laporan praktikum bioteknologi
advertisement
LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI “ISOLASI DNA KASAR” Disusun Oleh: Nama : Joko Pilianto NIM : 115040213111043 Kelompok : Jumat, 09.15 Asisten : Nilam PROGRAM STUDI AGROEKOTEKNOLOGI FAKULTAS PERTANIAN MALANG 2012 BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Dalam proses isolasi DNA tanaman, keberadaan polisacharida dan senyawa metabolit sekunder dalam sel tanaman sering menyulitkan dalam proses isolasi asam nukleat. Struktur polisacharida yang mirip dengan asam nukleat akan menyebabkan polisacharida tersebut akan mengendap bersama dengan asam nukleat. Penambahan senyawa pereduksi sepertri marchaptoetanol dan dithiothreitol dapat mencegar proses oksidasi senyawa fenolik sehingga menghambak aktivitas radikal bebas yang dihasilkan oleh oksidasi fenol terhadap asam nukleat (Wilkins dan Smart, 1996). Metabolit sekunder dan polisacharida juga dapat menghambat kerja enzim Adanya polosacharida dalam tanaman ditandai dengan kekentalan pada hasil isolasi DNA yang menyebabkan kesulitan dalam reaksi PCR akibat penghambatan aktivitas Taq polymerase Oleh karena itu diperlukan suatu teknik isolasi DNA genom tanaman yang tepat sehingga diperoleh kualitas DNA yang baik bagi proses amplifikasi PCR (Fang et al., 1992 dalam Porebski et al, 1997). Setiap tanaman pasti memiliki DNA dan DNA merupakan molekul utama yang mengkode semua informasi yang dibutuhkan untuk proses metabolisme dalam organisme. Dalam DNA ini tersusun atas 3 komponen utama yaitu gula deoksiribosa, basa nitrogen, dan fosfat yang tergabung membentuk nukleotida (Istanti, 1999). DNA terdapat di dalam setiap sel makhluk hidup yang sangat berperan penting sebagai pembawa informasi hereditas yang menentukan stuktur protein dan proses metabolisme lain. isolasi DNA dapat dilakukan melalui tahapan-tahapan antara lain: preparasi ekstrak sel, pemurnian DNA dari ekstrsk sel dan presipitasi DNA. Meskipun isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis atau bagian tanaman dapat memberikan hasil yang berbeda, hal ini dikarenakan adanya senyawa polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA Jamilah (2005). 1.2 Tujuan Tujuan dari praktikum isolasi Dna kasar adalah sebagai berikut : - Untuk mengetahui definisi isolasi DNA kasar - Untuk mengetahui faktor penentu keberhasilan dari isolasi DNA kasar - Untuk mengetahui tahapan isolasi DNA kasar dengan benar. 1.3 Manfaat Untuk mengetahui cara men isolasi DSNA kasar yang benar dari buah-buahan atau tubuhan, dan Mengetahui keefektifan deterjen dan buah yang dipakai yang di gunakan dalam percobaan isolasi DNA kasar. BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Definisi Isolasi DNA isolasi DNA merupakan kegiatan yang dapat dilakukan melalui tahapan-tahapan antara lain: preparasi ekstrak sel, pemurnian DNA dari ekstrsk sel dan presipitasi DNA. Meskipun isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis atau bagian tanaman dapat memberikan hasil yang berbeda, hal ini dikarenakan adanya senyawa polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA Jamilah (2005). DNA isolation is a routine procedure to collect DNA for subsequent molecular or forensic analysis. ''Isolasi DNA adalah prosedur rutin untuk mengumpulkan DNA untuk analisis molekul atau forensik berikutnya''(Wikipedia, 2012). 2.2 Macam Metode Isolasi DNA A. Metode CTAB Pada proses isolasi dengan metode CTAB dilakukan pembuatan bufer lisis (yang terdiri atas 0,2 M Tris-Cl pH 7,5 ; 0,05M EDTA pH 8,0 ; 2 M NaCl ; 2 % CTAB) dan bufer ekstraksi (terdiri dari 0,35 M sorbitol ; 0,1 M Tris-Cl pH 7,5 ; 5 mM EDTA ; dH2O). Potongan daun dimasukkan tabung 1,5 ml yang telah didinginkan dalam es, kemudian daun digerus dengan bantuan nitrogen cair. Setelah itu ditambahkan bufer isolasi DNA (campuran bufer lisis, bufer ekstraksi dan sarcocyl). Suspensi divortex sampai tercampur merata, kemudian diinkubasi selama 1 jam, pada suhu 65o C. Setelah 1 jam ditambah 750 µl kloroform - isoamil alkohol (24 : 1). Setelah homogen larutan disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama 5 menit, 40 C, lapisan atas diambil dan dimasukkan ke dalam tube 1,5 ml, kemudian ditambahkan larutan isopropanol dan divortex perlahan. Sentrifugasi dilakukan selama 5 menit, 12.000 rpm, pada suhu 40C, kemudian supernatan dibuang. Pelet dicuci menggunakan 500 µl EtOH 70 %, kemudian disentrifugasi 12.000 rpm, 3 menit dan supernatan dibuang. Sentrifugasi dilakukan kembali dengan kecepatan 12.000 rpm, 1 menit, kemudian supernatan dibuang dengan mikropipet. Pelet dikeringkan dan dilarutkan dengan 50 µl TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0 ; 1 mM EDTA pH 8,0). DNA disimpan pada suhu -200 C (Sambrook et al., 1989). B. Metode CTAB DNA genomik jarak pagar diisolasi dengan menggunakan 200 mg daun, yang dimasukkan ke dalam tabung eppendorf dan digerus dengan bantuan nitrogen cair. Ke dalam tabung ditambahkan 750 µl bufer ekstraksi CTAB. Campuran tersebut divorteks lalu diinkubasi dalam pemanas air selama 60 menit pada suhu 650 C. Setelah dibiarkan dingin hingga suhu kamar, campuran tersebut ditambahkan dengan 750 µl kloroform - isoamil alkohol ( 24 : 1 ). Campuran disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 12000 rpm pada suhu 40C. Lapisan atas dimasukkan ke dalam tabung eppendorft lain yang mengandung isopropanol dan dicampur merata. Setelah disentrifugasi selama 10 menit 11.000 rpm, endapan DNA dicuci dengan menambahkan etanol 76 % dan dikeringkan. Endapan DNA yang telah kering dilarutkan dalam 25 µl bufer TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0 ; 1 mM EDTA pH 8,0). DNA disimpan pada suhu 200 C (Doyle and Doyle, 1990). C. Metode SDS Pada pemakaian metode ekstraksi sebelum berlangsungnya proses isolasi DNA dilakukan pembuatan bufer pengekstrak yang terdiri atas 25 mM EDTA (pH 7,5), 50 mM TrisHCl (pH 8), 300 mM NaCl, SDS 1% dan H2O. Potongan daun tanaman jarak pagar dimasukkan tabung 1,5 ml yang telah didinginkan dalam es, kemudian digerus dengan menambahkan 400 ul buffer pengekstrak. Setelah cukup halus ditambahkan 100 ul buffer pengekstrak. Setelah itu diambil 400 ul larutan dan ditambah dengan 400 ul chloroform. Suspensi divortex sampai tercampur merata, kemudian dan setelah homogen larutan disentrifus dengan kecepatan 13.000 rpm selama 1 menit pada suhu 40C. Lapisan atas diambil dan dimasukkan ke dalam tube 1,5 ml, kemudian ditambahkan 800 µl Etabol absilut. Larutan disentrifugasi selama 3 menit, 13.000 rpm, pada suhu 40C, kemudian supernatan dibuang. Pelet dicuci kembali dengan menggunakan 500 µl EtOH 70 %. Supernatan dibuang, kemudian endapan dicuci kembali dengan etanol 70%, dan disentrifugasi 13.000 rpm, pada suhu 40C Zheng et al (1995). Supernatan dibuang kembali, dan pelet dikeringkan dengan menggunakan vakum. Setelah kering, pelet ditambah dengan 50 ul TE dan DNA disimpan pada suhu -200C (Zheng et al , 1995). Hasil isolasi DNA dengan berbagai teknik tersebut kemudian dielektroforesis pada 0,8% gel agarosa pada kondisi 50V selama 30 menit. Deteksi dilakukan menggunakan UV transluminator dan dilakukan pemotretan gell (Fauziah, 2010). 2.3 Tahap Isolasi DNA Ada 5 (lima) tahap untuk melakukan isolasi DNA, yaitu: 1. Isolasi jaringan Tahap pertama yang dilakukan yaitu mengisolasi jaringan yang ingin digunakan. 2. Pelisisan dinding dan membran sel Tahap selanjutnya yaitu melisiskan dinding dan membran sel dengan cara penggerusan (homogenasi), sentrifugasi dengan kecepatan lebih dari 10.000 rpm atau dengan menggunakan larutan pelisis sel atau buffer ekstraksi. Inti sel harus dilisiskan, karena substansi gen yang diinginkan ada di dalamnya. Penambahan larutan pelisis sel ini bertujuan untuk melisiskan sel yang tidak mengandung DNA agar sel yang mengandung inti sel dapat diisolasi atau dipisahkan dari komponen-komponen sel lainnya yang tidak berfungsi. 3. Pengekstraksian dalam larutan Selanjutnya supernatan yang terbentuk dibuang dan kemudian dilakukan ekstraksi di dalam larutan. Hal tersebut bertujuan agar didapat ekstrak. 4. Purifikasi Tahap ini bertujuan untuk membersihkan hasil ekstrak dari zat-zat lainnya. Pada larutan tersebut kemudian diberikan RNAse dan diinkubasi selama 10 menit pada suhu 65°C. Hal tersebut bertujuan untuk mengoptimalkan kerja enzim yang sangat dipengaruhi oleh temperatur. Penambahan RNAse berguna untuk menyingkirkan kontaminasi RNA sehingga DNA dapat diisolasi secara utuh. 5. Presipitasi Tahap terakhir, yaitu presipitasi bertujuan untuk mengendapkan protein histon, sehingga untai-untai DNA tidak lagi menggulung (coiling) dan berikatan dengan protein histon, yang menyebabkan DNA menjadi terlihat. Tahap presipitasi dilakukan dengan cara meneteskan larutan presipitasi protein dan kemudian divortex yang bertujuan untuk menghomogenkan larutan. Larutan presipitasi protein terdiri atas amonium asetat yang jika berikatan dengan protein mengakibatkan terbentuknya senyawa baru dengan kelarutan lebih rendah, sehingga menyebabkan protein mengendap. Larutan tersebut kemudian disentrifugasi kembali selama 5 menit dengan kecepatan 13.000 rpm. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas (Istanti, 1999) 2.4 Manfaat Isolasi DNA a. Visualisasi DNA dengan elektroforesis gel. b. Peninjauan pola fragmen DNA hasil pemotongan secara enzimatik melalui teknik Hibridisasi Southern c. Isolasi DNA genomik dalam rangka pembuatan pustaka genomik. d. Isolasi plasmid atau DNA fage dalam prosedur rutin peminakan DNA e. Isolasi DNA yang diperlukan sebagai cetakan (template) dalam prosedur perbanyakan DNA secara in vitro melalui teknik PCR. (Arumingtyas, 2012) BAB III METODOLOGI 3.1 Alat dan Bahan Alat : Mortar Pistil Tabung Reaksi Spatula Beker glass : untuk menghaluskan bahan : untuk menghaluskan bahan : untuk mengamati reaksi : untuk mengambil bahan : untuk tempat mencampur deterjen, garam, ekstrak mangga, serta etanol Gelas ukur : untuk mengukur volume larutan yang digunakan Pipet : untuk mengambil larutan Cutter/Pisau : untuk memotong mangga Timbangan Analitik : untuk menimbang bahan Rak tabung reaksi : untuk meletakkan tabung Bahan : Mangga : objek pengamatan Aquades : sebagai pelarut Garam : untuk memisahkan benang-benang DNA Etanol dingin : untuk melihat DNA mangga berupa benang halus putih Deterjen bubuk : untuk melihat kemampuan merusak sel Deterjen cair : untuk melihat kemampuan merusak sel Deterjen krim : untuk melihat kemampuan merusak sel 3.2 Langkah Kerja Timbang mangga 3 x 5 gram ↓ Dihaluskan dengan mortar ↓ Dimasukkan ke dalam gelas beker ↓ Tambah aquades 50 mL ↓ Tambah garam dan detergen dengan perbandingan 2,5 gram : 2,5 gram ↓ Aduk hingga homogen ↓ Diamkan 15 menit ↓ Ekstrak bahan ↓ Ambil dengan pipet @5 mL ↓ Tabung Reaksi ↓ Tambahkan Etanol dingin ↓ Amati gumpalan berupa benang-benang putih 3.3 Analisa Perlakuan Dalam peraktikum isolasi DNA kasar Penggunaan deterjen berfungsi untuk melisiskan barier (penghalang) sel secara kimia sebagai pengganti senyawa kimia yang mampu merusak dinding dan membran sel antara lain lisozim yang dapat mendegesti senyawa polimerik yang menyebabkan kekakuan sel dan etil endiamintetra asetat (EDTA) yang berfungsi untuk menghilangkan ion Mg2+ yang penting untuk mempertahankan keseluruhan struktur selubung sel, serta menghambat enzim-enzim seluler ynag dapat merusak DNA (ion Mg2+ merupakan kofaktor penting bagi DNAse yang biasa "memakan" DNA). Detergen bisa menyebabkan kerusakan membran sel dengan mengemulsi lipid dan protein sel serta menyela interaksi polar yang menyatukan membran sel karena detergen mengandung disodium EDTA dan lauryl sulfat yang memiliki fungsi yang sama dengan dodesil sulfat. Kegunaan garam memegang peranan penting yaitu untuk menghilangkan protein dan karbohidrat karena garam dapat menyebabkan keduanya terpresipitasi, dan bersama-sama dengan detergen, keduanya berfungsi seperti halnya lysing buffer. Dalam praktikum juga menggunakan Garam digunakan untuk melarutkan DNA, karena ion Na+ yang dikandung oleh garam mampu memblokir (membentuk ikatan) dengan kutub negatif fosfat DNA, yaitu kutub yang bisa menyebabkan molekul-molekul saling tolak mnolak satu sama lain sehinggga pada saat ion Na+ membentuk ikatan denagn kutub negatif fosfat DNA, DNA akan terkumpul. Jadi nampak bahwa selain digunakan untuk menghilangkan protein dan karbohidrat dan menjaga kesetabilan pH lysing buffer, garam juga membantu proses pemekatan DNA. Dan penggunaan Etanol dingin berfungsi untuk pengikatan strand DNA yang telah terkumpul kerena pemekatan oleh garam, karena kerapatan etanol lebih kecil dibandingkan kerapatan air maka etanol akan berada di bagian atas larutan pada tabung reaksi. Strand-strand DNA yang terikat oleh alkohol akan nampak sebagi benang-benang putih yang terapung di atas filtrat. BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Hasil Dokumentasi Mangga yang sudah dikupas dan ditimbang dihaluskan dengan menggunakan mortar Mangga halus dimasukkan ke dalam gelas ukur dan ditambahkan garam serta deterjen Ditambahkan aquadesh dan dihomogenkan kemudian didiamkan 10 menit Disaring dan diambil 5 ml Hasil yang sudah dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan diberi label dan diamati Keterangan : Tabung 1 : deterjen bubuk Tabung 2 : deterjen cair Tabung 3 : deterjen krim 4.2 Pembahasan Dalam praktium Isolasi DNA kasar di dapatkan hasil bahwa deterjen bubuk memiliki kemampuan merusak membran sel yang paling tinggi dibandingkan dengan deterjen krim dan deterjen cair. Hal tersebut ditandai dengan banyaknya benangbenang berwarna putih yang muncul dari larutan buah mangga dan aquades tersebut. Diantara detergen semua deterjen, deterjen bubuk menghasilkan warna yang paling baik, yaitu putih, detergen krim memberikan warna yang kurang baik karena menyebabkan warna filtrat mendekati warna detergen, sehingga isolasi DNA yang dihasilkan berwarna sama atau hampir sama dengan filtrat. Sementara pada isolat yang dihasilkan dari filtrat yang menggunakan detergen cair tidak menunjukkan adanya prespitasi DNA yang baik, kalaupun ada, konsentrasi dan viskositasnya sangat rendah. Pernyataan Jamilah tersebut dapat kita berikan pada isolasi DNA yang terjadi pada buah dengan konsentrasi air tinggi (Jamilah,2005). V PENUTUP 5.1 Kesimpulan Untuk praktikum isolasi DNA yang dilakukan dengan mengunakan daging mangga arum manis yang di kupas dan di ambil dagingnya kemudian di haluskan dan di ketahui DNA nya secara kasar, diketahui pula bahwa jenis detergen berpenuh terhadap hasil isolasi DNA dan jenis detergen tertentu memberikan pengaruh paling baik terhadap jenis buah tertentu pula dengan kadar air berbeda. Dari data dapat diketahui bahwa deterjen bubuk memiliki kemampuan merusak membran sel yang paling tinggi dibandingkan dengan deterjen krim dan deterjen cair. Hal tersebut ditandai dengan banyaknya benang-benang berwarna putih yang muncul dari larutan buah mangga dan aquades tersebut jadi dapat disimpulkan bahwa penggunaan deterjen sanggat mempengaruhi hasil isolasi DNA kasar. 5.2 Saran Praktikum : Untuk praktikum isolasi DNA kasar sudah baik, tapi alangkah baiknya alat dan bahan praktikum di perbanyak sehingga mahasiswa semua dapat praktikum satu persatu dengan lebih jelas dan detail. Asisten : embaknya baik dan enerjik dalam penyampaian materi, semoga mbk nilam cepat sembuh ya katanya kemarin sakit. Amin. Terimakasih ya mbak . Cius lo...me apa.,,,? DAFTAR PUSTAKA Arumingtyas, EL. 2011. Isolasi DNA dan RAPD. Disampaikan pada Pelatihan Fauziah, L. 2010. Isolasi DNA. Available on http://misspurplepharmacy.blogspot. com/2010/01/isolasi-dna.html. Diakses tanggal 15 Februari 2012. Istanti, Annie. 1999. Biologi Sel. Malang: jurusan Biologi FMIPA UM. Jamilah. 2005. Pengaruh Berbagai Macam Deterjen, Penambahan Garam dan Ekstrak Nanas (Ananas Comusus) terhadap Hasil Isolasi DNA Berbagai Macam Buah sebagai Topik Praktikum Mata Kuliah Genetika. Skripsi tidak diterbitkan. Malang: Prtogram Sarjana Biologi. Mustahib. 2012. . Available on http://biologi.blogsome.com/ 2012/02/11/isolasi-dna-metode-kitchen-preparation/. Diakses tanggal 22 Februari 2012.
