Download, PDF - Indonesia Veterinary Pharmacy and

Makalah ilmiah-3
The influences of Dexamethasone sodium phosphate to Insulin and Glucose
level in young male rats body (Rattus norvegicus)
Samsuri1, Rahardjo2 dan Sudjarwo3
1
Pharmacology Veteriner, Faculty of Veterinary Medicine, Udayana University, Jl.
P.B. Sudirman, Denpasar Bali 80231, Phone/fax: (0361) 223791
e-mail: [email protected],
2
Pharmacology Division, Medical Faculty Airlangga University, Surabaya,
3
Pharmacology division, faculty of Veterinary Medicine Airlangga University
Abstract
This study explores the effects of daily treatment of dexamethsone
subcutaneously on insulin and glucose level in young male rats (Rattus norvegicus).
Twenty four young male rats 3-4 months old with body weight 200-230 g
approximately were divided into two groups (first control group, receiving daily
subcutaneous injection of NaCl 0.9% and second group (the name of group
negative or treatments group) receiving daily subcutaneous injection of
dexamethasone 0.130 mg/kg. The treatment was given for 21 days. Insulin level
was measured by radio immunoassay (RIA) and glucose by enzymatic methode
(GOD-PAP).
The result showed that the second group was significantly increased the insulin
level (P<0.05) but significantly decreased the glucose level (P<0.05). The increased
of insulin level was higher than the decreased of glucose level. This result indicated
that Dexamethasone could decrease insulin signaling in peripheral tissue. The
mechanisms may be mediated via decrease of insulin to insulin receptor affinity,
phosphorylation of IRS-1, PI3-K, PKC, PKB and NO synthesis accompanied by
decrease GLUT4 translocation from sitoplasma to plasma membrane. Finally, to
maintenance normal glucose level was needed more insulin than normal.
Key words: Dexamethasone, insulin, insulin signaling, and GLUT4.
Pendahuluan
Insulin adalah hormon yang dihasilkan oleh kelenjar pankreas yang
berperan pada proses uptake glukosa pada jaringan perifer (otot rangka dan
adiposit). Ikatan antara insulin dengan reseptor insulin merupakan pemicu
serangkaian proses sinyal subseluler insulin (insulin signaling) yang akhirnya
mengakibatkan perpindahan Transporter Glukosa-4 (GLUT-4) dari
sitoplasma ke membran sel. Gangguan pada satu atau beberapa tahap
proses sinyal subseluler insulin yang disebabkan oleh kelebihan hormon
glukokortikoid endogen seperti pada kasus Chusing’s syndrome
mengakibatkan hambatan perpindahan GLUT-4 dari sitoplasma ke membran
plasma yang berdampak pada kadar insulin dan glukosa dalam plasma
(Dimitriadis et.al., 1997).
Deksametason (glukokortikoid sintetik) sebagai obat anti-inflamasi yang
banyak beredar di masyarakat umumnya digunakan untuk terapi inflamasi
Disampaikan dalam Kongres Nasional Pertama
Asosiasi Farmakologi dan Farmasi Veteriner Indonesia, Denpasar 26 Maret 2011
1
Makalah ilmiah-3
pada persendian atau arthritis rheumatoid dan alergi. Harganya yang murah
dan mudah mendapatkanya mengakibatkan obat ini masih menjadi andalan
untuk terapi penyakit tersebut. Pada kasus Chusing’s syndrome, kelebihan
glukokortikoid telah menimbulkan banyak masalah seperti resisten insulin,
diabetes, osteoporosis, sepsis dan penyakit kardiovaskuler (Katzung, 2001).
Penelitian ini dilakukan berdasarkan pengalaman empiris keluarga penulis,
yang menggunakan deksametason selama kurang lebih 5 tahun untuk terapi
arthritis rheumatoid yang berakhir dengan kematian karena simtoma seperti
sepsis, obesitas, dan nefritis interstisial kronis. Penelitian ini dilakukan untuk
mengetahui pengaruh pemberian deksametason sodium fosfat secara
subkutan yang diberikan sehari satu kali terhadap kadar insulin dan glukosa
serum pada tikus putih jantan muda (Rattus norvegicus).
Materi dan metode
Bahan yang digunakan adalah deksametason sodium fosfat (Dexamethasone
5 mg/ml, Harsen), NaCl 0,9%, tikus putih jantan (Rattus norwegicus) strain Wistar
berumur 3-4 bulan dengan berat badan 0,158 – 0,253 kg, makanan berasal dari
COMFEED (P.T. Japfa Comfeed Indonesia) yaitu PAR-L1, kandang, minuman
diberikan ad libitum, tissue, spuit, pemusing (sentrifuge) dan alkohol.
Alat untuk pemeriksaan insulin terdiri : serum, insulin Ab-coated tubes, insulin
yang terlabel radioaktif Iodida (*125I-Insulin), 7 kalibrator insulin (masing-masing
kalibrator mengandung insulin 0, 5, 15, 50, 100, 200 dan 350 µIU/ml), human
serum-based immunoassay control, aquades (deionized water, tabung
polypropylene 12 x 75 mm, pipet mikro (200 µl dan 1000 µl), pipet volumetric (3 ml
dan 6 ml), logit-log graph papper, Vortex mixer, Refrigerator, Gamma counter,
Decanting rack. Bahan dan alat untuk pemeriksaan glukosa terdiri : standar
glukosa, aquades dan reagen (phosphate buffer pH 7,5, phenol, POD (peroxidase),
GOD (glucose oksidase), 4-aminoantipyrine), tabung kaca (glass tube), fortex mixer,
pelat mikro (micro plate), dan mesin pembaca (automated photometric system)
dengan panjang gelombang 500 nm, Hg 546 nm.
Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental laboratorik dengan The
Posttes-Control Group Design (Zainudin, 2000). Rancangan penelitian terdiri 2
kelompok dengan replikasi 12 ; A adalah kelompok kontrol, hanya diberikan NaCl
0,9% sebanyak 0,5 ml secara subkutan dan B adalah kelompok yang diberikan
deksametason sodium fosfat 0,130 mg/kg/hari dalam NaCl 0,9% sebanyak 0,4 – 0,6
ml secara subkutan sesuai dengan berat badan tikus. Perlakuan diberikan sekali
dalam sehari selama 21 hari. Pemberian deksametason 0,130 mg/kg berat badan
secara subkutan selama 13 hari pada tikus putih pernah dilakukan oleh Barbera
et.al (2001) dan deksametason 2µg per hari secara subkutan selama 4 minggu
pada tikus putih juga pernah dilakukan oleh Severino et.al., (2002). Pengambilan
darah untuk pemeriksaan kadar insulin serum dilakukan pada hari ke-21 melalui
intrakardial setelah tikus dianestesi dengan eter secara inhalasi.
Pada penelitian ini pengukuran kadar insulin serum menggunakan Coated-ACount Insulin Radio Immuno Assay (RIA) (Fluitest Glu, GOD-PAP, 2001; Coat-ACount Insulin. 2003; Schteingart, 1985) dan kadar glukosa serum menggunakan
metode enzimatik regensia GOD-PAP (Glucose GOD FS. DiaSys Diagnostic
Systems, 2000; Rat Insulin RIA Kit, 250 Tubes (Cat.#RI-13K), 200; Mudjiono, 2000)
yang keduanya dilakukan di RSUD Dr Soetomo Surabaya. Sampel darah yang telah
diambil dari hewan coba dipusingkan (sentrifuge) untuk memisahkan serumnya.
Disampaikan dalam Kongres Nasional Pertama
Asosiasi Farmakologi dan Farmasi Veteriner Indonesia, Denpasar 26 Maret 2011
2
Makalah ilmiah-3
Prosedur pemeriksaan kadar insulin serum: (i) Plain Tubes. Pemberian label pada
4 tabung (1-4) yang tidak dilapisi antibodi (uncoated polypropylene tubes) yaitu T
(total counts) dan NSB (non-specific binding) masing-masing 2 tabung. (ii) Coated
Tubes. Pemberian label pada 14 tabung (5-18) yang terlapisi antibodi terhadap
insulin (insulin Ab-coated tubes) yaitu A (maximum binding), B sampai G masingmasing 2 tabung. Pemberian label juga dilakukan pada tabung yang terlapisi
antibodi terhadap insulin untuk kontrol dan sampel. (iii) Ditambahkan 200 µl
kalibrator nol A (zero calibrator A) pada tabung NSB dan A. Dilanjutkan dengan
penambahan 200 µl masing-masing kalibrator (B-G), kontrol (19-22) dan sampel
(23-n) yang akan diuji pada masing-masing tabung yang tersedia. Selanjutnya (i)
tambahkan 1,0 ml 125I-Insulin dengan segera pada masing-masing tabung dan
dihomogenasi dengan vortex mixer, kemudian (ii) inkubasi pada suhu 15-280C
selama 18-24 jam, dan (iii) proses decanting lakukan secara hati-hati pada semua
tabung (kecuali tabung T tidak dilakukan decanting) selama 2-3 menit. Jika terdapat
sisa residu cairan pada ujung tabung, dibersihkan dengan kertas absorben. Diakhiri
(iv) pembacaan pada gamma counter selama satu menit. Prosedur pemeriksaan
glukosa
diawali
dengan
memasukan
sepuluh
mikro
liter
sampel
serum/standar/blanko pada pelat mikro dan ditambahkan 1000 µl reagen seperti
pada Tabel 1.
Tabel 1. Prosedur pemeriksaan glukosa.
Bahan
Standar/Sampel
Aquades
Reagen
Blanko
10 µl
1000 µl
Standar/Sampel
10 µl
1000 µl
Setelah dilakukan pencampuran sesuai prosedur, diinkubasikan pada suhu 370C
selama 10 menit. Pembacaan absorbansi (A) standar dan sampel dilakukan dengan
menggunakan pembaca (automated photometric system) dengan panjang
gelombang 500 nm. Batas bawah pembacaan (sensitifitas) kadar glukosa plasma
dengan metode Glucose GOD FS /GOD-PAP adalah 1 mg/dl. Data dianalisis secara
statistik (Steel, Torrie, 1991) menggunakan Uji T dengan tingkat kepercayaan 5% (α
= 0,05). Analisis Uji T ini menggunakan software Statistical Package for The Social
Sciences (SPSS) version 10.0 for Windows.
Diskusi
Pengaruh pemberian deksametason sodium fosfat 0,130 mg/kg secara
subkutan selama 21 hari pada tikus putih jantan muda (Rattus norvegicus) terhadap
kadar insulin dan glukosa serum dapat dilihat pada Tabel 2.
Tabel 2. Pengaruh deksametason sodium fosfat terhadap kadar insulin dan glukosa
serum pada tikus putih jantan (Rattus norvegicus).
No
1
2
Kelompok
Jumlah
Kadar Glukosa (mg/dl)
Kadar Insulin (µIU/ml)
a
A
12
16.93 ± 05.04
177.08 ± 17.69c
b
B
12
34.87 ± 13.09
172.33 ± 45.32c
Total
24
Superscript : Notasi yang berbeda menunjukkan perbedaan yang signifikan (P<0,05) antara
kelompok perlakuan.
Disampaikan dalam Kongres Nasional Pertama
Asosiasi Farmakologi dan Farmasi Veteriner Indonesia, Denpasar 26 Maret 2011
3
Makalah ilmiah-3
Hasil penelitian menunjukkan bahwa pemberian deksametason sodium fosfat
0,130 mg/kg secara subkutan sekali per hari selama 21 hari pada tikus putih jantan
muda (Rattus norvegicus) umur 3-4 bulan meningkatkan kadar insulin serum secara
signifikan (P<0,05) yaitu lebih dua kali lipat dibandingkan kontrol dan diikuti dengan
penurunan kadar glukosa serum secara signifikan pula (P<0,05) meskipun tidak
sebesar perubahan insulin. Hiperinsulinemia ini mengindikasikan telah terjadi
penurunan sinyalisasi insulin pada proses uptake glukosa pada jaringan perifer.
Hiperinsulinemia yang terjadi merupakan akibat dari kompensasi hiperfungsi sel β
terhadap penurunan sinyalisasi insulin pada jaringan perifer seperti pada penelitian
yang dilakukan oleh Barbera et.al., (2001) dan Severino, et.al (2002).
Penurunan sinyalisasi insulin ini bisa berawal dari penurunan afinitas antara
insulin dengan bagian ekstraseluler reseptor insulin yaitu subunit α. Berdasarkan
penelitian yang dilakukan oleh Buren et al., (2002) pada kultur adiposit,
deksametason mampu menurunkan afinitas insulin dengan reseptor insulin sampai
40% dari normal. Secara normal hantaran sinyal insulin dimulai dengan terikatnya
insulin pada reseptor insulin ekstraseluler subunit α yang menyebabkan
autofosforilasi pada subunit β secara berurutan dan peningkatan aktivitas tirosin
kinase intrinsik yang merupakan langkah awal reaksi enzimatik yang kompleks.
Perubahan konformasi pada daerah subunit β akibat autofosforilasi merupakan
dasar penyediaan tempat ikatan bagi protein efektor seperti insulin receptor
substrate-1 (IRS-1) (Davani, 2003; Ducluzeau, et.al., 2002; Ebeling, et.al., 1998;
Katzung, 2001; Sedaghat, et.al., 2002; Zang, 2002).
Kedua, deksametason menghambat fosforilasi tirosin pada IRS-1 yang
merupakan mediator penting pada penghantaran sinyal insulin. IRS-1 merupakan
bagian terbesar IRS terfosforilasi tirosin yang diinduksi oleh stimulasi insulin pada
otot rangka dan adiposit manusia (Anne, et.al., 2003; Ducluzeau, et.al., 2002).
Fosforilasi tirosin pada IRS-1 yang terhambat mengakibatkan penurunan afinitas
IRS-1 dengan phosphotidylinositol-3-OH kinase (PI3K) yang lebih selanjutnya dapat
menyebabkan keadaan resisten insulin (Buren, 2002).
Ketiga penurunan sinyalisasi insulin disebabkan oleh penurunan aktivitas PI3K.
Berdasarkan penelitian yang dilakukan Buren, et.a.l (2002) pada kultur adiposit,
deksametason mampu menurunkan aktivasi PI3K sampai 20% dan PKB 40%. PI3K
adalah enzim heterodimer yang terdiri dari subunit regulator p85 dan subunit
katalitik p110. IRS yang terfosforilasi pada bagian tirosin, menyediakan tempat
ikatan untuk subunit regulator (p85) yang kemudian mengaktivasi subunit katalitik
(p110) dari PI3K. PI3K yang teraktivasi secara khusus memfosforilasi PI(3,4)P2
untuk membentukan PI(3,4,5)P3 yang diperlukan untuk aktivasi PKC atipikal dan
protein kinase B (PKB) secara langsung maupun melalui peningkatan aktivitas 3phosphoinositide-dependent protein kinase-1 (PDK-1) yang berperan penting untuk
translokasi GLUT4 (Davani, 2003; Farese, 2002; Letiges, et.al., 2002; Mendez,
et.al., 1997). Aktivasi PI3K yang terhambat dapat menurunkan pembentukan
PI(3,45)P3 dari PI(3,4)PI2 sebagai mediator penting untuk aktivasi PKC dan PKB.
Berdasarkan proses aktivasinya, PKC dapat digolongkan menjadi tiga
kelompok; atypical PKCs (λ, ζ, ι) membutuhkan PIP3, sedangkan conventional PKCs
(α, β1, β2, dan γ) dan novel PKCs (δ, ε, η, dan θ) membutuhkan DAG untuk proses
aktivasinya. Aktivasi PKC atipikal (tidak membutuhkan DAG tetapi PIP3 ) sangat
diperlukan sebagai terminal molecular switches on perpindahan GLUT4 dari
sitoplasma ke membran plasma, karena GLUT-4 bertanggung jawab pada proses
uptake glukosa pada sebagian besar jaringan terutama pada jaringan otot dan
Disampaikan dalam Kongres Nasional Pertama
Asosiasi Farmakologi dan Farmasi Veteriner Indonesia, Denpasar 26 Maret 2011
4
Makalah ilmiah-3
lemak (Anne, et.al., 2003; Dimitriadis, et.al., 1997; Ducluzeau, et.al., 2002; Ebeling,
et.al., 1998; Zang, 2002). PKC atipikal merupakan bagian penting pada patogenesis
dan terapi diabetes melitus tipe 2 dan sindrom resisten insulin (Farese 2002; Gaster
et.al., 2001; Letiges et.al., 2002; Sedaghat et.al., 2002; Wang et.al., 2000).
Faktor lain yang telah diketahui yang mempunyai peran pada proses uptake
glukosa adalah NO (nitric oxide). Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Brett
et.al. (2003) dan Wallerath et.al. (1999), deksametason menurunkan kemampuan
GTP cyclohydrolase-1 untuk menghasilkan tetrahydrobiopterin (BH4). BH4
berfungsi sebagai stabilisator endothelial nitric oxide synthase (eNOS) dimmer dan
meningkatkan afinitas eNOS terhadap arginin untuk menghasilkan NO.
Berdasarkan penelitian ini diperkirakan
bahwa akibat dari kompensasi
hiperfungsi sel β pakreas untuk mensintesis insulin, dengan jumlah yang lebih besar
dari normal terhadap penurunan sinyalisasi insulin proses uptake glukosa pada
jaringan perifer dan penurunan produksi NO.
Kesimpulan
Pemberian deksametason 0,130 mg/kg secara subkutan selama 21 hari pada
tikus putih jantan muda (Rattus norvegicus) mengakibatkan peningkatan kadar
insulin serum secara signifikan (P<0,05) dan penurunan kadar glukosa serum
secara signifikan pula(P<0,05). Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk
mengetahui (i) pengaruh pemberian deksametason secara subkutan pada tikus
putih jantan muda terhadap kadar insulin dan glukosa serum dengan waktu yang
lebih lama untuk mengetahui efek diabetogeniknya, (ii) intervensi yang tepat untuk
mencegah atau menghambat efek deksametason yang meningkatkan kadar insulin
serum.
Daftar pustaka
Anne MJ, Luciano P, Emmanuel VO, 2003. Molecular Mechanisms of Insulin
Receptor Substrate Protein-Mediated Modulation of Insulin Signaling. FEBS
Letters 546: 32-36.
Barbera M, Fierabracci V, Novelli M, Bombara M, Masiello P, Bergamini P, De Tata
V, 2001. Dexamethasone Induced Insulin Resistance and Pancreatic Adaptive
Response in Aging Rat Are Not Modified by Oral Vanadyl Sulfate Treatment.
Europ J Endocrinol 145:799-806.
Brett MM, Anne MD, Clinton RW, 2003. GTP Cyclohydrolase-1 Downregulation
Contributes to Glucocorticoid Hypertension in Rats. Hypertens 41(2):669-674.
Buren J, 2002. Glucose and Lipid Metabolism in Insulin Resistance. An
Experimental Study in Fat Cells. Dissertations, Umea University, Sweden.
Buren J, Liu HX, Jensen J, Eriksson JW, 2002. Dexamethasone Impairs Insulin
Signalling and Glucose Transport by Depletion of Insulin Receptor Subtrate-1,
Phosphatidylinositol 3-Kinase and Protein Kinase B in Primary Cultured Rat
Adipocytes. Eur J Endocrinol 146:419-429.
Coat-A-Count Insulin. 2003. DPC. Diagnostic Product Corporation. Los Angeles,
USA.
Disampaikan dalam Kongres Nasional Pertama
Asosiasi Farmakologi dan Farmasi Veteriner Indonesia, Denpasar 26 Maret 2011
5
Makalah ilmiah-3
Davani B, 2003. Increased Glucocorticoid Sensitivity in Pancreatic β-cells: Effects
on Glucose Metabolism and Insulin Release. Thesis, Karolinska Institutet,
Stockholm, Sweden.
Dimitriadis G, Leighton B, Parry-Billings M, Sasson S, Young M, Krause U, Bevan S,
Piva T, Wegener G, Newsholme EA, 1997. Effects of Glucocorticoid Excess on
The Sensitifity of Glucose Transport and Metabolism to Insulin in Rat Skeletal
Muscle. Biochem J 321:707-712.
Ducluzeau PH, Fletzher LM, Vidal H, Laville M, Tavare JM, 2002. Molecular
Mechanisms of Insulin-Stimulated Glucose Uptake in Adipocytes. Diabetes
Metab (Paris) 28:85-92.
Ebeling P, Koistinen HA, Koivisto VA, 1998. Insulin-Independent Glucose Transport
Regulates Insulin Sensitifity. FEBS Letters 436:301-303.
Farese RV, 2002. Function and Dysfunctionof aPKC Isoforms for Glucose Transport
in Insulin-Sensitive and Insulin-Resistant State. Am J Physiol Endocrinol Metab
283:E1-E11.
Fluitest Glu, GOD-PAP, 2001. Biocon Diagnostik, Germany.
Gaster M, Staehr P, Beck-Nielsen H, Schroder HD, Handberg A, 2001. GLUT4 is
Reduced in Slow Muscle Fibers of Type 2 Diabetic Patients: Is Insulin
Resistance in Type 2 Diabetes a Slow, Type 1 Fiber Disease? (Statistical Data
Included). Diabetes 50:1324-1329.
Glucose GOD FS. DiaSys Diagnostic Systems, 2000. Gmbh, Holzheim, Germany.
Katzung BG, 2001. Basic and Clinical Pharmacology. 8th Ed. Lange Medical
Book/McGraw-Hill, Medical Publishing Devision, USA.
Letiges M, Plomann M, Standaert ML, Bandyopadhyay G, Sajan MP, Kanoh Y,
Farese RV, 2002. Knockout of PKCα Enhances Insulin Signaling Through PI3K.
Mol Endocrinol 16(4):847-858.
Mendez R, Kollmorgen G, White MF, Rhoads RE, 1997. Requirement of Protein
Kinase Cζ for Stimulation of Protein Synthesis by Insulin. Mol and Cell Biol
9:5184-5192.
Mudjiono T, 2000. Efek Oksigen Tekanan Tinggi Terhadap Kadar Insulin Darah dan
Glukosa Darah Pada Penderita Diabetes Melitus. Tesis, Universitas Airlangga,
Surabaya.
Rat Insulin RIA Kit, 250 Tubes (Cat.#RI-13K), 2001. The Linco Research Inc.
Schteingart DE, 1985. Patofisiologi Konsep Klinik Proses-Proses Penyakit. Edisi 2,
Alih Bahasa: Adji Dharma, EGC, Jakarta. Hal 300-310.
Sedaghat AR, Sherman A, Quon MJ, 2002. A Mathematical Model of Metabolic
Insulin Signaling Pathways. Am J Physiol Endocrinol Metab 283:E1084-E1101.
Disampaikan dalam Kongres Nasional Pertama
Asosiasi Farmakologi dan Farmasi Veteriner Indonesia, Denpasar 26 Maret 2011
6
Makalah ilmiah-3
Severino C, Brizzi P, Solinas A, Secchi G, Maioli M, Tonolo G, 2002. Low-dose
Dexamethasone in The Rat: A Model Study Insulin Resistance. Am J Physiol
Endocrinol Metab 283:E367-E373.
Steel RGD, Torrie JH, 1991. Prinsip dan Prosedur Statistik. Suatu Pendekatan
Biometrik. Ed 1, Jakarta: Gramedia Pustaka Utama.
Wallerath T, Witte K, Schafer SC, Schwarz PM, Prellwitz W, Wohlfart P, Kleinert H,
Lehr HA, Lemmer B, Fostermann U, 1999. Downregulation of The Expression
of Endothelial NO Synthase is Likely to Contribute to Glucocorticoid Mediated
Hypertension. PNAS 96(23):13357-13362.
Wang L, Hayashi H, Kishi K, Huang L, Hagi A, Tamaoka K, Hawkins PT, Ebina Y,
2000. Gi-Mediated Translocation of GLUT4 is independent of p85/p110α and
p110γ Phosphoinositide 3-Kinase But Might Involve The Activation of Akt
Kinase. Biochem J 345:543-555.
Zainudin, 2000. Metodologi Penelitian. Universitas Airlangga, Surabaya. hal.53-54.
Zang BB, 2002. Insulin Signaling and Action: Glucose, Lipids and Protein. Diabetes
and Carbohydrate Metabolism, Editors; Goldfine, I.D. dan Rushakoff, R.J.
Endotex.com.
Disampaikan dalam Kongres Nasional Pertama
Asosiasi Farmakologi dan Farmasi Veteriner Indonesia, Denpasar 26 Maret 2011
7