Sifat penempelan Lactobacillus spp. asal daging

HASIL DAN PEMBAHASAN
Penelitian Pendahuluan
Penelitian pendahuluan meliputi persiapan kultur bakteri asam laktat (BAL)
asal daging sapi, dan persiapan pewarnaan bakteri untuk diidentifikasi. Tujuan dari
penelitian pendahuluan adalah untuk memeriksa karakteristik morfologis dan
kemurnian isolat bakteri yang digunakan. Isolat bakteri yang digunakan berjumlah 5
isolat yang berasal dari daging sapi. Karakteristik morfologis yang diamati meliputi
respon terhadap pewarnaan Gram, bentuk dan susunan sel.
Kelompok genus Lactobacillus adalah bakteri Gram positif, katalase negatif,
dan memiliki bentuk batang (Fardiaz, 1992). Isolat 1A32, 2B2, 2B4, 2C12, dan 1A5
tergolong dalam Gram positif yang mempunyai bentuk batang dengan susunan
tunggal atau rantai serta uji katalase yang negatif. Berdasarkan hasil uji fermentasi
gula menunjukkan 1A32 dan 2B4 merupakan spesies bakteri Lactobacillus spp
dengan tingkat akurasi 96% dan 99% (Hidayati, 2006). Hal ini sesuai dengan
penelitian terdahulu yang menyatakan bahwa isolat bakteri tersebut tergolong dalam
kelompok genus Lactobacillus spp. dan Streptococcaceae. Perbedaan kemampuan
isolat dalam memfermentasi beberapa gula menunjukkan bahwa isolat-isolat tersebut
adalah isolat yang berbeda (Hidayati, 2006).
Kultur asal daging sapi lokal yang digunakan merupakan kelompok BAL.
Lima buah isolat BAL yang diisolasi dari daging sapi merupakan Gram positif
dengan hasil uji katalase negatif. Hasil tersebut menunjukkan bahwa kultur tidak
tercemar dan masih homogen seperti yang diperoleh dari penelitian sebelumnya
(Hidayati, 2006).
Pemeriksaan Kemurnian Bakteri Asam laktat
Pemeriksaan kemurnian bakteri asam laktat (BAL) merupakan cara untuk
memastikan bahwa bakteri yang diuji merupakan kultur murni BAL hasil isolasi
dengan mengetahui karakteristik masing-masing kultur berdasarkan sifat yang
tampak atau sifat yang muncul dari tiap-tiap bakteri sebagai identitas yang melekat
pada setiap bakteri. Karakteristik tersebut berdasarkan profil fenotipenya seperti
berdasarkan dinding selnya melalui pewarnaan Gram, serta bentuk dari masing-
1
masing isolat BAL yang sudah diisolasi sebelumnya dari daging sapi segar yang
beredar di Bogor (Hidayati, 2006).
Pewarnaan gram
Pewarnaan gram merupakan metode uji untuk mengetahui makromolekul
dinding sel setiap isolate bakteri uji. Komposisi kimia dinding sel mikroba sangat
bervariasi, sehingga terdapat perbedaan kemampuan mengadsorpsi (melekat) di
antara spesies, galur dan bahkan diantara tipe sel pada organisme yang sama
(Yuniarti et al., 2003). Bakteri berdasarkan reaksi pewarnaan gram dibedakan
menjadi bakteri Gram positif dan Gram negatif.
Sebanyak 5 isolat bakteri asam laktat dilakukan pengujian pewarnaan gram.
Hasil yang didapatkan ternyata isolat 1A32, 2B2, 2B4, 2C12, 1A5 merupakan bakteri
Gram positif. Hasil ini ditunjukkan dengan hasil pewarnaan pada sel bakteri
berwarna biru yang dilihat di bawah mikroskop dengan pembesaran 1000 kali. Uji
pewarnaan pada kultur ini sesuai dengan hasil yang dilakukan oleh Hidayati (2006)
yang menyatakan bahwa 28 kultur ini merupakan bakteri Gram positif. Pato (2003)
menegaskan bahwa BAL adalah kelompok bakteri Gram positif. Fardiaz (1992)
menjelaskan bahwa pada bakteri Gram positif dinding selnya tersusun oleh
peptidoglikan dan lapisan tipisnya terikat. Yuniarti et al., (2003) menegaskan bahwa
dinding sel bakteri Gram positif merupakan struktur yang sangat renggang (porous)
dengan komponen utama peptidoglikan yang mengandung gugus asam.
Proses pewarnaan tahap pertama adalah memberi pewarna basa kristal violet
yang menyebabkan membran sitoplasma yang terdiri dari protein dan lipid akan
menyerap warna. Tahap selanjutnya dalam pewarnaan Gram adalah memberi larutan
iodium sehingga akan terbentuk suatu kompleks antara kristal violet dengan iodium.
Perlakuan selanjutnya adalah pencucian dengan menggunakan alkohol, proses ini
akan mengakibatkan dinding sel akan mengalami dehidrasi yang kemudian poriporinya mengkerut, permeabilitas menurun sehingga kompleks Kristal violet dan
iodium yang sudah terbentuk pada membran sitoplasma tidak bisa keluar dan saat
diberi pewarna safranin yang berwarna merah. Pewarna safranin dapat masuk ke
dalam membran sitoplasma. Kompleks kristal violet dan iodium tidak terpengaruh,
sehingga sel bakteri Gram positif tetap berwarna biru.
26
1
Morfologi Sel
Konfirmasi bakteri uji yang terakhir diuji adalah morfologi sel. Sebanyak 5
isolat BAL dikarakterisasi berdasarkan morfologi selnya untuk mengetahui bentuk
bakteri dari masing-masing isolat dengan menggunakan mikroskop. Fardiaz (1992)
menyatakan bahwa berdasarkan bentuk morfologinya bakteri dibagi menjadi 3
golongan yaitu golongan batang (basil), bulat (kokus), dan golongan spiral.
Preparat masing-masing isolat yang sudah dilakukan pewarnaan Gram
diamati bentuknya dibawah mikroskop dengan pembesaran 1000 kali. Hasil
pengamatan morfologi sel 5 isolat BAL dapat dilihat pada Tabel 2 yang menyatakan
bahwa isolat tersebut antara lain: 1A32, 2B2, 2B4, 2C12, 1A5 merupakan bakteri
bakteri berbentuk batang (basil) dengan susunan tunggal dan pendek. Isolat ini
merupakan kelompok bakteri asam laktat genus Lactobacillus (Fardiaz, 1992).
27
1
Tabel 2. Karakteristik 5 Isolat Bakteri Asam Laktat Berdasarkan Morfologi dan
Pewarnaan Gram.
Isolat
Morfologi
Pewarnaan
Bakeri
Gram
Pembesaran 1000 kali
Keterangan
1A5
batang, susunan
Gram
tunggal maupun
Positif
rantai pendek
1A32
batang, susunan
Gram
tunggal maupun
Positif
rantai pendek
batang, susunan
2B2
tunggal maupun
Gram
Positif
rantai pendek
batang, susunan
2B4
tunggal maupun
Gram
Positif
rantai pendek
2C12
batang, susunan
Gram
tunggal maupun
Positif
rantai pendek
128
Pertumbuhan Bakteri Asam Laktat pada Suhu 37 °C
Isolat bakteri asam laktat yang telah dimurnikan sebanyak 5 buah kemudian
diinkolasikan dalam tabung reaksi yang berisi media de Man Ragosa Sharp Broth
(MRSB) pada masing-masing isolat, kemudian masing-masing tabung reaksi yang
sudah diinokulasi kultur diinkubasi pada suhu 37 °C selama 24 jam.
Hasil penelitian menujukkan untuk isolat 1A32, 2B2, 2B4, 2C12 dan 1A5
dapat tumbuh pada suhu 37°C. Isolat-isolat ini mampu tumbuh dengan baik pada
suhu 37 °C dan 45 °C terlihat kekeruhannya (+++). Kekeruhan ini merupakan
indikator bakteri dapat tumbuh dengan baik atau tidak dalam media MRSB, semakin
keruh media MRSB yang sudah diinokulasi bakteri maka bakteri tersebut dapat
tumbuh dengan baik. Menurut Fardiaz (1992) bakteri ini termasuk kedalam golongan
bakteri mesofil yaitu bakteri yang mampu tumbuh pada suhu minimal 10-20 °C,
maksimal pada suhu 45 °C dan pertumbuhan optimal pada suhu 37 °C. Suhu 37 °C
merupakan suhu optimum pertumbuhan isolat-isolat ini terlihat dari kekeruhan yang
paling keruh pada suhu ini. Hal ini seperti dilihat pada Gambar 3.
Keterangan : Tingkat Kekeruhan
a : tidak keruh (-)
b : sedikit keruh (+)
c : keruh (++)
d : sangat keruh (+++)
Gambar 3. Kekeruhan pada Uji Pertumbuhan BAL pada Suhu 37 ºC
Napitupulu et al. (2000) melaporkan bahwa Lactobacillus menghasilkan anti
bakteri. Filtrat Lactobacillus dapat menghambat pertumbuhan bakteri patogen
Streptococcus, Staphylococcus aureus, dan Escerichia coli, bahkan filtrat yang sudah
disimpan selama 6 bulan memiliki kemampuan sama. Lactobacillus juga mampu
menghambat pertumbuhan bakteri lain yang merugikan atau patogen (Tagg et al.,
1976). Goldin dan Gorbach (1992) mengatakan bahwa beberapa substansi
antimikroba yang dihasilkan bakteri probiotik, misalnya L. acidophilus menghasilkan
29
1
acidotin, acidophilin, bacteriocin, lactocidin, L. bulgaricus (bulgarican), L.
plantarum (lactolin), L. brevis (lactobullin, lactobrevin), dan L. reuteri (rauterin).
Beberapa kriteria penting untuk karakter fisiologi yang merupakan seleksi
kelayakan bakteri sebagai produk probiotik antara lain uji pertumbuhan/resistensi
bakteri probiotik pada pH rendah. Fetlinski dan Stepaniak (1994) menyebutkan
bahwa dapat tidaknya suatu bakteri sebagai probiotik tergantung resistensi atau
ketahanan probiotik terhadap pH rendah, garam empedu, dan kemampuan untuk
hidup dalam sistem pencernaan. Berdasarkan hal di atas dilakukan penelitian ini,
yang bertujuan untuk mendapatkan isolat Lactobacillus terseleksi sebagai kandidat
probiotik dengan mengetahui resistensi/ketahanan hidup beberapa isolat bakteri
Lactobacillus pada pH rendah.
Jumlah Bakteri Asam Laktat dalam Usus Halus Tikus
Bakteri asam laktat dalam saluran pencernaan merupakan bakteri yang
bersifat nonpatogen yang sangat penting peranannya dalam menjaga kesehatan
saluran pencernaan (Nakazawa dan Hosono, 1992). Jumlah bakteri asam
laktat
dalam suspensi 1,2 x 109 cfu/cm² atau 9,07 log10 cfu/cm². Jumlah bakteri asam laktat
dalam usus halus seperti dilihat pada Tabel 3.
Tabel 3. Rataan Jumlah Bakteri Asam Laktat (BAL) dalam Usus Halus Tikus
Perlakuan
Jenis Bakteri Asam Laktat
Ratarata
Kontrol
1A32
2B2
2B4
2C12
1A5
------------------------------------------------ ( log 10 cfu/ cm² usus halus ) -----------------------------------Cuci PBS
7,21±0,17
7,10±0,17
6,80±0,20
6,80±0,30
6,90±0,35
7,00±0,005
6,96±0,19
Tanpa
7,23±0,48
7,32±0,74
7,26±0,30
7,09±0,32
7,45±1,18
7,29 ±1,31
7,27±0,72
7,22±0,33
7,21±0,45
7,03±0,25
6,94±0,31
7,18±0,77
7,14 ±0,66
Cuci PBS
Rata-rata
30
1
Berdasarkan hasil penelitian dengan pengujian statistik (Tabel 3), rataan
jumlah bakteri asam laktat pada usus halus tidak dipengaruhi oleh perlakuan dan
jenis BAL yang digunakan (P>0,05). Usus tikus yang mendapat perlakuan pencucian
PBS memiliki rataan populasi bakteri asam laktat dalam usus sekitar 6,96 ± 0,19;
usus tikus kontrol 7,22 ± 0,33 dan usus tikus tanpa perlakuan pencucian PBS 7,27 ±
0,72. Jumlah BAL dalam usus halus tanpa pencucian PBS lebih banyak
dibandingkan dengan usus pencucian PBS. Hal ini karena BAL pada perlakuan tanpa
pencucian PBS lebih banyak menempel pada lendir mukosa usus sedangkan pada
perlakuan pencucian PBS BAL menempel terjadi di dalam sel sehingga mampu
menginvasi patogen dan dapat dijadikan standar sebagai kandidat probiotik.
Kultur yang digunakan dalam penelitian sifat penempelan pada sel epitel usus
secara in vitro adalah Lactobacillus spp kode 1A5, 2B2, 2B4, 2C12 dan 1A32 yang
merupakan hasil isolasi asal daging sapi. Kelima isolat bakteri asam laktat tersebut
dapat meningkatkan jumlah bakteri asam laktat dalam saluran pencernaan.
Lactobacillus termasuk golongan bakteri asam laktat yang sering dijumpai pada
makanan fermentasi, produk olahan ikan, daging, susu, dan buah-buahan (Napitupulu
et al., 1997). Sejauh ini telah diketahui bahwa keberadaan bakteri ini tidak bersifat
patogen dan aman bagi kesehatan sehingga sering digunakan dalam industri
pengawetan makanan, minuman dan berpotensi sebagai produk probiotik. Sifat yang
menguntungkan dari bakteri Lactobacillus dalam bentuk probiotik adalah dapat
digunakan untuk mendukung peningkatan kesehatan. Bakteri tersebut berperan
sebagai flora normal dalam sistem pencernaan. Fungsinya adalah untuk menjaga
keseimbangan asam dan basa sehingga pH dalam ileum dan kolon konstan. Bakteri
asam laktat yang mampu bertahan dalam saluran pencernaan antara lain,
Lactobacillus spp. 1A5, 2C12 dan 1A32 sedangkan Lactobacillus spp kode 2B2 dan
2B4 jumlahnya lebih rendah sehingga tidak mampu bertahan dalam saluran
pencernaan.
Selanjutnya Alcamo (2000) mengatakan bahwa Lactobacillus spp. dan L.
casei dapat aktif pada pH rendah dan menghasilkan asam laktat dalam jumlah
banyak sehingga pada makanan ternak dapat membantu menyimpan energi. Tidak
terjadi perubahan
jumlah bakteri asam laktat dalam usus halus pada perlakuan
pencucian PBS dan tanpa pencucian PBS. Jumlah bakteri asam laktat yang terdapat
31
1
dalam usus juga relatif rendah yaitu antara 6,90-7,30 log
10
cfu/cm2. Jumlah bakteri
asam laktat dalam usus ini cenderung normal karena masih berada pada kisaran 108109 cfu/cm2 atau log10 8-9 (Mitsuoka, 1989). Diagram rataan jumlah bakteri asam
laktat akibat pencucian PBS ditunjukkan dengan Gambar 4.
Gambar 4. Diagram Jumlah Bakteri Asam Laktat terhadap Pencucian PBS
Jumlah bakteri asam laktat pada usus halus tanpa perlakuan pencucian PBS
lebih tinggi dibandingkan jumlah bakteri asam laktat pada usus halus yang diberi
perlakuan pencucian PBS. Hal ini mengindikasikan bahwa sebagian besar isolat
bakteri asam laktat 1A5, 2C12 dan 1A32 lebih mampu bertahan hidup di dalam usus
halus tanpa perlakuan pencucian PBS. Diagram jumlah BAL menunjukkan perlakuan
pencucian PBS menyebabkan penurunan, ini terjadi karena penanganan pada proses
pembersihan vili usus ketika dipotong yang terlalu lama sehingga menyebabkan
terjadinya kerusakan pada lapisan mukosa yang terdapat pada vili usus yang
menghambat BAL untuk menempel pada lapisan tersebut serta proses inkubasi pada
suspensi BAL yang singkat.
Ketidakmampuan Lactobacillus spp kode 2B2 dan 2B4 bertahan dalam
saluran
pencernaan
berkaitan
dengan
rendahnya
kemampuan
menempel
Lactobacillus spp kode 2B2 dan 2B4 pada saluran pencernaan. Battacharya dan
Majumdar (1983) menyatakan bahwa kemampuan menempel bakteri dalam saluran
pencernaan dipengaruhi beberapa faktor. Faktor-faktor yang mempengaruhi
kemampuan menempel dari bakteri tersebut adalah asal bakteri tersebut, polisakarida
32
1
dan glikoprotein pada permukaan sel bakteri, adanya inhibitor pada permukaan epitel
usus halus (saluran pencernaan) serta gerakan usus dalam saluran pencernaan. Mukus
merupakan secret jernih dan kental serta melekat, membentuk lapisan tipis,
berbentuk gel kontinyu yang menutupi dan beradhesi pada permukaan epitel mukosa.
Tebal mukus bervariasi antara 50-450 µm dengan komposisi sangat bervariasi
tergantung spesies dan lokasi, anatomi dan keadaan normal organisme. Secara umum
komposisinya terdiri dari air 95 %, glikoprotein dan lemak 0,5-5,0 %, garam-garam
mineral 1 % dan protein bebas 0,5-1 %. Komponen utama mukus yang bertanggung
jawab pada viskositas serta sifat adhesi dan kohesinya adalah glikoprotein, suatu
protein berbobot molekul tinggi yang memiliki unit oligosakharida (rata-rata 8-10
residu monosakharida dari 5 jenis monosakharida, seperti L-fukosa, D-galaktosa, Nasetil-D-glukosamin, N-asetil-D-galaktosamin dan asam sialat
Lactobacillus spp kode 2B2 dan 2B4 tidak dapat menempel pada permukaan
saluran pencernaan walaupun diisolasi dari mamalia hal ini tidak sesuai dengan
Battacharya dan Majumdar (1983) menyatakan bahwa jenis Lactobacillus yang dapat
menempel pada saluran pencernaan tikus adalah Lactobacillus yang berasal dari
mamalia. Jumlah bakteri asam laktat yang sudah maksimal dalam saluran pencernaan
dan menempel pada permukaan epitel usus juga menjadi penghambat (inhibitor) bagi
Lactobacillus spp kode 2B2 dan 2B4 untuk menempel pada saluran pencernaan.
Gerakan usus saluran pencernaan yang cepat juga mendorong Lactobacillus spp kode
2B2 dan 2B4 keluar dari saluran pencernaan dan tidak menempel pada saluran
pencernaan. Gerakan usus yang cepat mengakibatkan bakteri yang sulit menempel
pada saluran pencernaan terbawa bersama sisa-sisa makanan yang akan dibuang
dalam bentuk feses.
Beberapa cara untuk meningkatkan populasi bakteri nonpatogen dalam
saluran pencernaan menurut Lu dan Walker (2001) adalah dengan pemberian nutrisi
yang baik, lingkungan yang stabil dan melakukan pemberian sinbiotik yang dapat
berinteraksi dengan mikroflora normal usus. Bourlioux et al. (2003) menyatakan
bahwa bakteri dalam saluran pencernaan membutuhkan nutrisi dan energi untuk
tumbuh dan berkembangbiak. Pertumbuhan dan perkembangan bakteri ini biasanya
terjadi di usus halus. Nutrisi yang digunakan oleh bakteri adalah makanan yang tidak
terserap, mucin dan sel-sel mati serta metabolit yang dihasilkan oleh bakteri. Hasil
33
1
hasil metabolit tersebut adalah hasil pemecahan karbohidrat, lemak, protein serta
produksi vitamin.
Lactobacillus spp kode 1A32, 1A5 dan 2C12 dapat meningkatkan jumlah
bakteri asam laktat dalam usus halus. Sumber energi bagi pertumbuhan sel-sel
mukosa seperti short chain fatty acid yang dihasilkan akibat proses fermentasi.
Lactobacillus tersebut beserta bakteri asam laktat lainnya dalam usus yang
merupakan unsur penting yang menyebabkan peningkatan jumlah bakteri asam laktat
dalam usus halus. Semakin cepat perkembangan sel mukosa usus maka akan semakin
tinggi jumlah mucin yang dihasilkan. Mucin merupakan salah satu sumber nutrisi
yang paling penting bagi perkembangan bakteri asam laktat.
US probiotics (2006) menyatakan bahwa walaupun beberapa kultur produk
fermentasi tidak tahan terhadap kondisi dalam lambung maupun usus halus dan tidak
mencapai saluran pencernaan dalam jumlah besar, tetapi mampu meningkatkan daya
cerna laktosa dan meningkatkan efek imunitas maka bakteri tersebut dapat
dikategorikan sebagai probiotik.
Perlakuan terhadap penelitian penempelan bakteri asam laktat pada lapisan
sel epitel usus dilakukan dua perlakuan, diantaranya perlakuan dengan pencucian
usus halus dan perlakuan tanpa pencucian usus halus dengan PBS. Adapun tujuan
dari pencucian dari usus halus tersebut yaitu untuk membuktikan kemampuan isolat
bakteri asam laktat yang dapat menempel pada sel epitel usus, karena dengan
melakukan perlakuan pencucian usus halus maka akan terjadi kerusakan dan
perubahan komposisi sel epitel pada usus halus. Sel epitel usus halus berfungsi untuk
menghasilkan mucin atau lapisan lendir agar bakteri asam laktat dapat menempel
pada sel epitel. Distribusi mikroflora dalam saluran gastrointestinal menurut
Mikelsaar dan Mandar (1993) dibedakan menjadi dua jenis yaitu: (1) distribusi
horizontal yang berkaitan dengan lokalisasi mikroflora pada lumen, pada lapisan
mucus yang melapisi epithelium, pada sel-sel epitel mukosa, pada ujung vili, atau
dalam celah-celah Liberkuhn dan (2) distribusi vertikal yang berkaitan dengan
lokalisasi mikroba sepanjang gastrointestinal seperti lambung, duodenum, jejunum,
ileum, cecum, kolon, dan rectum. Bakteri asam laktat 1A32, 2B2, 2B4, 2C12 dan
1A5 untuk perlakuan tanpa pencucian PBS memiliki jumlah yang lebih banyak
daripada perlakuan pencucian (PBS. Jenis bakteri asam laktat yang berpotensi
34
1
sebagai kandidat probiotik yaitu 1A32, 1A5 dan 2C12 dengan jumlah rataan populasi
sebanyak 7,29 ± 1,31, 7,32 ± 0,74 dan 7,45 ± 1,18 log cfu/cm2 usus halus.
Ket : Standarisasi Kekeruhan Isolat BAL
a : PBS Kontrol (tanpa isolat)
b : PBS 1A32
c : PBS 2B2
d : PBS 2B4
e : PBS 2C12
f : PBS 1A5
Gambar 5. Standarisasi Kekeruhan isolat BAL pada larutan PBS pada Suhu 37 ºC
Standarisasi kekeruhan isolat bakteri asam laktat dilakukan dengan tujuan
sebagai penyetaraan jumlah populasi masing-masing isolat bakteri asam laktat
sehingga jumlahnya akan setara dengan 1,2 x 109 cfu/cm2. Setelah larutan suspensi
masing-masing bakteri asam laktat sama kemudian dilakukan perendaman semua
sampel usus halus ke dalamnya selama 30 menit ke dalam inkubator. Kemudian
sampel usus halus yang telah direndam larutan suspensi bakteri asam laktat dibagi
menjadi dua kelompok, yaitu kelompok usus halus yang dibilas dengan larutan PBS
serta kelompok usus halus tanpa dibilas dengan larutan PBS.
Berdasarkan hasil penelitian Rostini (2002), diketahui bahwa jumlah bakteri
Lactobacillus spp 108 cfu/ml, 109 cfu/ml, dan 1010 cfu/ml berada pada fase
logaritmik. Fase logaritmik adalah fase pertambahan populasi secara teratur menjadi
dua kali lipat pada interval waktu tertentu (waktu generasi) selama inkubasi (Pelczar
dan Chan, 1986). Jumlah Lactobacillus spp 108 cfu/ml berada di awal fase logaritmik
sehingga pertumbuhannya sangat pesat, Lactobacillus spp 109 cfu/ml berada di
tengah-tengah fase logaritmik, dan Lactobacillus spp sebanyak 1010 cfu/ml berada di
akhir fase logaritmik menjelang fase stasioner. Sampel usus halus yang telah
direndam larutan suspensi bakteri setelah dilakukan pemupukkan pada media
MRSA, selanjutnya dilakukan pembuatan preparat histologis untuk membuktikan
masing-masing isolat bakteri asam laktat yang dapat bertahan di jaringan usus halus
dengan melihat kemampuan sifat penempelan bakteri asam laktat.
35
1
Mekanisme Penempelan Isolat BAL Terhadap Perlakuan Pencucian PBS
Isolat bakteri 1A5, 2B2, 2B4, 2C12 dan 1A32 dipilih dan diuji sensitivitasnya
terhadap perlakuan pencucian phosfat buffer salline (PBS). Berdasarkan profil
karakteristiknya bahwa bakteri tersebut merupakan bakteri asam laktat dengan
kemampuan tumbuhnya pada suhu sedang atau disebut juga bakteri mesofilik.
Pemilihan isolat bakteri tersebut juga berdasarkan penelitian yang telah dilakukan
sebelumnya oleh Hidayati, (2006) yang melakukan seleksi terhadap 28 isolat BAL
yang sama terhadap kemampuan tumbuh dalam asam kuat lambung dan kondisi usus
halus yang mengandung garam empedu. Bakteri 1A5, 2C12, dan 1A32 merupakan
bakteri yang paling tahan terhadap asam kuat dan garam empedu. Tagg (1976)
melaporkan bahwa bakteri asam laktat mempunyai toleransi pH dengan rentang yang
luas. Bakteri asam laktat juga mampu mempertahankan pH sitoplasma lebih alkali
dari pada pH ekstraseluler (Hutkins dan Nannen, 1993). Gilliland (1990) menyatakan
bahwa bakteri gram positif lebih sensitif terhadap lisozim, tetapi Lactobacillus dan
Streptococcus lebih resisten terhadap bakteri gram positif lainnya.
Interaksi antara jenis bakteri berbeda dengan penggunaan PBS pada
perlakuan pencucian PBS dan tanpa pencucian PBS tidak berpengaruh nyata
(P>0,05) bagi pertumbuhan BAL serta kemampuan sifat penempelan pada sel epitel
usus halus. Perlekatan (adherence) bakteri yang diikuti terjadinya kolonisasi pada
induk semang yang peka adalah suatu hal penting dan diperlukan untuk memulai
terjadinya patogenesis penyakit. Hidrophobisitas permukaan dari mikroorganisme
dapat mempunyai peranan sifat hidrofobik sel bakteri dapat mempengaruhi interaksi
fagositosis, dan penempelan pada jaringan tubuh induk semang (Otero et al., 2004).
Integral dalam patogenesis penyakit interaksi hidrofobik telah diketahui
sebagai salah satu penentu untuk mengidentifikasi galur patogenik suatu bakteri
(Das dan Kapoor, 2004). Perlakuan pencucian PBS tidak berpengaruh nyata (P>0,05)
terhadap pertumbuhan isolat BAL Lactobacillus 1A5, 2B2, 2B4, 2C12, dan 1A32.
Jumlah rataan BAL tertinggi terdapat pada isolat 2C12 dan jumlah rataan terendah
pada isolat 2B2. Hal yang menguntungkan dari Lactobacillus spp antara lain adalah
kemampuannya mengkolonisasi jaringan epitelium usus. Jika galur Lactobacillus
tersebut tidak mempunyai daya lekat (adherence capacity) pada epitelium, tetapi
dapat melakukan koagregasi dengan mikroorganisme yang mempunyai daya lekat,
36
1
maka mereka dapat berguna untuk digunakan dalam saluran pencernaan (Gusils et
al., 1999). Koagregasi bakteri dapat memfasilitasi interaksi nutrisi secara
menguntungkan diantara pasangan koagregasinya, sedangkan autoagregasi dapat
secara substansi meningkatkan kemampuan kolonisasi lactobacilli untuk menetap
dalam waktu singkat.
Beberapa galur probiotik dapat diseleksi berdasarkan beberapa hal antara lain
seperti sifatnya sebagai agen antimikrobial aktif terhadap mikroorganisme patogen,
kemampuan hidrophobiknya, kemampuannya menstimulasi sistem kekebalan,
mempunyai aktifitas enzim yang mendukung absorpsi nutrien esensial dan ionion,
dan dihasilkannya bahan yang mampu menempel pada epithelium. Hal ini
disebabkan oleh karakter fisiologis dari masing-masing Lactobacillus berbeda-beda.
Perbedaan ketahanan membran sel bakteri terhadap kerusakan akibat terjadinya
penurunan pH ekstraseluler menyebabkan keragaman ketahanan sel pada pH rendah.
Beberapa peneliti memperkuat pernyataan tersebut seperti Tannock et al. (1982)
yang menyatakan bahwa strain bakteri yang diisolasi dari indigenous mikroflora dari
satu spesies tidak sama dengan spesies lain, meskipun Lactobacillus dan
Bifidobacterium sama-sama diisolasi dari host yang sama tetapi bakteri-bakteri
tersebut mempunyai variasi biotypes yang berbeda. Untuk itu perlu dipelajari
karakter utama seperti hidrofobisitas dari permukaan sel bakteri. Hidrophobisitas
permukaan berbagai sel mikroba dapat ditentukan dengan mengukur kemampuan
penempelan sel terhadap berbagai polimer, atau afinitas bakteri terhadap pelarut
hidrokarbon dalam sistem 2 fase (daya lekat dan pertumbuhan pada hidrokarbon)
(Jankovic et al.,2003).
Hasil pencucian menggunakan PBS mempengaruhi secara langsung terhadap
sifat penempelan BAL melalui membran epitel usus halus. Terlihat dari hasil
pewarnaan hematoxylin bahwa usus halus yang mendapat perlakuan pencucian
larutan PBS jumlah isolat bakteri asam laktat yang dapat menempel lebih banyak
daripada usus halus tanpa perlakuan pencucian PBS serta kontrol. Hal ini
dikarenakan terjadinya proses penempelan bakteri asam laktat secara mekanis pada
sel epitel usus halus. Adhesi bakteri pada permukaan dapat dilihat sebagai 2 tahap
kejadian yaitu: adhesi yang reversibel karena tekanan yang lama dan terjadi interaksi
lanjutan berupa kontak langsung antara permukaan seperti interaksi hidrophobik
37
1
karena struktur permukaan bacteria. Adhesi awal bakteri terhadap permukaan
microlayer tergantung pada beberapa faktor dan interaksi hidrofobik merupakan satu
hal yang sangat penting (Dahlback et al., 1999). Beberapa spesies Lactobacillus
mempunyai protein lapisan permukaan atau surface layer protein (SLP) yang terikat
dengan amplop sel. Lapisan permukaan tersebut terdiri atas suatu glycoprotein, dan
disebut S-protein yang membentuk 2 dimensi lapisan kristalin pada permukaan sel.
Lapisan S (S layer) dari Lactobacilli penting untuk kemampuannya melekat pada
permukaan seperti juga SLP yang mencerminkan hidrofobisitas dari permukaan sel
Lactobacillus (Rodriguez et al., 2004).
Pengamatan berdasarkan hasil pewarnaan Hematoxylin yang terlihat pada
Gambar 6 saat dilakukan foto dengan menggunakan mikroskop khusus dari kelima
jenis strain Lactobacillus spp 1A5, 2B2, 2B4, 2C12 dan 1A32 dapat terlihat bahwa
BAL yang diberi perlakuan pencucian dengan menggunakan PBS jumlah BAL yang
menempel dan BAL yang tidak diberi perlakuan pencucian PBS hampir dikatakan
sama banyaknya. Hasil ini didukung melalui perhitungan statistik jumlah BAL yang
menunjukkan tidak nyata, ini berarti tingkat keseragaman yang rendah. Namun dapat
terlihat untuk perlakuan pencucian PBS jumlahnya sedikit lebih banyak, hal ini
disebabkan pada BAL yang diberi perlakuan PBS pada bagian usus yang digunakan
telah mengalami proses lisis akibat perlakuan pada saat dehidrasi yaitu perendaman
ke dalam larutan formalin yang terlalu lama kemudian penanganan sampel organ
usus halus ketika dipotong lalu dibersihkan. Kendala yang terjadi adalah pada saat
sebelum dilakukan perlakuan perendaman dalam larutan PBS lalu dibilas dengan
PBS adalah sampel usus yang direndam substrat kondisinya terlalu lama berada di
suhu ruang dan proses pembersihan jaringan usus tidak sempurna serta terjadi
kerusakan pada bagian permukaan dinding usus halus khususnya vili-vili usus akibat
proses pembersihan kurang tepat yang di dalamnya terdapat sel Goblet sehingga
menyebabkan rusaknya dan menurunnya kualitas dari sekresi kelenjar mukosa yang
menghasilkan mucus (cairan kental).
38
1
A. Isolat 1A5 Tdk Cuci
B. Isolat 2C12 Tdk Cuci
D. Isolat 1A32 Tdk Cuci
F. Isolat 2C12 Cuci
C. Isolat 2B4 Tdk Cuci
E. Isolat 2B2 Tdk Cuci
G. Isolat 1A32 Cuci
H. Kontrol Cuci
Gambar 6. Hasil Pewarnaan Hematoxylin – Eosin Penempelan Isolat BAL pada Sel
Epitel Usus Halus dengan Menggunakan Mikroskop cahaya MikrophotoFXA
39
1
Cairan mucus atau gel yang dihasilkan kelenjar mukosa tersusun atas materi
protein kompleks seperti peptidoglikan yang mengandung glikoprotein yang
merupakan proporsi tingkat tinggi karbohidrat. Lendir (mucus) dihasilkan oleh
kelenjar submukosa usus halus dan sel-sel mangkok yang terserak di antara sel-sel
yang melaksanakan penyerapan di sepanjang usus halus. Selaput lendir (tunika
mukosa) dibalut oleh epitel permukaan, lamina propria dengan kelenjar, dan lamina
muskularis mukosa. Vili merupakan penjuluran mukosa dan merupakan ciri khas
bagi usus halus. Kelenjar usus yang bermuara dalam alur (crypts) antara dasar vili,
menembus selaput lendir sejauh lamina muskularis mukosa. Kelenjarnya berbentuk
tubulus sederhana yang lazim disebut kelenjar mukosa. Lendir (mucus) diperlukan
untuk melindungi epitel terhadap kerusakan mekanik maupun iritasi enzim (Brown,
1992).
Pengaruh yang berkaitan secara langsung adalah menurunnya kemampuan
sifat adhesi atau penempelan BAL saat menempel pada sel epitel usus halus karena
rusaknya bagian vili-vili usus dan terganggunya sekresi mucus. Disamping pengaruh
tersebut, faktor berikutnya adalah kondisi serta kualitas strain BAL yang digunakan
dalam hal ini spesies Lactobacillus spp. Oleh karena itu, BAL yang digunakan harus
dimurnikan terlebih dahulu dari pengaruh yang dapat mengakibatkan kontaminasi.
Faktor keberhasilan bakteri asam laktat dapat menempel pada sel epitel usus halus
yaitu protein atau glikoprotein nonimunologik (lectin) dapat terlibat dalam fenomena
adhesi dengan molekul yang spesifik (karbohidrat, glikoprotein atau glikolipid).
Lectin merupakan adhesin yang dapat memblokir adhesi dari suatu mikroorganisme
patogen dengan kompetisi dengan reseptor intestin (Slifkin dan Doyle, 1990). Selain
kualitas strain BAL yang digunakan, sebelumnya harus dilakukan uji fisiologi
terhadap BAL yang digunakan dengan pemeriksaan kemurnian serta pewarnaan
Gram untuk melihat kemampuan dinding sel masing-masing. Tidak semua bakteri
dari saluran pencernaan mempunyai struktur lectin like dalam dinding selnya. Bakteri
yang memproduksi lectin-like akan mengaglutinasi sel-sel patogen pada saluran
pencernaan khususnya Usus halus (Gusils et al., 1999). Adanya bahan lectin like
pada lapisan luar bakteri Lactobacilli akan dapat membantu bakteri melakukan
kolonisasi karena lectin mempunyai kemampuan untuk mengikat karbohidrat yang
spesifik (Gusils et al., 1999).
40
1
Pengaruh Keberadaan Isolat BAL pada Sel Epitel Usus Halus
Keberadaan dan kemampuan Lactobacillus spp. untuk bertahan hidup dalam
saluran pencernaan disebabkan antara lain oleh kemampuannya untuk melakukan
agregasi (Jankovic et al., 2003). Sedangkan pada sampel usus halus yang mendapat
perlakuan pencucian PBS telah terjadi kerusakan vili-vili usus, yang mana pada vili
usus halus terdapat sel goblet yang menghasilkan cairan berbentuk gel licin atau
mucus yang dihasilkan oleh kelenjar mukosa pada vili usus yang berfungsi sebagai
perekat bakteri asam laktat untuk menempel pada sel epitel usus halus. Karakter
permukaan merupakan salah satu sifat yang dapat dipelajari secara in vitro, telah
digunakan untuk mengevaluasi probiotik seperti Lactobacillus. Sifat permukaan
bakteri berhubungan dengan kemampuannya menempel pada berbagai substrat.
Adhesi bakteri adalah tahap awalnya yang kemudian menentukan kemampuan
kolonisasi bakteri tersebut. Kemampuan adhesi dan berkolonisasi di jaringan,
mikroorganisme probiotik dapat mencegah invasi agen patogen dengan memblokir
secara spesifik sel reseptornya (Otero et al., 2004).
Pewarnaan hematoxylin dari kelima strain Lactobacillus 1A5, 1A32, 2B2,
2B4, dan 2C12 dapat terlihat bahwa kemampuan setiap BAL berbeda-beda. Hal ini
dipengaruhi oleh sifat BAL untuk melekat pada sel epitel mukosa dan
hidrophobisitas. Karena kedua faktor tersebut yang akan menentukan kemampuan
strain BAL yang digunakan sebagai Probiotik. Sifat adhesif akan menyebabkan
probiotik tersebut mampu melakukan kolonisasi pada epitel mukosa dengan
pembentukan bacterial film yang berperan dalam menyingkirkan bakteri patogen dari
mukosa usus (Corcoran et al., 2005). Semakin banyak BAL yang bertahan pada
saluran pencernaan, maka kualitas serta kemampuan spesies BAL tersebut sangat
baik. Selain itu, perlakuan yang dilakukan pada penelitian ini bermanfaat untuk
menyeleksi strain BAL terbaik. Beberapa peneliti juga menyatakan bahwa daya lekat
(adherence) Lactobacillus pada epitel mukosa dimediasi oleh lectin (Rickard et al.,
2000). Lectin adalah protein atau glikoprotein nonimunologik yang dapat terlibat
dalam fenomena adhesi dengan molekul yang spesifik (karbohidrat, glikoprotein atau
glikolipid). Struktur lectin yang multimeric menyebabkan lectin mempunyai
kemampuan untuk mengaglutinasi sel atau membentuk presipitat dengan
glikokonjugat dengan cara yang serupa seperti reaksi antigen-antibodi (Annuk et al.,
141
2001). Adanya bahan ini dan monosakarida lain dalam glycopolymers pada
glycocalyx Lactobacilli berhubungan dengan sifat adhesif dari galur lactobacilli
yang bersangkutan. Demikian pula telah diketahui bahwa adanya media glukosa atau
gula-gula yang dapat dimetabolisir akan dapat memperbaiki daya hidup probiotik
Lactobacilli (Corcoran et al., 2005). Mekanisme molekuler tentang cara Lactobacilli
menempel pada sel epitel mukosa usus masih banyak dipelajari. Beberapa peneliti
juga menyatakan ada peranan karbohidrat yang ada dalam amplop sel Lactobacillus
(Gram positif) yaitu teichoic acids, lipoteichoic acids dan polisakarida (Corcoran et
al., 2005). Karbohidrat Lactobacilli menunjukkan monosakarida seperti Nacetylglucosamine dan N-acetylgalactosamine yang ada pada glycocalyx dalam
jumlah cukup besar (Onyshchenko et al., 1999).
Menurut Ishibashi dan Shimamura (1993) sebagian besar hasil penelitian
pada bakteri usus menunjukkan bahwa bakteri-bakteri yang paling dominan dari segi
jumlah adalah bakteri anaerob yang tidak membentuk spora seperti dari genus
Bakteroida, eubakterium dan Bifidobakterium. Bakteri lain yang juga terdapat dalam
jumlah besar adalah Lactobacillus, bakteri-bakteri anaerob fakultatif seperti
enterobakter walaupun sering menjadi karakteristik bakteri usus, jumlahnya hanya
102-103 kali di bawah bakteri anaerob obligat. Kendala yang terjadi selama proses
penelitian yaitu (1) sampel usus mengalami lisis akibat dehidrasi dalam
paraformaldehid, (2) proses inkubasi dalam substrat BAL, (3) pada saat proses
pemupukkan BAL yang terlalu lama, (4) peda saat penanganan pembersihan sampel
usus halus ketika dipotong yang menyebabkan rusaknya vili usus sehingga
menghambat kemampuan BAL untuk menempel pada mukosa usus. Ketersediaan
substrat yang dapat difermentasi merupakan faktor penting yang membatasi
pertumbuhan bakteri pada usus besar manusia. Seperti juga pada pada habitat yang
lain, bakteri-bakteri yang dapat mentransformasi substrat yang tersedia paling cepat
akan mempunyai populasi terbesar. Keanekaragaman jenis bakteri serta kuantitasnya
pada level tertentu dalam saluran pencernaan dapat dipertahankan oleh organisme
atau individu dengan mekanisme pengaturan secara fisik, kimia dan biologis.
Gerakan peristaltik menghasilkan eliminasi banyak mikroba. Keasaman lambung
menjaga bakteri pada konsentrasi rendah pada saluran pencernaan bagian atas dan
membunuh bakteri-bakteri patogen. Interaksi yang terjadi antara berbagai spesies
42
1
bakteri juga sangat penting di dalam mempertahankan keseimbangan mikroflora usus
(Salminen et al., 1993).
Beberapa penelitian telah menunjukkan bahwa Lactobacillus spp. dapat host
terhadap infeksi atau masuknya agen patogen ke saluran pencernaan. Lactobacillus
menghasilkan hidrogen peroksida dan asam organik seperti asam laktat dalam jumlah
tinggi, sehingga akan menurunkan pH lingkungannya dan juga sekaligus menekan
tumbuhnya patogen. Berbagai tipe antibiotik juga dapat dihasilkan oleh
Lactobacillus spp. contohnya, L. acidophilus dapat memproduksi lactacin dan L.
plantarum dapat menghasilkan plantaricin (El Naggar, 2004). Pada kenyataannya,
adhesi Lactobacilli pada permukaan dipengaruhi oleh hidrofobisitas permukaan sel
Lactobacillus yang tergantung juga pada lingkungan seperti pH dan kekuatan ion.
43
1