah diketahui dan berpotensi menjadi target pengobatan adalah fascin, matrix metalloproteinase-1, cyclooxygenase-2, interleukin, p53, p27, dan apoptosis-related factors seperti Bcl-2 (Strumfa, dkk., 2012). ! PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI C. 8 Model Sel Kanker Payudara Model sel kanker yang dikulturkan memberikan keuntungan pada penelitian kanker yaitu populasi yang relatif homogen dan mampu bereplikasi pada media kultur standarnya. Profil kanker payudara dengan ekspresi gen dan imunohistokemikal reseptor estrogen alfa (ERα), reseptor progesteron (PR), dan HER2 dapat diklasifikasikan menjadi beberapa subtipe yaitu luminal A (MCF-7, T47D), luminal B (BT474, ZR-75), HER2 (SKBR3, MDA-MB-453), basal (MDA-MB-468) dan normal (MDA-MB-231) (Holliday dan Speirs, 2011). Kultur sel kanker payudara manusia mampu memberikan pedoman yang sangat baik untuk penelitian kanker payudara dalam perkembangan dan pengobatan tumor. Model sel kanker payudara yang dapat mengekspresikan ERα adalah MCF-7 dan T47D. Sel ini biasa digunakan untuk uji in vitro dan in vivo pada analisis gen, protein fungsional, dan uji efektivitas inhibitor. MCF-7 menggunakan media kultur DMEM, sifatnya resisten terhadap doxorubicin, mengekspresikan Bcl-2 berlebih akan tetapi tidak mengekspresikan caspase 3 (Adjo Aka and Lin, 2012). Sel kanker payudara T47D mengekpresikan reseptor estrogen nukleus, yang diperlukan bagi sel untuk mengaktifkan gen penting tertentu dalam pertumbuhan dan replikasi. Estrogen termasuk dalam hormon seks yang terdiri dari estradiol, estriol, dan estrone. Hormon-hormon ini mampu menembus membran sel sehingga dapat berdifusi langsung ke nukleus. Estrogen yang masuk ke nukleus berikatan dengan reseptor estrogen membentuk reseptor dimer. Sisi aktif reseptor kemudian berikatan dengan sisi spesifik pada DNA yang dapat ! PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 9 menaikkan atau menurunkan ekspresi gen tergantung pada peran faktor transkripsi sisi aktif. T47D mengekspresikan protein p53 yang termutasi akan tetapi sel ini sensitif terhadap doxorubicin (Neumann dan Rossi, 2012). D. Reseptor Estrogen-! dan Tamoxifen Kanker payudara adalah penyakit heterogen, akan tetapi hampir 70% dari penyakit ini adalah reseptor estrogen positif. Reseptor estrogen (ER) mendorong pertumbuhan tumor dalam rangka respon terhadap ligannya yaitu estrogen. Ekspresi ER mengindikasikan tingkat estrogen dependence dari kanker payudara. Terapi endokrin merupakan terapi efektif kanker payudara ER-positif, yang dicapai dengan antagonisasi ligan yang berikatan dengan ER (tamoxifen dan selective estrogen receptor modulator lainnya), menurunkan regulasi ER (fulvestrant) atau menghentikan biosintesis estrogen (inhibitor aromatase dan luteinizing hormone-releasing hormone agonists) (Tokunaga, dkk., 2014). Ada dua bentuk reseptor estrogen yang dibedakan berdasarkan kode genetiknya yaitu ERα dan ERβ. ERα bertanggung jawab pada proses estrogeninduces mitogenic signaling sel epitel pada payudara, uterus, dan ovarium, selain itu juga berperan dalam inisiasi dan progresi kanker payudara (Tokunaga, dkk., 2014). Tamoxifen telah banyak digunakan sebagai pengobatan kanker payudara, melalui kemampuannya menghambat ikatan antara estrogen dengan reseptornya sehingga proliferasi sel yang diinduksi oleh mekanisme ini dapat dihambat (Jordan, 2006). Tamoxifen bekerja sebagai inhibitor kompetitif ikatan estrogen dengan ERα, selain itu secara langsung dapat menginduksi apoptosis (Criscitiello, ! PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 10 dkk., 2011). Pada awalnya tamoxifen digunakan sebagai pengobatan tambahan setelah tindakan medis seperti pembedahan , tapi seiring berkembangnya waktu juga digunakan sebagai pengobatan kanker payudara (Jordan, 2006). Gambar 1. Skema signaling ER! (Tokunaga, dkk., 2014) Gambar 1 memaparkan estradiol berikatan dengan ERα sehingga ERα mengalami perubahan konformasi dan membentuk dimer. Dimer ER α ini berikatan dengan rangkaian estrogen response element (ERE) dalam promoter gen target dan menarik kompleks ko-faktor (ko-aktivator dan ko-represor). Fungsi klasik ERα adalah fungsi nukleusnya, yang disebut dengan aktivitas genomik. Gambar 1 juga menjabarkan ER α dapat langsung berikatan dengan faktor transkripsi lain seperti activator protein-1 (AP-1) dan specificity protein-1 (SP-1) pada situs spesifiknya di DNA. Jalur sinyal ERα juga diregulasi oleh reseptor membran tirosin kinase (RTK). RTK mengaktivasi jalur sinyal seperti jalur PI3K/Akt dan jalur mitogen-activated protein kinase (MAPK) yang kemudian ! PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 11 menyebabkan fosforilasi ERα dan mengarah pada aktivasi ERα (Tokunaga, dkk., 2014). Mekanisme lain diungkapkan oleh Liao dkk. (2014) di mana ekspresi ERα! yang tinggi dan ikatan 17-β-estradiol (E2) dengan ERα!menginduksi penekanan p53/p21 dan meningkatkan proliferating cell nuclear antigen (PCNA) dan proliferation-related Ki-67 antigen (Ki-67) yang berguna dalam induksi proliferasi sel kanker payudara. ERα memediasi proliferasi sel kanker payudara dengan meningkatkan miR-17 hingga membungkam ekspresi p21. E. Apoptosis dan Nekrosis Kematian sel terprogram atau programmed cell death (PCD) merupakan bagian dari apoptosis yang diperlukan sebagai mekanisme pelengkap pada proliferasi untuk memastikan homeostasis seluruh jaringan. Proses ini harus diregulasi dengan baik karena kegagalan pada apoptosis dapat mempengaruhi kelangsungan hidup sel dan dapat berkontribusi pada perkembangan sel neoplastik. Pengaruh pada kelangsungan hidup sel dapat menyebabkan ketidakstabilan gen dan akumulasi mutasi (Andreeff, dkk., 2000). Kematian sel yang terprogram dapat distimulasi oleh beberapa faktor seperti kurangnya asupan nutrisi, aktivasi reseptor kematian pada permukaan sel, senyawa kimia, radiasi ionisasi, kerusakan fisik secara langsung, dan karena sel T sitotoksik (Gambar 2). Berbagai macam stimulus dapat menyebabkan beberapa macam jalur apoptosis, akan tetapi mengarah pada satu jalur umum yaitu aktivasi caspase. Caspase adalah kelompok enzim yang terlibat dalam regulasi apoptosis. Dua jalur aktivasi caspase yang berbeda telah teridentifikasi. Pertama adalah jalur ! PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 12 ekstrinsik yang diinisiasi oleh aktivasi reseptor kematian yang terletak pada transmembran. Kedua adalah jalur intrinsik yang diaktivasi oleh stress seluler dan secara umum melibatkan pelepasan protein mitokondrial seperti sitokrom C. Ketiga adalah jalur perforin atau granzim (Bali, dkk., 2013). Gambar 2. Tiga jalur utama apoptosis (Bali, dkk., 2013) Apoptosis terhadap respon kerusakan DNA dapat diinduksi dalam jalur p53-dependent atau independent. DNA awal yang rusak menerjemahkan sinyal ke nukleus untuk melibatkan ataxia telangiectasia mutated (ATM) dan ataxia telangiectasia RAD3 related (ATR) protein kinases. Jalur sinyal p53-dependent menginduksi aktivasi transkripsional dari gen proapoptik seperti Bcl-2 associated X (BAX) dan Fas. Jalur sinyal p53-independent melibatkan aktivasi transkripsional p73 dan procaspases melalui faktor transkripsi E2F-1 dan aktivasi caspase-2 (Bali, dkk., 2013). ! PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 13 Reseptor kematian sel pada permukaan dari kelompok tumor necrosis factor-receptor (TNFR), seperti TNFR-1 dan kelompok diferensiasi Fas 95 (CD95) dapat mentranduksi sinyal apoptosis dengan melibatkan masing-masing ligannya atau antibodi spesifik. Stimulasi oleh Fas ligand (FASL) atau TNF-α menyebabkan trimerise reseptor kematian dan daerah sitoplasmik yang mati menarik protein adaptor sitoplasmik. Protein adaptor FAS adalah FAS associated death domain (FADD) dan untuk TNFR1 adalah TNFR associated death domain (TRADD). FADD dan TRADD menarik dan mengaktifkan caspase-8 sehingga dapat menginduksi caspase lainnya dan mengarah ke apoptosis (Bali, dkk., 2013). Gambar 3. Proses apoptosis (Schulze-Osthoff, 2008) Gambar 3 memaparkan apoptosis ditandai dengan perubahan morfologi nukleus, termasuk kondensasi kromatin dan fragmentasi. Secara keseluruhan sel mengalami pengerutan, blebbing membran plasma, dan terakhir akan membentuk badan apoptosis yang mengandung nukleus atau materi sitoplasmik (SchulzeOsthoff, 2008). Proses nekrosis (Gambar 4) secara morfologis ditandai dengan terjadinya pembengkakan sitoplasmik kemudian dilatasi organela yang menyebabkan vakuolisasi seluler dan rupturnya membran plasma, menghasilkan kebocoran proinflamator dari konten intraseluler (Schulze-Osthoff, 2008). ! PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 14 Disintegrasi* Gambar 4. Proses nekrosis (Schulze-Osthoff, 2008) Kondisi sel yang mengalami nekrosis mirip dengan sel yang mengalami apoptosis, tetapi terdapat perbedaan yaitu sel mengkerut dan menggerombol. Sel yang mengalami nekrosis akan membentuk fragmen dan terjadi pembengkakan, selain itu matriks mitokondria membentuk kumpulan agregat dan mengganggu membran sel bersamaan dengan pembentukan mielin. Nukleus terdegradasi terlebih dahulu, kemudian terjadi gumpalan kromatin dan mengarah pada kariolisis (Trump, dkk., 1997). Mekanisme yang terjadi pada proses nekrosis sel ada beberapa macam, pertama adalah jalur ATP. Penurunan jumlah ATP menyebabkan kerusakan sel secara cepat yang mengarah pada onkosis sehingga tidak ada pasokan energi untuk mengaktifkan kanal Na+K+ATPase pada membran sel yang menyebabkan peningkatan ion Na+ dan Cl- dan masuknya air sehingga sel membengkak, selain itu jumlah ion Ca+ meningkat cepat (Trump, dkk., 1997). Pada apoptosis jumlah ATP masih dapat dijaga lebih lama di tahap reversibel sehingga pompa Na+ dan pembengkakan sel dapat dihambat. Pengkerutan yang terjadi dapat disebabkan ! PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 15 oleh hilangnya ion K+ dan Cl- tapi terjadi peningkatan Ca2+ sehingga kanal K+ yang diaktivasi Ca+ dapat bekerja (Trump, dkk., 1997). Mekanisme nekrosis lainnya melalui regulasi volume dan ion sel yang ditandai dengan peristiwa onkosis di mana kendali pengaturan volume cairan hilang, hal ini dapat terjadi karena defisiensi ATP juga kerusakan langsung pada membran plasma. Telah disebutkan sebelumnya bahwa peningkatan ion Ca2+ dapat menyebabkan onkosis tapi pada beberapa sel dapat pula terjadi apoptosis, selain itu ion Ca2+ mempengaruhi transkripsi gen juga fungsi sitoskeletal (Trump, dkk., 1997). F. Uji Sitotoksik Kinerja, reprodusibilitas, dan kemampuan studi untuk diperbandingkan memerlukan kuantifikasi sel. Metode klasik yang dapat digunakan adalah perhitungan langsung menggunakan haemocytometer, dihubungkan dengan pewarnaan seperti triptan biru untuk membedakan sel hidup dan mati. Metode klasik ini memang mudah, murah, dengan jumlah sel yang sedikit akan tetapi masih bersifat subjektif. Dewasa ini telah banyak metode yang dikembangkan dan lebih sesuai seperti deteksi dengan pelabelan radiokromium, ATP selular, volume intraselular, pewarnaan spesifik, potensi redoks, uji turbiditas, kalorimetri, dan monitoring biomassa (Doyle dan Griffiths, 2000). Dalam penelitian ini digunakan metode pewarnaan spesifik yaitu 3-[4,5-Dimethylthiazol-2-Yl]-2,5 Diphenyl Tetrazolium Bromide (MTT). ! PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 16 Garam tetrazolium telah dikembangkan sebagai alat pengukuran warna secara kuantitatif untuk menentukan proliferasi dan kemampuan bertahan hidupnya sel. Uji ini mengukur jumlah sel yang hidup bukan sel yang mati, dan sinyal berasal dari derajat keaktifan masing-masing sel. Hasilnya dapat dibaca pada multiwell scanning spetrophotometer (ELISA reader) dan menunjukkan hasil dengan presisi tinggi. Metode ini dapat mengurangi proses pencucian yang tidak diperlukan sehingga mampu mengurangi waktu dan jumlah sampel yang diperlukan. Kelebihan metode ini adalah keakuratan dan kepresisiannya, juga minimnya gangguan radioisotop (Mosmann, 1983). ! Gambar 5. Mekanisme reaksi pada pembentukan kristal formazan (Talupula, 2011) MTT adalah uji reduksi tetrazolium untuk uji viabilitas sel homogen yang dikembangkan pada wadah dengan 96 lubang yang cocok untuk hasil pemilahan yang baik. Substrat MTT disiapkan dalam larutan pada kondisi fisiologis, ditambahkan ke dalam kultur sel, biasanya pada kadar 0,2–0,5 mg/mL, dan diinkubasi selama satu sampai empat jam. Jumlah formazan (yang sebanding langsung dengan jumlah sel yang hidup) diukur menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 570 nm. Sel yang hidup dengan metabolisme akif dapat mengubah MTT ke formazan berwarna ungu yang dapat dibaca absorbansinya. ! PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 17 Ketika sel mati tidak dapat mengubah MTT menjadi formazan, sehingga intensitas warna yang muncul spesifik untuk sel hidup (Riss, dkk., 2014). G. Annexin V Fluos Apoptosis tahap awal ditandai dengan tersebarnya sel tunggal sehingga tidak dapat dikenali lagi, dan pada tahap akhir badan apoptosis mengalami fagositosis cepat, proses ini terjadi hanya dalam beberapa jam. Perubahan pada permukaan sel apoptik seperti ekspresi sisi ikatan trombospondin, hilangnya residu asam sialik, dan paparan fosfatidilserin menjadi sulit dikenali. Fosfatidilserin adalah fosfolipid yang bermuatan negatif, yang biasanya muncul pada ujung membran berhadapan dengan sitosol. Paparan fosfatidilserin pada permukaan sel mengaktivasi platelet dan eritrosit tua, sel yang akan hancur oleh apoptosis (Vermes, dkk., 1995). Annexin V ditemukan sebagai protein pembuluh darah yang memiliki aktivitas kuat antikoagulan, sebagai keluarga multigen protein yang memiliki urutan yang berulang yang disebut loop endoxin. Annexin dapat berikatan dengan fosfolipid dengan bantuan Ca+. Annexin V berikatan secara spesifik terhadap fosfolipid seperti fosfatidilserin, yang biasanya tidak ada di luar permukaan membran plasma, dan menunjukkan ikatan minim dengan fosfolipid lain seperti fosfatidilkolin dan spingomielin yang ada di permukaan membran plasma (Vermes, dkk., 1995). Ketika kematian sel terjadi, fosfatidilserin berpindah ke permukaan membran (bagian terluar sel). Ini terjadi pada fase awal dari kematian sel akibat ! PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 18 apoptosis di mana membran sel masih utuh. Nekrosis di sisi lain, mengalami penurunan integritas membran dan kebocoran selular dari dalam sel ke lingkungan. Oleh sebab itu, pengukuran ikatan Annexin V diikuti dengan pewarnaan dapat memberikan pengukuran yang tepat untuk mendeteksi sel yang mengalami apoptosis dan membedakannya dari yang mengalami nekrosis (Vermes, dkk., 1995). H. Imunositokimia Imunohistokimia merupakan teknik untuk mendeteksi protein, antigen dalam jaringan dengan mendeteksi reaksi antigen antibodi dengan bantuan penanda. Pewarna fluoresen dan enzim adalah yang paling banyak digunakan. Metode pewarnaan jaringan ini disebut immunostaining. Proses yang mirip untuk mendeteksi antigen pada sel disebut imunositokimia. Langkah-langkah pengerjaan dalam imunositokimia ini adalah aktivasi antigen, blocking peroksidasi endogen, inkubasi antibodi primer, inkubasi antibodi sekunder, deteksi antibodi, counter stainning, dan penutupan slide. Blocking peroksidase endogen dapat mencegah reaksi tidak spesifik saat pewarnaan, larutan yang dipakai adalah hidrogen peroksidase. Pencucian dengan Phosphate Buffer Saline (PBS) penting dilakukan agar tidak ada reagen tersisa dari perlakuan sebelumnya. Inkubasi antibodi primer dilakukan untuk memberi waktu reaksi antara antibodi primer tidak berlabel dengan antigen, selanjutnya dilakukan inkubasi antibodi sekunder berlabel dapat memberikan warna pada reaksi yang terjadi di antigen antibodi jaringan atau sel. Counterstain menggunakan pewarna Mayer Hematoxylin yang memberi warna biru pada nukleus. Penutupan slide dilakukan ! PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 19 agar preparat yang sudah jadi bisa lebih tahan lama dengan menggunakan lem khusus antara kaca preparat, cover slip, dan penutup preparatnya. Pengamatan preparat dilakukan dengan menggunakan mikroskop (Prabin, dkk., 2009). I. Tanaman Rosemary dan Ekstrak Metanol Daun Rosemary Gambar 6. Tanaman Rosemary (Deymos, 2010) Rosemary merupakan herba dari famili Lamiaceae yang berasal dari daerah Mediterania. Klasifikasi rosemary adalah sebagai berikut: Kingdom : Plantae Subkingdom : Tracheobionta Superdivision : Spermatophyta Division : magnoliophyta Class : Magnoliopsida Subclass : Asteridae Order : Lamiales Family : Lamiaceae ! PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI Genus : Rosmarinus L. Species : officinalis Binominal name : Rosmarinus officinalis L. 20 (Begum, dkk., 2013). Tanaman rosemary terutama bagian daunnya dapat diekstraksi menggunakan pelarut metanol, menurut Abe dkk. (2002) dengan metode refluks sehingga dihasilkan empat fraksi yang telah dianalisis kandungan kimianya. Fraksi ketiga dianalisis lebih lanjut dan didapatkan hasil kandungan tiga jenis triterpen yaitu asam betulinat, asam oleanolat, dan asam ursolat. Asam ursolat yang dapat diisolasi dari daun rosemary (Rosmarinus officinalis L.) diketahui dapat menginduksi apoptosis melaui TNF-related apoptosis-inducing ligand (apoptosis diinduksi TRAIL) pada sel kanker dan JNKmediated upregulation of death receptor (DR) dan penurunan decoy receptor-2 (DcR2) sehingga mampu mempengaruhi kelangsungan hidup sel (Prasad, dkk., 2011). Asam ursolat pernah diujikan secara in vitro pada sel kanker payudara MCF-7 yang menunjukkan kemampuan sitostatik asam ursolat pada fase G1. Mekanisme yang diketahui mempengaruhi sinyal Ca2+ intrasel untuk menurunkan proliferasi sel (Neto, 2011). Asam betulinat yang diujikan secara in vitro pada sel kanker payudara MCF-7 menunjukkan aktivitas sitotoksik kemudian diujikan pada tikus athymic tanpa bulu yang dipapari dengan kanker payudara MCF-7 adenokarsinoma juga menunjukkan terjadinya penghambatan pembentukan tumor dan penurunan signifikan pada ukuran tumor. Pada analisis hispatologi tumor juga menunjukkan ! PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 21 penurunan angiogenesis, proliferasi dan invasi sel kanker pada hewan yang diberi perlakuan (Damle, dkk., 2013). Asam oleanolat dapat menekan glikolisis aerobik. Bentuk dimer pyruvate kinase muscle isoenzyme 2 (PKM2) mengakumulasi intermediet glikolitik dan menghubungkan ke biosintesis nukleotid dan asam amino, yang berkontribusi pada pertumbuhan sel. PKM2 banyak diekspresikan pada sel yang berproliferasi, seperti sel tumor. Dalam penelitian Liu dkk. (2014) pada sel kanker PC3 dan MCF-7 yang diberi asam oleanolat, dapat menurunkan ekspresi PKM2. J. Landasan Teori Kanker payudara terjadi akibat akumulasi kerusakan genetik, salah satunya adalah ekspresi berlebih ERα yang dapat mempengaruhi kestabilan gen ko-aktivator dan ko-supresor. Penelitian ini menggunakan model sel kanker payudara T47D karena kemampuannya mengekspresikan ERα. Ketika ERα berikatan dengan substratnya (estradiol) membentuk dimer yang dapat masuk ke nukleus dan berikatan dengan ERE untuk mempengaruhi ko-aktivator dan kosupresor. Kelebihan ekspresi ERα dapat menyebabkan penurunan transkripsi genetik untuk regulasi kematian sel dan meningkatkan gen penginduksi proliferasi. Tamoxifen merupakan pengobatan yang sering digunakan dalam terapi kanker payudara karena sifatnya selektif terhadap ER α . Tamoxifen dapat menghambat proliferasi sel sekaligus menginduksi apoptosis secara langsung, akan tetapi timbul permasalahan resistensi dan efek samping pada penderita ! PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 22 kanker payudara. Saat ini diperlukan solusi untuk mengatasi permasalahan dari pengobatan tamoxifen, maka dibutuhkan agen kemoprevensi yang diharapkan dapat mengatasinya, selain itu agar dapat menekan insidensi kanker payudara. Rosmarinus officinalis L. tanaman yang biasa disebut dengan rosemary telah lama dikenal dan diuji kemampuannya dalam mengatasi kanker payudara. Bagian yang digunakan adalah daun yang dapat diekstraksi menggunakan metanol dan diharapkan mengandung asam betulinat, asam oleanolat, dan asam ursolat. Ketiga senyawa tersebut ini telah diteliti terutama pada model sel kanker payudara MCF-7 yang juga mampu mengekspresikan ERα. Asam betulinat, asam oleanolat, dan asam ursolat dapat menghambat proliferasi dan menginduksi apoptosis sel kanker payudara MCF-7. Dengan demikian, daun rosemary berpotensial dikembangkan sebagai agen antikanker. Ekstrak metanol daun rosemary dalam penelitian ini diujikan ke model sel kanker payudara T47D dengan metode MTT untuk kuantifikasi kemampuan sitotoksik didukung oleh komputasi statistik Program R agar didapatkan nilai IC50 dari ekstrak. Kemampuan induksi apoptosis ekstrak metanol daun rosemary dikuantifikasi dengan metode Annexin V Fluos menggunakan alat flowcytometry dan dilakukan penelusuran mekanisme molekuler ekstrak pada ERα sel melalui uji semi kuantitatif imunositokimia. K. Hipotesis Ekstrak metanol daun rosemary (Rosemarinus officinalis L.) memiliki aktivitas sitotoksik terhadap sel kanker payudara T47D melalui induksi apoptosis dan regulasi ekspresi protein ERα. ! PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI ! BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis dan Rancangan Penelitian Penelitian ini termasuk dalam jenis penelitian eksperimental murni dengan rancangan penelitian acak lengkap pola searah. B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional Variabel-variabel yang terdapat pada penelitian ini, yaitu: 1. Variabel utama a. Variabel bebas. Variabel bebas dalam penelitian ini adalah variasi konsentrasi dalam pemberian ekstrak metanol daun rosemary (Rosmarinus officinalis L.) b. Variabel tergantung. Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah viabilitas sel (IC50), persentase sel apoptosis, dan level ekspresi protein ERα. 2. Variabel pengacau a. Variabel pengacau terkendali. Variabel pengacau terkendali dalam penelitian ini adalah kondisi sel uji, yaitu sel kanker payudara T47D. Bahan uji yang digunakan berupa daun rosemary, didistribusikan oleh Dipokusumo Farm (Rasamala A4, Semarang Kota 50189, Jawa Tengah, Indonesia) berasal dari kebun di Malang, Jawa Timur dipanen pada bulan Juni 2014. 23! PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 24 b. Variabel pengacau tak terkendali. Variabel pengacau tak terkendali dalam penelitian ini adalah usia tanaman, kondisi lingkungan, kontaminasi lingkungan, dan lama inkubasi. 3. Definisi operasional a. Ekstrak metanol daun rosemary (Rosmarinus officinalis L.) adalah serbuk hasil ekstraksi total daun rosemary menurut metode Abe dkk. (2002). b. Uji sitotoksik MTT adalah metode yang digunakan untuk mengetahui viabilitas sel atau jumlah sel yang masih hidup setelah pemberian ektrak metanol daun rosemary pada sel kanker payudara T47D. c. IC50 adalah konsentrasi ekstrak yang dapat mematikan 50% dari populasi sel kanker payudara T47D. d. Metode induksi apoptosis Annexin V adalah pengujian yang dilakukan untuk menginduksi apoptosis ekstrak metanol daun rosemary pada sel kanker payudara T47D. e. Imunositokimia adalah metode pengujian untuk mengetahui level ekspresi protein ER α pada sel kanker payudara T47D setelah pemberian ekstrak metanol daun rosemary. f. Level ekspresi ERα adalah persentase sel yang berwarna coklat pada sitoplasma dan atau nukleus sel kanker payudara T47D dalam tiga lapang pandang. ! PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI C. 25 Bahan Penelitian Senyawa uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah ekstrak metanol daun Rosmarinus officinalis L. Sel yang digunakan dalam pengujian ini adalah sel kanker payudara T47D yang didapat dari Laboratorium Parasitologi Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada. Bahan kimia yang digunakan adalah metanol pro analis (Merck), FBS (Fetal Bovine Serum) 10%, FBS 0.5%, Media Kultur Medium RPMI (Rosewell Park Memorial Institute) 1640 (Gibco), media kultur medium 199 (Gibco), Tripsin EDTA 0.25%, PBS (Phosphat Buffer Saline), Fungison (Gibco), Penisilin Streptomisin 1% v/v, akua bidestilata, etanol 96%, natrium bikarbonat, HEPES (N-2-Hidroxy Ethyl Piperazine-N-Ethane Sulfonic Acid), SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) 10% dalam HCl 0.01 N, DMSO (Merck) 0.5%, biru tripan, eter, etanol (CV. Labora), akuades, Nolvadex 20 mg (tablet kontrol tamoxifen), metanol 70%, reagen Annexin V Fluos (Roche), reagen MTT 5 mg/mL, primary monoclonal antibody antiER! (Thermo Fisher Scientific), biotinylated universal secondary antibody (Biocare), Mayer Hematoxylin (Dako), xylol, substrat DAB. D. Alat Penelitian Peralatan refluks, alat-alat gelas, mantel heater, waterbath, blender, rotary evaporator, incubator CO2, autoklaf, tangki nitrogen cair, alat-alat gelas steril, laminar air flow cabinet (LAF), mikroskop fase kontras, tissue culture flask, blue tip, yellow tip, neraca digital, mikropipet, mikroplate 96 sumuran, 24 sumuran, coverslip, ELISA reader, tabung conical 15 mL, tissue culture cluster ! PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 26 96, haemocytometer, mikroskop fluoresensi, kamera digital, mikroskop cahaya, sentrifuge, neraca digital, flowcytometry. E. 1. Tata Cara Penelitian Pengumpulan Tanaman Tanaman rosemary (Rosmarinus officinalis L.) didistribusikan oleh Dipokusumo Farm (Rasamala A4, Semarang Kota 50189, Jawa Tengah, Indonesia) berasal dari kebun di Malang, Jawa Timur dipanen pada bulan Juni 2014. Bagian yang digunakan hanya bagian daunnya. Daun yang dipilih adalah daun yang segar, berwarna hijau, dan bentuk yang masih utuh. 2. Determinasi Tanaman Tanaman rosemary ini didapatkan melalui distributor komersil maka diperlukan pemastian akan kebenaran tanaman yang digunakan. Sampel daun rosemary dideterminasi di Laboratorium Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Gadjah Mada. 3. Penyiapan Simplisia Daun rosemary dipetik kemudian dicuci bersih dibawah air mengalir. Daun dipotong-potong, dikeringkan di atas tampah ditutupi kain hitam diberi sirkulasi udara yang cukup dengan sinar matahari. Pengeringan pertama dilakukan dalam waktu tujuh hari, setelah tujuh hari daun rosemary dipilah, daun yang sudah kering (berwarna hijau kecoklatan dan mudah rapuh saat diremas) dari yang masih kurang kering. Daun yang kurang kering dilanjutkan dengan pengeringan dingin di dalam kulkas selama tujuh hari. Daun rosemary yang sudah kering, ! PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 27 dihaluskan menggunakan blender, serbuk disimpan dalam plastik clip yang diberi silika penjerap lembab dalam wadah tertutup di suhu ruang (Alfredo, 2012). 4. Ekstraksi Simplisia Daun Rosemary 7,3 g serbuk simplisia daun rosemary 1. 2. 3. 4. Ditambahkan metanol absolut 30 mL. Direfluks selama 30 menit. Proses refluks diulang tiga kali dengan penggantian pelarut. Campuran disaring lalu digabungkan. Gabungan ekstrak 1. Dipekatkan menggunakan rotary evaporator selama 5 menit. 2. Dikeringkan di atas waterbath pada suhu 800C hingga mencapai bobot tetap. Residu serbuk hijau tua Diambil 0,5 g 1. 2. 3. 4. Ditambahkan 10 mL metanol 60%. Divortex selama 1 menit. Disentrifugasi selama 15 menit dengan kecepatan 3000 rpm. Disaring, endapan yang tertahan dikumpulkan. Endapan 1. Ditambahkan 10 mL metanol absolut. 2. Disaring kemudian cairan dikumpulkan dan dipekatkan dengan rotary evaporator. 3. Dilanjutkan dengan pengeringan dengan waterbath pada suhu 800C sampai mencapai bobot tetap. Serbuk ekstrak metanol daun rosemary ! Gambar 7. Skema ekstraksi simplisia daun rosemary (Abe, dkk., 2002). ! ! PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 5. 28 Panen Sel Pada awalnya sel ditanam dan diinkubasi dalam cawan petri hingga konfluen, kemudian media kultur dibuang terlebih dahulu menggunakan mikropipet. Ke dalam cawan petri ditambahkan PBS untuk mencuci kemudian dibuang dan ditambahkan 0,5 mL tripsin secara merata dalam cawan petri, setelah itu ditutup dan didiamkan selama 3 menit hingga sel terlepas di dalam inkubator. Setelah 4 menit ditambahkan media RPMI lengkap, dicuplik sedikit diamati di bawah mikroskop dengan haemocytometer untuk menghitung jumlah sel yang diperlukan selama pengujian dengan: jumlah!sel!kuadran!1 + 2 + 3 + 4 10! × mL 4 Sejumlah sel terhitung yang diperlukan ditambahkan media RPMI hingga 10 mL dan dimasukkan sebanyak 100 !L ke dalam 96 well-plate untuk uji MTT, 2 mL ke dalam 6 well-plate untuk uji Annexin V Fluos, dan 1 mL ke dalam 24 well-plate dengan cover slip untuk uji imunositokimia, diinkubasi selama 24 jam hingga konfluen (CCRC, 2009). 6. Preparasi Larutan Uji Sepuluh miligram sampel dilarutkan dalam 100 !L DMSO kemudian dilakukan pengenceran ke seri konsentrasi yang diinginkan. Pada tahap pengenceran sampel, digunakan media kultur sebagai pelarutnya (CCRC, 2009). 7. Pengujian Viabilitas Sel dengan Metode MTT Sel yang telah diinkubasi selama 24 jam di dalam well-plate dan didapati telah konfluen dapat segera diberi perlakuan. Pertama media kultur dibuang terlebih dahulu kemudian diberi 100 !L!PBS, lalu dibuang. Ke dalam tiap lubang ! PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 29 diberi 100 !L sampel yang telah diencerkan, pada kolom kontrol sel cukup diberi media kultur sedangkan pada kolom kontrol media dapat dikosongkan saja, lalu diinkubasi selama 24 jam dalam inkubator CO2. Setelah inkubasi 24 jam, disiapkan larutan MTT yang telah dicampur dengan media kultur terlebih dahulu kemudian media kultur dalam well-plate dapat dibuang lalu diberi 100 !L PBS dan dibuang, ke dalam tiap lubang diberi 110 !L larutan MTT dan diinkubasi selama 4 jam. Setelah 4 jam ke dalam tiap lubang diberi 100 !L reagen stopper SDS kemudian diinkubasi di ruang selama 24 jam. Setelah inkubasi, dilakukan pembacaan absorbansi menggunakan ELISA Reader pada panjang gelombang 595 nm (CCRC, 2009). 8. Pengujian Apoptosis Sel dengan Metode Annexin V Fluos Uji apoptosis sel menggunakan metode annexin dilakukan dengan menanam sel (dengan populasi 500.000-1.000.000 sel/mL) sejumlah 2 mL kemudian diinkubasi selama 24 jam. Setelah konfluen, media kultur dibuang kemudian diberi 100 !L PBS lalu dibuang. Tiap lubang diberi sampel sebanyak 2 mL dan diinkubasi selama 24 jam. Setelah inkubasi, sel dalam tiap lubang diambil dengan mikropipet dipindahkan ke conical tube. Pada well-plate diberi 1 mL PBS, kemudian diambil lagi dan dimasukkan ke conical tube. Pada well-plate diberi 200 !L tripsin diinkubasi selama 3 menit, lalu dilihat dengan mikroskop apabila sel sudah terlepas diberi 1 mL media kultur dan ditampung lagi ke dalam conical tube. Conical tube disentrifugasi selama 4 menit dengan kecepatan 4000 rpm. Supernatan dibuang, sisa endapan diberi PBS dingin 1 mL kemudian resuspensi campuran dan dipindahkan ke dalam eppendorf sebanyak 1 mL. Campuran dalam ! PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 30 eppendorf disentrifugasi (5 menit, 5000 rpm). Tahap selanjutnya adalah preparasi reagen annexin pada eppendorf yang dibalut alumunium foil diisi dengan 550 !L buffer dan diberi 10 !L!annexin juga 10 !L propidium iodida. Eppendorf yang berisi sampel dibuang supernatannya kemudian diberi reagen 100 !L lalu diinkubasi 10 menit. Setelah inkubasi 10 menit diberi 300 !L buffer, dan sampel dianalisis mengunakan flowcytometry (CCRC, 2009). 9. Pengujian Ekspresi ER! dengan Metode Imunositokimia Pengujan imunositokimia dilakukan dengan menanam sel dalam 24 well- plate diberi cover slip (jumlah sel 500.000 sel/mL) sejumlah 1 mL. Setelah inkubasi 24 jam dan sel sudah konfluen, media kultur dibuang lalu diberi 500 !L PBS dan dibuang. Sel diberi perlakuan dengan memberikan 1 mL sampel dan diinkubasi 24 jam, setelah inkubasi cover slip diangkat dan dipindahkan ke kaca preparat. Cover slip diberi PBS lalu dibuang, dilakukan dua kali kemudian difiksasi menggunakan metanol 300 !L lalu dibuang dan diberi PBS. Cover slip diberi aquadest lalu dibuang (dilakukan dua kali), diberi hidrogen peroksida 100 !L!selama 10 menit lalu dibuang dan diberi PBS. Cover slip diberi larutan blocking 100 !L selama 10 menit lalu dibuang, diberi antibodi primer (ERα) 100 !L selama 1 jam setelah itu dibuang dan diberi PBS. Cover slip diberi antibodi sekunder 100 !L selama 20 menit lalu dibuang dan diberi PBS. Cover slip diberi HRP sebanyak 100 !L selama 10 menit kemudian dibuang dan diberi PBS, lalu diberi larutan DAB 100 !L diinkubasi 3 menit dan diberi aquadest lalu dibuang. Cover slip diberi 100 !L Hematoxylin selama 5 menit dan diberi aquadest lalu dibuang. Cover slip digenangi etanol absolut dan segera dibuang juga xylol dan ! PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 31 segera dibuang, preparat dikeringkan terlebih dahulu lalu diawetkan. Pengamatan dilakukan dengan mikroskop (CCRC, 2009). F. 1. Tata Cara Analisis Hasil Analisis nilai IC50 Menurut Doyle dan Griffiths (2000) nilai IC50 adalah konsentrasi yang menghambat pertumbuhan 50% populasi sel untuk mengetahui potensi sitotoksisitasnya. Data hasil ELISA reader berupa absorbansi (Abs) tiap sumuran dikonversikan dalam persentase kehidupan sel. Absorbansi kontrol pelarut dianggap sama dengan absorbansi kontrol sel maka persentase sel hidup dihitung dengan rumus: %viabilitas!sel = Abs!sel!dengan!perlakuan − Abs!kontrol!media ×100% Abs!kontrol!sel − Abs!kontrol!media Kemudian dihitung besar IC50 menggunakan program R antara log konsentrasi dengan persen viabilitas sel. 2. Analisis apoptosis sel Pengamatan kuantitatif dapat dilakukan dengan mengolah data hasil pembacaan flowcytometry dengan metode cellquest dan alat FACS Calibur. 3. Analisis ekspresi ER! Pengamatan semi kuantitatif dilakukan dengan mengambil foto tiga lapang pandang sel di bawah mikroskop. Tiga subjek independen menghitung sel yang berwarna coklat sebagai sel yang mengekspresikan ERα (positif) dan sel yang berwarna biru tidak mengekspresikan ERα (negatif). Sistem semi kuantifikasi mengikuti Vang dkk. (2006). ! PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI %ekspresi!ERα = sel!berwarna!coklat ×100% total!sel!satu!lapang!pandang Level ekspresi ERα ditentukan dengan: a. 0 = kurang dari 5% b. 1+ = 6% - 25% c. 2+ = 26% - 50% d. 3+ = 51% - 75% e. 4+ = 76% - 100% ! 32 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI ! BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas sitotoksik, kemampuan induksi apoptosis, dan ekspresi reseptor estrogen alfa (ERα) ekstrak metanol daun rosemary (Rosmarinus officinalis L.) pada sel kanker payudara T47D. Parameter aktivitas sitotoksik ekstrak metanol daun rosemary dievaluasi secara kuantitatif berdasarkan uji MTT dengan penurunan viabilitas sel dan didapatkan nilai IC50 ekstrak pada sel T47D. Kemampuan ekstrak metanol daun rosemary menginduksi apoptosis dikuantifikasi dengan uji Annexin V Fluos dan hasil didapat dengan menggunakan flowcytometry. Regulasi ekspresi ER α diidentifikasi dengan imunositokimia ditandai dengan jumlah sel yang positif (berwarna coklat), dengan metode semi kuantitatif didapatkan level ekspresi ERα. Penelitian ini menggunakan tamoxifen sebagai pembanding, karena dewasa ini digunakan sebagai terapi hormonal spesifik ERα untuk kanker payudara. A. Determinasi Tanaman dan Ekstraksi Daun Rosemary Penelitian ini menggunakan bahan uji berupa serbuk daun rosemary (Rosmarinus officinalis L.). Determinasi daun rosemary pada penelitian ini bertujuan untuk membuktikan bahwa tanaman yang digunakan memang benar tanaman yang dimaksud, yaitu tanaman Rosmarinus officinalis L. (Lampiran 1). Bagian tanaman yang digunakan untuk determinasi berupa daun. Hasil dari 33! PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 34 determinasi membuktikan bahwa tanaman tersebut benar merupakan tanaman Rosmarinus officinalis L. dan hasil determinasi terlampir. Penulis menggunakan metode ekstraksi refluks yang diambil dari jurnal Abe dkk. (2002). Metode ekstraksi dengan refluks biasa digunakan untuk mengekstraksi solid (pada penelitian ini adalah serbuk simplisia daun rosemary). Metode ini adalah cara alternatif yang cepat menggunakan pemanasan, sehingga pelarut yang dibutuhkan tidak terlalu banyak dan kehilangan substansi dapat dikendalikan karena pelarut yang diuapkan akan berkondensasi dan kembali mengekstrak simplisia. Pelarut yang digunakan harus dapat melarutkan senyawa yang diharapkan, memiliki titik didih lebih rendah dari senyawa target sehingga kerusakan senyawa target dapat dihindari. Metode refluks dapat digunakan pada metode ekstraksi daun rosemary karena senyawa target memiliki titik lebur yang tinggi yaitu sekitar 292-3000C dan metanol digunakan karena memiliki titik didih 64,50C sehingga dapat menguap dalam sistem refluks selain itu metanol diketahui dapat melarutkan senyawa target dengan baik. A B C D Gambar 8. Struktur senyawa dalam ekstrak (Abe, dkk., 2002) dan ligan ER! A. Asam Betulinat, B. Asam Oleanolat, C. Asam Ursolat, D. 17-!-Estradiol Penulis mengekstraksi 7,3 g serbuk daun rosemary dengan metanol dan didapatkan serbuk ekstrak metanol daun rosemary sebanyak 0,1507 g. Abe dkk. (2002) menyatakan bawah di dalam ekstrak ini didapatkan tiga komponen yaitu ! PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 35 asam betulinat, asam oleanolat, dan asam ursolat. Ekstrak metanol daun rosemary memiliki aktivitas antiproliferatif pada T47D diperkirakan disebabkan oleh kandungan asam betulinat, asam oleanolat, dan asam ursolat tersebut (Gambar 8). Gambar 8 menunjukkan kesamaan antara ketiga senyawa yang terdapat di dalam ekstrak metanol daun rosemary dengan ligan ERα, yaitu cincin aromatis satu; dua; tiga; dan gugus fungsi hidroksil pada cincin satu. B. Uji Sitotoksik Ekstrak Metanol Daun Rosemary dengan Metode MTT 3-[4,5-Dimethylthiazol-2-Yl]-2,5 Diphenyl Tetrazolium Bromide atau MTT adalah metode kolorimetrik standar yang digunakan untuk mengukur perubahan warna pada analisis proliferasi sel dan sitotoksik sel terhadap agen dengan kemampuan toksik dan medis. MTT adalah larutan berwarna kuning yang dapat berubah ke bentuk formazan yang tidak larut (Gambar 9). MTT direduksi oleh sel yang metabolismenya aktif ke formazan ungu oleh suksinat tetrazolium reduktase ke dalam enzim rantai pernapasan pada mitokondria. Formazan ungu dapat larut ketika diberi SDS sehingga dapat dibaca absorbansinya dan dihasilkan kurva yang berguna untuk mengetahui IC50 sampel. Gambar 9. Kristal formazan yang terbentuk pada uji MTT. (A). Sel T47D tanpa perlakuan, (B). Dengan pemberian tamoxifen 1 !", dan (C). Dengan pemberian ekstrak metanol daun rosemary (Rosmarinus officinalis L.) 30 !"/!" ! PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 36 Kelebihan metode ini adalah tidak bersifat radioaktif, bisa digunakan untuk berbagai jenis sel, dan analisis yang lengkap juga banyak dengan metode scanning spektrofotometer. Kekurangan metode ini adalah kurang sesuai untuk banyak jenis sel dalam satu waktu, beberapa sel yang tidak berproliferasi dapat memetabolisme MTT dan memberikan hasil, dan dapat memberikan hasil yang salah jika sel terkontaminasi oleh mikoplasma (Talupula, 2011). Atas dasar prinsip, kekurangan, dan kelebihannya metode ini sesuai untuk digunakan dalam analisis viabilitas sel kanker T47D yang diberi ekstrak metanol daun rosemary (Rosmarinus officinalis L.). No. 1 2 3 4 5 6 7 No. 1 2 3 4 5 6 Konsentrasi Ekstrak Daun Rosemary (!g/mL) 1 10 18 30 100 178 300 Konsentrasi Tamoxifen (!M) 0,01 0,1 1 10 100 1000 Tabel 1. Hasil Uji Sitotoksik % Viabilitas Sel 1 2 3 Rata2 Rata2±SD 98,643 118,323 123,413 113,460 113,460±13,082 91,687 89,651 85,918 89,085 89,085±2,925 33,494 34,681 32,645 33,607 33,607±1,023 10,420 10,590 8,723 9,911 9,911±1,032 -0,269 -0,608 -0,438 -0,438 -0,438±0,170 4,991 1,258 1,258 2,502 2,502±2,155 8,045 7,027 7,027 7,366 7,366±0,588 % Viabilitas Sel 1 2 3 Rata2 Rata2±SD 4,233 5,163 4,698 4,698 4,698±0,465 1,910 2,375 2,530 2,272 2,272±0,322 107,537 106,736 102,891 105,731 105,731±2,489 105,834 100,568 92,514 99,639 99,639±6,708 103,201 105,524 104,440 104,388 104,388±1,162 88,952 100,258 93,908 94,373 94,373±5,667 SD = Standar Deviasi ! PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 37 Pengukuran viabilitas sel T47D dilakukan untuk mengetahui jumlah sel yang masih hidup setelah pemberian ekstrak metanol daun rosemary. Data pengujian tersaji pada Tabel 1. Berdasarkan data yang disajikan di atas terlihat terjadi penurunan jumlah sel yang hidup seiring dengan bertambahnya konsentrasi ekstrak metanol daun rosemary, hal serupa juga terjadi pada sel kanker payudara T47D yang diberi tamoxifen. Kendala yang dialami selama penelitian adalah semakin besar konsentrasi sampel dapat mempengaruhi pembacaan absorbansi, dikarenakan kepekatan larutan sampel menyebabkan pembacaan yang salah sehingga yang terbaca bukan absorbansi jumlah sel yang masih hidup tetapi absorbansi sampel itu sendiri. A B sel mati C sel hidup D Gambar 10. Hasil uji sitotoksik. (A). Sel T47D yang normal tanpa perlakuan. (B). Sel T47D yang diberi tamoxifen 1 !", (C). Sel T47D yang diberi ekstrak metanol daun rosemary 30 !"/!" dan (D) 1 !"/!" ! ! ! PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 38 Sel kanker dapat diamati di bawah mikroskop dan terlihat bentuk sel kanker payudara T47D adalah elips. Kepadatan populasi antara sel yang diberi dengan yang tidak diberi perlakuan dapat dibandingkan yaitu antara kontrol sel dan perlakuan. Gambar 13 menunjukkan populasi sel pada konsentrasi sampel 1 !g/mL kepadatannya mendekati kontrol sel yang menandakan viabilitas sel masih tinggi. Pada konsentrasi 30!!g/mL populasi sel nampak berkurang kepadatannya. Perbedaan lain yang dapat ditemui adalah perubahan morfologi sel kanker T47D saat diberi perlakuan dengan tamoxifen dan ekstrak metanol daun rosemary. Sel T47D ketika diberi tamoxifen terbentuk gelembung-gelembung di dalam sel dan beberapa diantaranya berbentuk bulat gelap, dan pada sel kanker T47D yang diberi ekstrak metanol daun rosemary berbentuk bulat gelap. Sel yang mati akan berbentuk bulat dengan warna yang lebih gelap (Gambar 10).! Tujuan dari penentuan IC50 adalah untuk mendapatkan konsentrasi ekstrak metanol daun rosemary yang dapat mematikan setengah dari populasi sel yang ada. Penentuan IC50 menggunakan Program R, didapatkan hasil IC50 dari ekstrak metanol daun rosemary sebesar 13,95 !g/mL sedangkan untuk tamoxifen sebesar 37,64 !M (13,98 !g/mL). Hal ini menunjukkan kemampuan sitotoksik ekstrak metanol daun rosemary sama dengan tamoxifen. Penelitian ini menggunakan kurva sigmoid karena dapat menggambarkan fenomena yang terjadi di mana perubahan sekecil apapun terlihat sebagai respon terhadap rangsangan, sampai ambang tercapai yang menandai terjadinya transformasi dramatis hingga keadaan stabil tercapai dan tampak tidak responsif lagi atau tidak ada lagi perubahan yang berarti (Stock dan Bialy, 2003). Kurva sigmoid cocok digunakan ! PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 39 dalam penelitian ini agar interaksi yang terjadi antara sel kanker T47D dengan bahan uji terlihat jelas pengaruhnya hingga tercapai titik konstan dimana tidak ada lagi perubahan yang berarti. Program R merupakan sistem analisis komputasi dengan sumber yang terbuka gratis, bahasa program yang sederhana, dan dapat digunakan pada berbagai jenis komputer (Paula dan Arhipova, 2012). C. Pengujian Apoptosis Sel dengan Metode Annexin V Fluos Kultur sel kanker payudara T47D diberi ekstrak metanol daun rosemary (Rosmarinus officinalis L.) dan terbukti dapat menyebabkan kematian sel, akan tetapi mekanisme kematian yang terjadi belum diketahui. Metode Annexin V Fluos ini dapat digunakan untuk mengetahui mekanisme kematian sel akibat pemberian ekstrak metanol daun rosemary pada kadar IC50. Pengujian ini menggunakan flowcytometry sehingga didapatkan hasil yang disajikan pada Gambar 11 dan Tabel 2. Metode Annexin V Fluos digunakan untuk menganalisis secara kuantitatif sel yang mengalami apoptosis atau pun nekrosis secara cepat, akan tetapi memerlukan sampel sel uji yang segar. Metode ini memanfaatkan jalur perubahan membran pada proses apoptosis sehingga dapat membedakan sel yang mengalami apotosis dengan nekrosis di mana reagen Annexin V Fluos berikatan dengan sel yang mengalami apoptosis dan propidium iodida berikatan dengan sel yang mengalami nekrosis. ! PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 40 Tabel 2. Hasil Uji Apoptosis dengan Metode Annexin V Fluos Total Sel (%) Radian 1 Radian 2 Radian 3 Radian 4 Perlakuan Awal Akhir Hidup Nekrosis Apoptosis Apoptosis Kontrol Sel 91,85 6,24 1,75 0,21 Tamoxifen (37,64 !M) 4,55 65,61 27,62 2,38 Ekstrak Metanol Daun 3,21 2,22 17,46 77,33 Rosemary (13,95 !g/mL) A B C Gambar 11. Hasil uji Annexin V Fluos. (A). Kontrol sel, (B). Sel kanker T47D yang diberi tamoxifen 37,64 !" dan (C) diberi ekstrak metanol daun rosemary 13,95 !g/mL Dapat dilihat dari hasil di Tabel 2 jumlah sel yang masih hidup pada kontrol sel sebesar 91,85% sehingga masih dianggap cukup baik (lebih dari 90%), karena pada dasarnya sel dapat mengalami apoptosis dan nekrosis secara natural. Pada uji ini jumlah sel pada kontrol sudah cukup baik sehingga proses dapat dilanjutkan. Pada sel T47D yang diberi tamoxifen (konsentrasi IC50 = 37,64 !M) ! PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 41 sebagai obat yang bekerja sebagai inhibitor kompetitif ERα memiliki kemampuan induksi apoptosis yang tinggi, didukung oleh hasil sebesar 93,23%. Sel T47D yang diberi ekstrak metanol daun rosemary (konsentrasi IC50 = 13,95 !g/mL) dapat menginduksi apoptosis sebesar 19,68% tapi cenderung menyebabkan nekrosis pada sel yaitu sebesar 77,33% dapat diakibatkan oleh durasi inkubasi sel dengan ekstrak yang terlalu lama sehingga terjadi kerusakan membran sel dan terjadi nekrosis. Radian satu pada hasil pembacaan flowcytometry menunjukkan sel yang masih hidup sehingga tidak ada reagen annexin dan reagen propidium iodida yang berikatan dengan sel. Radian kedua menunjukkan sel yang mengalami apoptosis awal di mana reagen annexin akan berikatan dengan fosfatidilserin pada sel yang mengalami apoptosis. Radian ketiga menunjukkan sel yang mengalami apoptosis akhir di mana reagen annexin berikatan dengan fosfatidilserin sel yang mengalami apoptosis, akan tetapi ada beberapa badan apoptosis yang mengandung bagian nukleus mengalami kerusakan membran sehingga dapat berikatan dengan propidium iodida. Radian keempat menunjukkan ikatan propidium iodida dengan sel yang mengalami nekrosis. Berdasarkan data ini ekstrak metanol daun rosemary dapat menyebabkan kematian sel lebih besar dari tamoxifen dilihat dari jumlah sel yang masih hidup pada sel yang diberi ekstrak hanya tersisa 3,21% sedangkan pada tamoxifen sebesar 4,55%. Kemampuan induksi apoptosis ekstrak metanol daun rosemary lebih rendah dari tamoxifen, dan cenderung menyebabkan kematian sel melalui jalur nekrosis. Kematian dengan jalur nekrosis diharapkan tidak terjadi karena ! PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 42 dapat menyebabkan respon inflamasi. Sel yang mengalami apoptosis akan cenderung dihadapkan pada peristiwa fagositosis tetapi sel yang mengalami nekrosis dapat memicu sinyal tubuh untuk melepaskan mediator inflamasi ke daerah kerusakan (Schulze-Osthoff, 2008). Pada tabel terlihat jumlah sel yang mati lebih dari 50% padahal pengujian ini dilakukan pada kadar IC50 ekstrak metanol daun rosemary. Hal ini dapat terjadi karena inkubasi sel dengan sampel yang terlalu lama ataupun ketika pereaksian dengan reagen Annexin V Fluos sehingga kematian sel semakin banyak terjadi. D. Pengujian Ekspresi ER! dengan Metode Imunositokimia Tujuan dari imunositokimia adalah menentukan level ekspresi reseptor estrogen alfa (ERα) pada sel T47D setelah pemberian sampel. Imunositokimia merupakan teknik untuk mendeteksi protein atau antigen dalam sel dengan mendeteksi reaksi antigen antibodi dengan bantuan penanda, dalam penelitian ini menggunakan pewarna sehingga teknik ini lebih cocok disebut dengan immunostaining. Kelebihan metode ini adalah morfologi sel dapat diawetkan sehingga pola pewarnaan sel dapat diamati secara berkesinambungan dan berbagai jenis antibodi dapat digunakan untuk pendeteksian, akan tetapi kekurangan dari metode ini adalah proses yang cukup lama dan rumit juga mahal dan terbatas pada penilaian semi kuantitatif karena menggunakan sudut pandang subjektif, oleh sebab itu diperlukan metode standar untuk mengkuantifikasi level ekspresi protein yang sebenarnya. ! PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI Subjek 1 2 3 ΣSel % Level 43 Tabel 3. Hasil Perhitungan Ekspresi ER! Ekspresi Reseptor Estrogen Alfa pada Sel Kanker Payudara T47D KS No-Ab KS Ab Tamoxifen Rosemary LP1 LP2 LP3 LP1 LP2 LP3 LP1 LP2 LP3 LP1 LP2 LP3 0 0 0 175 101 177 0 0 0 8 11 10 0 0 0 175 101 177 0 0 0 10 15 11 0 0 0 175 101 177 0 0 0 8 14 8 514 365 193 175 101 177 56 80 63 138 154 126 0 0 0 100 100 100 0 0 0 6,28 8,66 7,67 0 0 0 4+ 4+ 4+ 0 0 0 1+ 1+ 1+ A B C D tidak mengeskpresikan ERa mengeskpresikan ERa Gambar 12. Hasil uji imunositokimia. (A). Kontrol sel T47D yang diberi antibodi ER!. (B). Kontrol sel yang tidak diberi antibodi ER!. (C). Sel T47D yang diberi tamoxifen 37,64 !" dan (D). Sel T47D yang diberi ekstrak metanol daun rosemary (Rosmarinus officinalis L.) 13,95 !"/!". ! PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 44 Hasil perhitungan menunjukkan ekspresi ERα pada sel T47D yang diberi tamoxifen adalah 0% sehingga tidak ada ERα yang diekspresikan. Pada sel T47D yang diberi ekstrak metanol daun rosemary hasil ekspresi ERα adalah sebesar 6,28%; 8,66%; dan 7,67% sehingga level ekspresi ERα adalah 1+ (Tabel 3). Dapat dinyatakan di sini bahwa ekspresi ERα pada sel kanker payudara T47D dapat ditekan oleh ekstrak metanol daun rosemary. Pada awal pembahasan telah disebutkan komponen senyawa yang diprediksi ada di dalam ekstrak dan memiliki kemiripan cincin aromatis satu; dua; tiga; dan gugus fungsi hidroksil pada cincin satu yang menyebabkannya dapat berinteraksi dengan baik untuk mempengaruhi ekspresi ERα (Gambar 8). Mekanisme kematian sel yang terjadi pada sel T47D yang diberi ekstrak metanol daun rosemary dapat disebabkan jalur regulasi yang diinduksi ERα. Sel kanker payudara yang mengekspresikan ERα secara berlebih akan memiliki sisi aktif yang banyak untuk berikatan dengan estrogen, ikatan ini dapat menginduksi proliferasi sel berlebih dan menekan regulasi kematian sel. Sel T47D yang mengekspresikan ERα dapat dihambat setelah pemberian ekstrak metanol daun rosemary. Ketika ERα tidak dapat berikatan dengan estrogen maka tidak akan terbentuk dimernya yang akan berikatan dengan estrogen response element (ERE) dan menginduksi ko-aktivator dan ko-supresor pada nukleus sel sehingga proliferasi sel dapat ditekan. Penelitian lain menggunakan asam betulinat, asam oleanolat, dan asam ursolat sebagai komponen tunggal pada model sel kanker payudara MCF-7 yang memiliki kesamaan dengan T47D, yaitu dapat mengekspresikan ERα berlebih. ! PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 45 Perbedaan MCF-7 dengan T47D terletak pada MCF-7 yang memiliki ekspresi Bcl-2 berlebih (Adjo Aka dan Lin, 2012) sedangkan T47D mengalami mutasi pada p53 (Neumann dan Rossi, 2012). Penelitian Liao dkk. (2014) menyatakan bahwa ekspresi tinggi ERα diduga berkorelasi erat dengan proliferasi sel kanker payudara. ERα mengatur siklus sel dengan menekan p53/p21 dan meningkatkan regulasi proliferating cell nuclear antigent (PCNA) proliferation-related Ki–67 antigen (Ki-67) untuk meningkatkan proliferasi sel MCF-7, selain itu, 17-βestradiol (E2) ligan dari ER meningkatkan proliferasi sel MCF-7 diinduksi ER dengan merangsang ekspresi dari PCNA dan Ki-67. Penekanan ERα secara signifikan mempengaruhi PCNA/Ki-67 dan p53/p21 selain itu, ERα menghambat aktivitas transkripsional p53/p21 melalui ERE. ERα memediasi proliferasi MCF-7 dengan meningkatkan regulasi miR-17 untuk membungkam ekspresi p21. Jalur kematian sel lain yang mungkin terjadi karena kandungan senyawa dalam ekstrak metanol daun rosemary (asam betulinat, asam oleanolat, dan asam ursolat) pernah diteliti secara in vitro pada sel kanker payudara oleh Bishaye dkk. (2011). Asam betulinat (Gambar 8) merupakan triterpen pentasiklik diketahui memiliki efek sitotoksik yang sangat baik saat diujikan ke sel kanker payudara T47D dan dapat menginduksi apoptosis dengan menurunkan Bcl-2 dan cyclin D1 juga meningkatkan ekspresi gen Bax. Pada sel kanker SKBR3, asam betulinat dapat menginduksi apoptosis awal dengan meningkatkan ekspresi fosfatidilserin ke bagian luar lamela membran plasma. Jalur mitokondrial diperkirakan sebagai jalur utama apoptosis yang disebabkan oleh asam betulinat. ! PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 46 Asam oleanolat (Gambar 8) dapat diisolasi dan diujikan pada MCF-7 akan tetapi substansi ini hanya memiliki kemampuan sitotoksik yang lemah sekalipun memiliki daya antioksidan yang tinggi (Bishaye, dkk., 2011). Berbeda halnya dengan yang dikemukakan Liu dkk. (2014) bahwa asam oleanolat dapat menghambat aktivitas glikolisis aerobik sel kanker MCF-7. Aerobik glikolisis ditandai dengan peningkatan penyerapan glukosa dan produksi laktat. Sel kanker membutuhkan oksigen lebih banyak dalam proses ini. Melalui parameter ini Liu dkk. (2014) mengukur penurunan kadar konsumsi glukosa pada beberapa jenis sel kanker yang diberi asam oleanolat diikuti dengan penurunan kadar asam laktat yang dihasilkan. Di sini asam oleanolat dapat menekan glikolisis aerobik. Pyruvate kinase muscle isoenzyme 2 (PKM2) yang kurang aktif dibandingkan dengan PKM1 bertanggung jawab terhadap konversi fosfopirufat ke piruvat pada proses glikolisis. Bentuk dimer PKM2 mengakumulasi intermediet glikolitik dan menghubungkan ke biosintesis nukleotid dan asam amino, yang berkontribusi pada pertumbuhan sel. PKM2 banyak diekspresikan pada sel yang berproliferasi, seperti sel tumor. Dalam penelitian Liu dkk. (2014) dilihat perubahan ekspresi PKM1 dan PKM2 pada sel kanker PC3 dan MCF-7 yang diberi asam oleanolat. Dari hasil analisis, asam oleanolat dapat menurunkan ekspresi PKM2 dan meningkatkan ekspresi PKM1. Ekspresi pirufat kinase (PK) juga meningkat bersamaan dengan perubahan PKM2 ke PKM1. Peningkatan ekpresi PK diperlukan untuk mengubah bentuk PKM2 ke PKM1 sehingga glikolisis aerob dapat dihambat. ! PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 47 Asam ursolat (Gambar 8) yang telah dipelajari sejak tahun 1996 diketahui mampu menghambat proliferasi model sel kanker payudara MCF-7 dengan respon sitostatik pada fase G1 siklus sel yang diikuti dengan kematian sel, menginduksi apoptosis dan inhibisi konsumsi oksigen pada McaIV dan BT-20. Dari berbagai studi yang dilakukan, diketahui bahwa asam ursolat dapat menginduksi apoptosis diperkuat dengan alasan kemampuannya untuk pemutusan poly ADP ribose polymerase (PARP) juga menurunkan Bcl-2 pada MCF-7 (jalur mitokondria). Selain itu ditemukan bahwa asam ursolat dapat berikatan dengan reseptor glukokortikoid dan memindahkannya ke nukleus sehingga berpotensi menjadi agen antikanker payudara yang dimodulasi oleh reseptor glukokortikoid (Bishaye, dkk., 2011). Ekstrak metanol daun rosemary memiliki efek sitotoksik pada sel kanker payudara T47D dengan IC50 13,95 !g/mL. Pada IC50 ekstrak metanol daun rosemary dapat menginduksi apoptosis sebesar 19,68% dan nekrosis sebesar 77,33%, dan mampu menekan ekspresi ERα hingga 91-93%. Kemampuan ekstrak rosemary untuk menginduksi apoptosis dan menekan ERα lebih lemah dari tamoxifen tapi kemampuan sitotoksiknya lebih baik. Ekstrak metanol dapat menginduksi kematian sel diprediksi tidak hanya pada regulasi ERα, tapi juga mekanisme molekuler lainnya. Hal ini dapat disebabkan oleh kandungan senyawa dalam ekstrak yang cukup kompleks. Pemastian perlu dilakukan untuk penelitian selanjutnya dengan menguji kandungan kimia, uji selektivitas terhadap sel normal, dan pengujian target molekuler lain ekstrak metanol daun rosemary ini. ! PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI ! BAB V KESIMPULAN DAN SARAN A. KESIMPULAN Berdasarkan hasil yang didapat dan analisis yang dilakukan, maka dapat disimpulkan ekstrak metanol daun rosemary (Rosmarinus officinalis L.) berpotensi sebagai agen kemoprevensi dengan kemampuan sitotoksik IC50 sebesar 13,95 !g/mL dan dapat menginduksi apoptosis sebesar 19,68% dan menyebabkan nekrosis sebesar 77,33% dan dapat menekan level ekspresi ERα sebesar 91% 93% sel kanker payudara T47D. B. SARAN 1. Perlu dilakukan uji kandungan senyawa kimia dalam ekstrak metanol daun rosemary (Rosmarinus officinalis L.). 2. Perlu dilakukan uji selektifitas ekstrak metanol daun rosemary terhadap sel normal. 3. Perlu dilakukan uji ekstrak metanol daun rosemary pada target molekuler lainnya. 48! PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 49 DAFTAR PUSTAKA Abe, F., Tatsuo, Y., Tsuneatsu, N., Juneu, K., Hikaru, O., Hiroo, H., Hiroshige, A., 2002, Ursolic Acid as a Tripanocidal Constituent in Rosemary, Biol. Pharm. Bull., 25 (11) 1485-1487. Adjo Aka, J., dan Sheng-Xiang, L., 2012, Comparison of Functional Proteomic Analyses of human Breast Cancer Cell Lines T47D and MCF-7, PLoS ONE, 7(2): 1-9. Alfredo, C.B., 2012, Aktivitas Sitotoksik Fraksi Etil Asetat Daun Mulwo (Annona refticulata L.) terhadap Sel Kanker Kolon Widr, Skripsi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta. Andreeff, M., David, W. G., Arthur, B. P., 2000, Holland-Frei Cancer Medicine: Cell Proliferation, Differentiation, and Apoptosis, , 5th ed., BC Decker Inc., diakses dari http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK20860/#A194 pada tanggal 23 Maret 2014. Anonim, 17-β-Estradiol, diakses dari http://images.ddccdn.com/drp/images/17/72 804101.jpg , pada tanggal 20 Februari 2015. Bali, R., Chandra, A., dan Verma, R., 2013, Apoptosis In Normal Oral Tissues and Odontogenesis, Eur J Gen Dent, 2:195-198. Begum, A., Subarda, S., Syed, S. A., Kombath, R. V., Swapna, R., dan David, B., 2013, An In-Depth Review on The Medicinal Flora Rosmarinus officinalis (Lamiaceae), Acta Sci. Pol. Technol. Aliment., 12(1):61-73. Bishayee, A., Shamima, A., Nikoleta, B., dan Marjorie, P., 2011, Triterpenoids as Potential Agents for The Chemoprevention and Therapy of Breast Cancer, Front Biosci, 16: 980-996. Cancer Chemoprevention Research Centre, 2009, Prosedur Tetap: Panen Sel, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta. Cancer Chemoprevention Research Centre, 2009, Prosedur Tetap: Preparasi Sampel, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta. Cancer Chemoprevention Research Centre, 2009, Prosedur Tetap: Preparasi Sampel untuk Flowcytometry, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta. ! PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 50 Cancer Chemoprevention Research Centre, 2009, Prosedur Tetap:Pengamatan Ekspresi Protein dengan Metode Imunositokimia, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta. Cancer Chemoprevention Research Centre, 2009, Prosedur Tetap:Uji Sitotoksik Metode MTT, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta. Damle, A. A., Yogita, P. P., dan Archana, A. N., 2013, Anticancer Activity of Betulinic Acid on MCF-7 Tumors in Nude Mice, Indian J. Exp. Biol., 51(7): 485-491. Devi, P.U., 2005, Basics of Carcinogenesis, Health Administrator, 16 (1): 16-24. Deymos, 2010, diakses dari http://thumbs.dreamstime.com/z/rosemary-plantlight-yellow-pot-white-background-34182816.jpg, pada tanggal 31 Januari 2015. Doyle, A., dan Bryan, G., 2000, Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedure in Biotechnology, John Wiley and Sons, Singapore, pp. 62-64. Hidayati, D. N., Ibrahim, A., Sri, S., 2011, Uji Sitotoksisitas Fraksi Etil Asetat Ekstrak Etanol Herba Alfalfa (Medicago sativa L.) Terhadap Sel Kanker Payudara T47D dan Sel Kanker Leher Rahim (Sel HeLa) Serta Uji Kandungan Senyawa Kimianya, Universitas Wahid Hasyim, Semarang. Holliday, D. L., dan Valerie, S., 2011, Choosing The Right Cell Line for Breast Cancer Research, Breast Cancer Research, 13: 215. Jordan, V. C., 2006, Tamoxifen (ICI46,474) As A Targeted Therapy To Treat And Prevent Breast Cancer, British Journal of Pharmacology, 147: S269-S276. Kumar, V., Abbas, A. K., Fausto, N., 2004, Robbins and Cotran Pathologic Basis of Disease, 7th ed., Elsevier Saunders, Philadelphia, pp. 1129-1130. Liao, X., Da-Lin, L., Nan, W., Long-Yue, L., Yue, W., Yan-Qi, L., Ting-Bao, Y., Xue-Guang, S., Peng Hu, Tong-Cun, Z., 2014, Estrogen Receptor a Mediates Proliferation of Breast Cancer MCF-7 Cells Via a p21/PCNA/E2F1-dependent Pathway, The FEBS Journal, 281(3): 927942. ! PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 51 Liu, J., Ning, W., Leina, M., Ming, L., Ge, L., Yuyan, Z., dan Xiukun, L., 2014, Oleanolic Acid Suppresses Aerobic Glycolysis in Cancer Cells by Switching Pyruvate Kinase Type M Isoforms, Plos One, 9(3): 1-9. Majno, G., dan Isabelle, M., 1995, Apoptosis, Oncosis, and Necrosis An Overview of Cell Death, American Journal of Pathology, 146 (1): 3-15. Mallon, E., Pinchas, O., Nasar, N., Iain, B., Beatrice, H., Barry, G., 2000, The Basic Pathology of Human Breast Cancer, Journal of Mamary Gland Biology and Neoplasia, 5(2): 139-163. McGahon, A. J., Seamus, J. M., Reid, P. B., Artin, M. Y. S., Rona, J. M., Walter, K. N., Douglas, R. G., 1995, Chapter 9 The End of the (Cell) Line: Methods for the Study of Apoptosis In Vitro, Elsevier, Philadelphia, pp. 153-185. Mosmann, T., 1983, Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival: Application to Proliferation and Cytotoxicity Assays, Journal of Immunological Methods Elsevier, 63: 55-63. Neto, C. C., 2011, Berries and Cancer Prevention: Ursolic Acid and Other Pentacyclic Triterpenoids Anticancer Activities and Occurrence in Berries, Springer Science, USA, pp. 41-47. Neumann, B. C., dan Michael, J. S., 2012, Effects of Exemestane on TwoDimensional and Three-Dimensional T47D Breast Cancer Cell Cultures, Department of Biology and Environmental Science, University of New Haven West Haven. Novonty, L., Vachalkova, A., Biggs, D., 2001, Ursolic Acid: an anti-tumorgenic and chemopreventive activity. Minireview, Neoplasma, 48 (4): 241-246. Nurani, L. H., 2012, Uji Sitotoksitas dan Antiproliferatif Sel Kanker Payudara T47D dan Sel Vero Biji Nigella sativa L., Jurnal Ilmiah Kefarmasian 2(1): 17-29. Paula, L., dan Irina, A., 2012, Advantages and Disadvantages of Professional and Free Software for Teaching Statistics, Information Technology and Management Science, 15: 9-64. ! PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 52 Prabin, S., Shrestha, I., dan Kurisu, K., 2009, Immunohistochemistry: A Review of Practical Procedure. Nepal Journal of Neuroscience. 6: 38-41. Prasad, S., Yadav, V.R., Kannappan, R., Aggarwal, B.B., 2011, Ursolic Acid, a Pentacylic Triterpene, Potentiates TRAIL-Induced Apoptosis through p53-independent Regulation of Death Receptor: Evidence for The Role of Reactive Oxygen Species and JNK, J. Biol. Chem., 286(7): 55465557. Riss, T.L., Richard, A.M., Andrew, L.N., Helene, A.B., Tracy, J.W., Lisa, M., 2013, Assay Guidance Manual: Cell Viability Assays [Internet], diakses dari http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK144065/ pada tanggal 18 Februari 2015. Roche, H., dan Vahdat, L.T., 2010, Treatment of metastatic cancer: second line and beyond, Annals of Oncology, 22: 1000-1010. Sarkar, W., Garrick, H., Kimberly, M., Anuja, O., Shannon, B., Shannon, K., dan McKenna, L., 2013, Cancer Development, Progression, and Therapy: An Epigenetic Overview, International Journal of Molecular Sciences, 14: 21087-21113. Schulze-Osthoff, K., 2008, Apoptosis, Cytotoxicity, and Cell Proliferation, 4th Edition, Roche Diagnostics GmbH, pp. 2-16. Sharma, R., 2012, Cancer Chemoprevention: Prevention is Better than Cure, Cancer Science Therapy, S3: e001. Sledge, G. W., Eleftherios, P. M., Gabriel, N. H., Harold, J. B., Pamela, J. G., dan Antonio, C. W., 2014, Past, Present, and Future Challenges in Breast Cancer Treatment, Journal of Clinical Oncology, 32 (19): 1980-1986. Stock, R. P., dan Harvey, B., 2003, The Sigmoidal Curve of Cancer, Nature Biotechnol, 21: 13-14. Strumfa, I., Andrejs, V., Arnis, A., Janis, G., 2012, Pathology of Breast Cancer: from Classic Concepts to Molecular Pathology and Pathogenesis, Acta Chirurgica Latviensis, 10.2478(10163-012-0012-x):59-66. Talupula, B. K., 2011, Cytotoxic of PBN Spin Trap on A204 Cells, Journal of Advanced Pharmaceutical Research, 2 (1): 9-17. ! PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 53 Tokunaga, E., Yuichi, H., Kimihiro, T., Nami, Y., Hiroshi, S., Eiji, O., Hiroyuki, K., dan Yoshihiko, M., 2014, Molecular Mechanism Regulating The Hormone Senitivity of Breast Cancer, Cancer Sci, 105: 1377-1383. Trump, B. J., Irene, K. B., Seung, H. C., dan Patricia, C. P., 1997, The Pathway of Cell Death: Oncosis, Apoptosis, Necrosis, Toxicologic Pathology, 25 (1): 82-88. Vermes, I., Clemens, H., Helga, S., dan Chris, R., 1995, A Novel Assay for Apoptosis Flow Cytrometric Detection of Phospatidylserine Expression on early Apoptic Cells Using Fluorescein Labelled Annexin V, Journal of Immunological Methods, 184: 39-51. Williams, C., dan Chin-Yo, L., 2013, Oestrogen Receptors in Breast Cancer: Basic Mechanism and Clinical Implication, Ecancer Medical Science, 7: 370. Yesil-Celiktas, O., Canan, S., Erdal, B., Fazilet, V., 2010, Inhibitory Effects of Rosemary Extracts, Carsinic Acid and Rosmarinic Acid on the Growth of Various Human Cancer Cell Lines, Plant Foods Hum Nutr, 65: 158-163. ! PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 54 LAMPIRAN ! PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI Lampiran 1. Sertifikat Determinasi Tanaman Rosemary ! 55 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 56 Lampiran 2. Seri Kadar Ekstrak Metanol Daun Rosemary Dan Tamoxifen Rosemary Tamoxifen 10 mg + 100 !L DMSO = 100.000!g/mL 10 mg + 100 !L DMSO + 900 !L intermediet = 500 !g/mL = 5 !L bulk + MK = 2000 !M 995 !L MK Konsentrasi Intermediet MK Konsentrasi Sampel MK 500 500 !L 300!g/mL 300!!L 200!!L 1000 !M bulk !L 450 178!g/mL 178!!L 322 !L 100!!M 50 !L C1 !L 450 100!g/mL 100!!L 400 !L 10 !M 50 !L C2 !L 450 30!g/mL 30!!L 470 !L 1 !M 50 !L C3 !L 450 18!g/mL 18!!L 482 !L 0,1!!M 50 !L C4 !L 450 10!g/mL 50!!L 450 !L 0,01!!M 50 !L C5 !L 1!g/mL 50!!L 450 !L - ! PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI Lampiran 3. Hasil Analisis IC50 Esktrak Dengan Program R ! 57 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI Lampiran 4. Hasil Analisis IC50 Tamoxifen Dengan Program R ! 58 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 59 Lampiran 5. Lapang Pandang Preparat T47D Yang Diberi (A). Ekstrak Metanol Daun Rosemary Dan (B) Tamoxifen A B A B B A ! PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 60 Lampiran 6. Lapang Pandang Kontrol Sel (A). Tanpa Antibodi Dan (B). Dengan Antibodi Pada Preparat T47D B A B A A B ! PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 61 BIOGRAFI PENULIS Penulis Skripsi berjudul “Aktivitas Sitotoksik Ekstrak Metanolik (Rosmarinus officinalis Daun L.) Rosemary terhadap Sel Kanker Payudara T47D melalui Regulasi Ekspresi Reseptor Estrogen- ! (ER !! )” memiliki nama lengkap Clara Dewi Anggraeni, merupakan anak ketiga dari tiga bersaudara pasangan Bapak Aloysius Bekti Subagyo dan Ibu Ambrosia Sariningsih. Penulis dilahirkan di Jakarta, 10 Agustus 1993. Pendidikan formal yang ditempuh yaitu TK Mater Dei (1997-1999), tingkat sekolah dasar di SD Santa Ursula (1999-2005), tingkat sekolah menengah pertama di SMP Mater Dei (2005-2008), dan tingkat sekolah menengah atas di SMA Mater Dei (20082011). Pada tahun 2011, penulis melanjutkan studi di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Semasa studinya, penulis aktif mengikuti kegiatan keorganisasian dan kepanitiaan diantaranya adalah Ketua Dewan Perwakilan Mahasiswa Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma (2013), Kordinator Divisi Publikasi dan Informasi Dewan Perwakilan Mahasiswa Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma (2012), Anggota Divisi Hubungan Masyarakat Panitia Komisi Pemilihan Umum Gubernur BEMF dan Ketua DPMF Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma (2011). !
