1 ANALISIS PROTEIN DARAH KERBAU LOKAL

advertisement
ANALISIS PROTEIN DARAH KERBAU LOKAL (Bubalus bubalis) DI WILAYAH
MALANG DAN BANGKALAN SEBAGAI STUDI AWAL
PENINGKATAN MUTU GENETIK
Dian Sofi Anisa, Moh. Amin, Umie Lestari
Jurusan Biologi, FMIPA, Universitas Negeri Malang
Email: [email protected]
ABSTRAK
Populasi kerbau di Indonesia menurun sejak tahun 1925, dengan laju penurunan yang makin meningkat.
Dari total penurunan populasi di Indonesia, 40% terdapat di Pulau Jawa, khususnya di Jawa Timur.
Penanganan awal yang dilakukan oleh peternak adalah dengan mengawinkan antar individu dalam satu
daerah, tetapi anakan yang dihasilkan memiliki kualitas mutu genetik yang rendah. Oleh karena itu perlu
dilakukan upaya untuk mencegah terjadinya penurunan populasi yang pada akhirnya berakibat hilangnya
plasma nutfah endemik Indonesia ini dengan melihat hubungan kekerabatan setiap individu. Salah satu cara
melihat hubungan kekerabatan adalah dengan pendekatan molekuler yang dapat dilihat melalui ekspresi
protein spesifik pada darah. Tujuan penelitian ini adalah untuk mendeskripsikan profil protein darah kerbau
lokal dari wilayah Malang dan Bangkalan, menunjukkan analisis keragaman atau variasi genetik sebagai
penanda keragaman genetik dan estimasi hubungan kekerabatan. Penelitian ini merupakan penelitian
deskriptif eksploratif dengan observasi labolatorik yang dilakukan dengan memisahkan darah kerbau
menjadi plasma dan eritrosit. Plasma yang telah dipurifikasi dan eritrosit darah kerbau kemudian
dielektroforesis SDS-PAGE. Protein yang dibandingkan adalah protein spesifik darah yang merupakan
hasil ekspresi gen dari plasma maupun eritrosit dengan berat molekul 63-66 kDa (haemoglobin), 79-85 kDa
(transferrin) dan 90-110 kDa (post transferrin) yang selanjutnya dianalisis dengan menggunakan program
MVSP 3.22 untuk memperoleh dendogram yang menggambarkan hubungan kekerabatan kerbau lokal dari
populasi Malang dan Bangkalan. Berdasarkan hasil elektroforesis SDS-PAGE diketahui bahwa kerbau
Bangkalan seluruhnya memilki protein Hb (63-66 kDa), protein Tf (79-85 kDa) pada individu Bangkalan 1
dan 4 dan protein Ptf (90-110 kDa) pada Bangkalan 2. Kerbau Malang seluruhnya tidak memiliki protein
Hb (63-66 kDa), tapi memiliki protein Tf (79-85 kDa) pada individu Malang 2 dan protein Ptf (90-110
kDa) pada individu Malang1 dan 3. Berdasarkan hasil dendogram analisis filogenetik diperoleh dua kluster
yang masing- masing ditempati oleh individu dari kedua populasi. Individu yang berkerabat jauh sebaiknya
dikawinkan dengan individu dari populasi lain yang memiliki hubungan kekerabatan yang jauh pula.
Estimasi sistem perkawinan dapat dilakukan pada individu Malang 1, Malang 3 dan Malang 4 dengan
individu Bangkalan 3, Bangkalan 4 dan Malang 2.
Kata Kunci: Analisis proteomik, protein darah, Hubungan Kekerabatan, sistem perkawinan kerbau lokal
Populasi ternak kerbau di Indonesia sebanyak 40% terdapat di Pulau Jawa,
khususnya di Jawa Timur. Lukitasari (2011) berpendapat bahwa, populasi kerbau terus
mengalami penurunan jumlah selama kurun waktu lima tahun terakhir. Penurunan jumlah
kerbau disebabkan karena masyarakat lebih menyukai beternak sapi karena nilai jual
yang lebih tinggi dibanding kerbau.
Kabupaten Malang dan Kabupaten Bangkalan merupakan salah satu daerah yang
terus mengalami penurunan jumlah ternak kerbau setiap tahunnya. Hal ini dapat ditinjau
dari data statistik mengenai jumlah ternak kerbau di kedua daerah tersebut. Data statistik
populasi ternak kerbau di kabupaten Malang menunjukkan penurunan jumlah ternak pada
tahun 2009 sebesar 208 ekor, tahun 2010 adalah 198 ekor, tahun 2011 adalah 151 ekor
dan tahun 2012 sebanyak 150 ekor. Data statistik populasi ternak kerbau di Kabupaten
1
2
Bangkalan juga menunjukkan penurunan yang signifikan dari tahun 2009 adalah 49.699
ekor, tahun 2010 adalah 49.638, tahun 2011 adalah 32.675, tahun 2012 adalah sebanyak
33.498 ekor kerbau (Disnak Jatim, 2013).
Untuk mencegah penurunan populasi, perlu dilakukan usaha pengembangan populasi
kerbau lokal, sebagai langkah awal peningkatan mutu genetik hewan tersebut untuk
mencegah terjadinya kepunahan (Faruque, 2007). Peningkatan mutu genetik dapat
dilakukan dengan melihat hubungan kekerabatan dari setiap individu yang digunakan
sebagai estimasi sistem perkawinan. Salah satu cara melihat hubungan kekerabatan setiap
individu adalah dengan pendekatan molekuler. Hubungan kekerabatan tersebut dapat
diteliti melalui ekspresi protein spesifik pada darah kerbau. Salah satu tolak ukur
keberhasilan perkawinan untuk peningkatan mutu genetik dapat dilihat dari
keanekaragaman genetik individu yang ada, sehingga keberadaan organisme tertentu
secara alami dapat dipertahankan. Keanekaragaman genetik sebagai penelitian awal, akan
memberikan konstribusi besar bagi peningkatan produktivitas hewan ternak seperti
kerbau, sekaligus berperan penting dalam menentukan kualitas keanekaragaman hayati.
Berdasarkan permasalahan yang telah dikemukakan, dan untuk menunjang
keberhasilan upaya konservasi serta pembibitan kerbau lokal, maka perlu dilakukan
identifikasi variasi genetik. Identifikasi variasi genetik melalui pendekatan molekuler,
dapat diketahui berdasarkan pola profil protein yang terdapat dalam darah. Proses ini
dapat dilakukan, karena protein dalam darah adalah protein fungsional produk ekspresi
gen (Guyton & Hall, 2008). Identifikasi variasi genetik, dapat dimanfaatkan untuk
mengetahui filogenetik antara kerbau satu dengan kerbau lainnya pada daerah tertentu.
Protein darah spesifik yang terdapat pada darah terutama hasil ekspresi gen dari sel darah
merah seperti Haemoglobin serta dari serum darah seperti Transferrin dan
Posttransferrin dapat menunjang identifikasi tersebut. Nei et al., (2007) menambahkan
bahwa pada tingkat molekuler, gen merupakan segmen DNA yang mengkode atau
menyandi sintesis protein tertentu yang dapat menjadi ciri pada organisme.
Lukitasari (2011) mengatakan bahwa karakteristik genetik hewan dapat ditentukan
berdasarkan karakteristik protein plasma, dan sel darah merah melalui teknik
elektroforesis sehingga dapat diperoleh informasi kesamaan genetik, dan variabilitas
genetik antara hewan tersebut. Penggunaan teknik elektroforesis pada molekul protein
untuk mengetahui keragaman genetik dan jarak genetik individu dalam populasi kerbau,
merupakan cara yang dilakukan berdasarkan pendekatan secara molekuler. Dengan
demikian, data genetis yang dihasilkan dapat membantu untuk menentukan kebijakan
dalam pemuliaan ternak.
Teknik elektroforesis SDS PAGE (sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel
electrophoresis), merupakan cara yang banyak dipergunakan untuk proses analisis
protein. Elektroforesis pada prinsipnya, berfungsi sebagai saringan molekul, dimana
3
mobilitas relatif dari SDS-polipetida-kompleks. Dengan adanya SDS, maka
memungkinkan pemisahan polipeptida hanya berdasarkan atas berat molekulnya.
Pertimbangan proses breeding yang dilakukan kemudian tidak hanya didasarkan
pada bentuk fenotip saja, tetapi juga mempertimbangkan faktor genetisnya. Dengan
pertimbangan tersebut, diharapkan akan turut meningkatkan keragaman genetis kerbau
sehingga sekaligus menjaga keseimbangan populasi dan mampu meningkatkan
biodiversitas serta memperkaya plasma nutfah yang sudah ada (Lukitasari, 2011).
METODE PENELITIAN
Objek penelitian dalam penelitian ini adalah 4 ekor kerbau lokal yang ada di
wilayah Wagir kabupaten Malang dan 4 ekor kerbau Burneh Desa Grunggungan dan
Du’ur Kabupaten Bangkalan, yang tersebar di berbagai peternak wilayah tersebut.
Masing- masing kerbau diambil darahnya kurang lebih sebanyak 3- 5 ml. Pengambilan
sampel darah dilakukan dengan teknik manual menggunakan jarum venoject dan tabung
vakum, dengan dibantu oleh teknisi dari Dinas Peternakan setempat.
Prosedur Penelitian meliputi ; 1) memisahkan plasma darah dengan sel darah
merah. Sampel darah disentrifuge selama 10 menit dengan kecepatan 10.000 rpm pada
suhu 4oC. Pencucian sel darah merah dilakukan dengan menambahkan larutan Natrium
Chloride 0,9% dengan perbandingan 1:2. Sel darah merah selanjutnya disentrifuse
dengan kecepatan 3500 rpm selama 5 menit pada suhu 4oC dan pencucian sel darah
merah dilakukan 3 kali. 2) Plasma darah kemudian dipurifikasi dengan menggunakan
SAS (Sodium Amonium Sulfat) 50% (1:1). 3) Plasma darah dan sel darah merah
kemudian dianalisis menggunakan sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel
electrophoresis (SDS-PAGE) yang dipasang secara vertikal menurut Ogita and Marker
(1968).
Data yang diambil untuk dianalisis adalah 1) Profil pola pita protein dan
frekuensi ekspresi protein yang dianalisis menggunakan program GENEPOP versi 4.2.
serta 2) Profil protein yang nampak juga dihitung berat molekulnya berdasarkan marker.
Berat molekul protein standart yang dipergunakan sebagai marker dihitung nilai retention
factor untuk acuan. Hasil perhitungan berat molekul protein dapat digunakan sebagai data
untuk analisis hubungan kekerabatan dengan program MPSV 3.22 untuk mengetahui
keanekaragaman genetik dan jarak genetik individu dalam populasi. Hasil analisis berupa
dendogram sehingga dapat diketahui persentase similaritas antar individu dalam populasi.
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Profil Protein Populasi Kerbau di Wilayah Malang dan Bangkalan
Hasil penelitian profil protein pada populasi kerbau di wilayah Malang dan
Bangkalan menunjukkan perbedaan pada profil pita protein. Profil pita protein yang
berbeda dapat dilihat dari ada dan tidak adanya pita protein serta tebal tipisnya protein
4
yang nampak setelah proses SDS PAGE. Hasil elektroforesis plasma darah dan eritrosit
darah kerbau dari populasi Malang dan Bangkalan dengan SDS PAGE dan hasil
Zimogram dapat dilihat pada Gambar 1 dan 2 di bawah ini.
A
M1 M2 M3
M4 M
4
B
B1 B2
B3
B4
M1
M2
M3
M4
M
B1
B2
B3
B4
Gambar 1. Separasi Profil Protein pada Sampel Plasma Darah Kerbau dari Populasi Malang
(Sampel M1-M4) serta Bangkalan (Sampel B1-B4) dan Marker (M)
(A) Gambar Gel Hasil Elektroforesis SDS-PAGE (B) Gambar Zimogram Hasil Elektroforesis SDSPAGE
A
B
Gambar 2. Separasi Profil Protein pada Sampel Eritrosit Kerbau dari Populasi Malang (Sampel M1M4) serta Bangkalan (Sampel B1-B4) dan Marker (M)
(A) Gambar Gel Hasil Elektro-Foresis SDS-PAGE (B) Gambar Zimogram Hasil Elektroforesis SDSPAGE
5
B. Berat Molekul 3 Protein Spesifik
Tabel 1. Tabel Hasil Perhitungan Berat Molekul 3 Protein yang Terbentuk pada Masing-masing
Individu
Populasi
Malang
Bangkalan
Individu
Haemoglobin (Hb)
Transferrin (Tf)
63-66 kDa
79-85 kDa
Post Transferrin
(Ptf)
90-110 kDa
~
~
~
~
63.4
65.7
63.4
65.7
~
83.8
~
~
~
~
82.0,84.8
84.8
105
~
102
~
~
98.9,102
~
~
1
2
3
4
1
2
3
4
Berdasarkan Tabel 1 di atas, maka diperoleh data bahwa protein spesifik yang
terekspresi pada Populasi Malang adalah transferrin dan post transferrin. Sedangkan
pada populasi Bangkalan, ketiga protein spesifik terekspresi seluruhnya. Hal tersebut
dapat dilihat sesuai dengan ada tidaknya berat molekul yang muncul dari setiap protein.
Dari data tersebut kemudian dapat digunakan sebagai input data untuk analisis frekuensi
ekspresi protein menggunakan GENEPOP.
Tabel 2. Frekuensi Ekspresi Protein Spesifik Darah Kerbau pada Populasi Malang dan Bangkalan
Frekuensi Ekspresi Protein pada Berat Molekul (kDa)
Populasi
di
Malang
Bangkalan
Macam Protein
Haemoglobin
Transferrin
Post transferrin
Haemoglobin
Transferrin
Post transferrin
63,4
65,7
82,0
83,8
84,8
98,9
102
105
-
-
-
1
-
-
-
0.5
0.5
0.5
-
0.5
-
0.25
-
-
0.75
-
0.5
0.5
-
Dari paparan tabel di atas, variasi genetik ditunjukkan dengan melihat nilai frekuensi
protein yang terekspresi. Populasi Bangkalan lebih bervariatif karena menunjukkan
frekuensi ekspresi protein pada ketiga lokusnya. Selain itu, ketiga protein spesifik
(haemoglobin, transferrin, dan post transferrin) terekspresi seluruhnya hanya pada
populasi Bangkalan. Berarti tiga protein spesifik tersebut, dapat dijadikan sebagai protein
penanda pada populasi tersebut, karena pada populasi Malang hanya dua protein yang
muncul yaitu transferrin, dan post transferrin. Nilai frekuensi ekspresi protein dan
6
persentase heterozigositas yang tinggi dimiliki oleh populasi Bangkalan. Ekspresi protein
pada lokus transferrin, dan post transferrin lebih bervariasi jika dibandingkan dengan
haemoglobin.
C. Estimasi Hubungan Kekerabatan Berdasarkan Profil Protein Spesifik pada
Darah Kerbau
Perbandingan profil protein darah berdasarkan ada tidaknya protein spesifik pada
populasi kerbau Malang dan Bangkalan seperti pada Tabel 1di atas, selanjutnya dapat
dianalisis lebih lanjut berdasarkan profil protein dan keberadaan protein penanda di
dalam eritrosit maupun plasma darah kerbau, dengan menggunakan program Multivariate
Statistical Package (MVSP) 3.22. untuk memperkirakan hubungan kedekatan serta jarak
genetik antar individu satu dengan individu lainnya, baik dalam satu populasi maupun
berbeda populasi. Analisis kluster yang dilakukan menggunakan program MVSP 3.22
akan menghasilkan dendogram dan nilai indeks similiaritas dimana dari gambaran
dendogram serta nilai indeks similiaritas dapat diketahui seberapa besar kedekatan
hubungan antar individu. Gambar di bawah ini merupakan gambar dendogram hasil
analisa kluster menggunakan MVSP 3.22.
Kluster 1
Kluster 2
Gambar 3. Dendogram Pola Pita Tiga Protein Spesifik pada Darah Kerbau Populasi Malang dan
Bangkalan.
Berdasarkan hasil analisis dendogram dengan menggunakan Cluster Analysis
pada populasi Malang dan Bangkalan berdasarkan pada keberadaan protein penanda
(Haemoglobin, transferrin dan post transferrin), menunjukkan percabangan yang
berbeda- beda. Pecabangan-percabangan tersebut dikelompokkan menjadi dua kluster
yaitu kluster 1 dan kluster 2. Hasil penelitian menggambarkan hubungan tiap individu
dalam populasi yang dihubungkan oleh dua kluster yang berbeda. pada kluster 1
ditempati oleh tiga individu dari dua populasi yang berbeda yaitu individu dua Bangkalan
dan satu Malang. Hal serupa juga terjadi pada kluster 2 yang ditempati oleh lima individu
dari dua populasi yang berbeda. Dalam satu kluster terdapat dua populasi yang berbeda.
7
Hal ini tidak sesuai dengan penyataan Lartillot & Philippe (2008), yang berpendapat
bahwa individu dalam satu populasi yang sama akan memungkinkan memiliki hubungan
kekerabatan yang lebih dekat. Epperson (1989) menambahkan, bahwa pada jarak
geografis yang pendek, aliran gen mempengaruhi struktur genetik di dalam populasi,
sehingga tingkat variasi gen di dalam satu populasi adalah rendah.
KESIMPULAN
Hasil elektroforesis SDS-PAGE pada isolat protein darah diketahui bahwa secara
umum profil protein pada dua populasi tidak jauh berbeda. Hasil elekroforesis eritrosit
dan serum darah kerbau dari Malang dan Bangkalan menunjukkan bahwa protein dengan
berat molekul 63-66 kDa hanya dimiliki oleh kerbau dari populasi Bangkalan saja.
Sedangkan protein dengan berat molekul 79- 85 kDa hanya dimiliki oleh kerbau individu
2 populasi Malang dan populasi Bangkalan pada individu 3 dan 4. Protein dengan berat
molekul 90-110 kDa hanya dimiliki oleh individu Malang 1 dan Malang 3 serta
Bangkalan 2. Nilai frekuensi ekspresi protein yang lebih bervariatif ditunjukkan oleh
populasi Bangkalan. Semakin bervariatif frekuensi ekspresi protein, maka semakin tinggi
pula variasi genetic yang dimiliki oleh suatu populasi.
Berdasarkan hasil analisis kluster dengan dendogram menunjukkan Kluster 1
ditempati oleh individu dari Bangkalan 4, Bangkalan 3 dan Bangkalan 2. Kluster 2
ditempati individu Malang 1, malang 3, Malang 4, Bangkalan 1 dan Bangkalan 2. Setiap
individu yang berada pada satu kluster maka dianggap memiliki hubungan kekerabatan
yang dekat. Semakin rendah indeks similaritas maka hubungan kekerabatan semakin
jauh, dan sebaliknya semakin tinggi indeks similaritas maka hubungan kekerabatan suatu
individu semakin dekat.
SARAN
Dilakukan penelitian serupa dengan menambah jumlah individu kerbau dalam
setiap populasi yang di analisa polimorfisme proteinnya agar dapat diketahui variasi
genetik antar individu dalam populasi. Estimasi teknik perkawinan yang efektif untuk
dilakukan bahwa seluruh individu pada kluster 1 dapat dikawinkan dengan individu pada
kluster 2 tetapi hanya Malang1, Malang3 dan Malang4.
DAFTAR RUJUKAN
Clark.,D. 2005. Molecular Biology Understanding. Elsevier Academic Press
Publications. California
Faruque,M.O., 2007. The Genetic Diversity of Bangladesh Buffaloes. Italian Jounal
Animal Science. Volume 6, 349-352.
Gardner, E.J.,1991. Principles of Genetics. John Wiley and Sons, Inc.
8
Guyton, A.C., Hall, J.E. 2006. Textbook of Medical Physiology. 11th edition.
Philadelphia: Elsevier Saunders. p. 990-997, 1038-1050
Lukitasari, Marheny. 2011. Variasi genetik kerbau lokal (Bubalus bubalis) di wilayah
Madiun dan Malang Berdasarkan Profil dan Polimorfisme Protein Darah sebagai
Bahan Ajar Teknik Analisis Biologi Molekuler. Tesis. Universitas Negeri Malang.
Nei, M., 1978. The Theory of Genetic Distance and Evolution of Human Races. Japan
Society of Human Genetic. 23, 341-369.
Ogita, Z.I. and Markert, C.L., 1979. A Miniaturized System for Electroforesis on
Polyacrilamide Gels. Analytical Biochemestry, 99. 233-241.
Download