laporan praktikum bioteknologi

LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI
“ISOLASI DNA KASAR”
Disusun Oleh:
Nama
: Joko Pilianto
NIM
: 115040213111043
Kelompok
: Jumat, 09.15
Asisten
: Nilam
PROGRAM STUDI AGROEKOTEKNOLOGI
FAKULTAS PERTANIAN
MALANG
2012
BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Dalam proses isolasi DNA tanaman, keberadaan polisacharida
dan senyawa metabolit sekunder dalam sel tanaman sering
menyulitkan dalam proses isolasi asam nukleat. Struktur
polisacharida yang mirip dengan asam nukleat akan menyebabkan
polisacharida tersebut akan mengendap bersama dengan asam
nukleat. Penambahan senyawa pereduksi sepertri marchaptoetanol
dan dithiothreitol dapat mencegar proses oksidasi senyawa fenolik
sehingga menghambak aktivitas radikal bebas yang dihasilkan oleh
oksidasi fenol terhadap asam nukleat (Wilkins dan Smart, 1996).
Metabolit sekunder dan polisacharida juga dapat menghambat kerja
enzim Adanya polosacharida dalam tanaman ditandai dengan
kekentalan pada hasil isolasi DNA yang menyebabkan kesulitan
dalam reaksi PCR akibat penghambatan aktivitas Taq polymerase
Oleh karena itu diperlukan suatu teknik isolasi DNA genom tanaman
yang tepat sehingga diperoleh kualitas DNA yang baik bagi proses
amplifikasi PCR (Fang et al., 1992 dalam Porebski et al, 1997).
Setiap tanaman pasti memiliki DNA dan DNA merupakan
molekul utama yang mengkode semua informasi yang dibutuhkan
untuk proses metabolisme dalam organisme. Dalam DNA ini
tersusun atas 3 komponen utama yaitu gula deoksiribosa, basa
nitrogen, dan fosfat yang tergabung membentuk nukleotida (Istanti,
1999). DNA terdapat di dalam setiap sel makhluk hidup yang sangat
berperan penting sebagai pembawa informasi hereditas yang
menentukan stuktur protein dan proses metabolisme lain.
isolasi DNA dapat dilakukan melalui tahapan-tahapan antara
lain: preparasi ekstrak sel, pemurnian DNA dari ekstrsk sel dan
presipitasi DNA. Meskipun isolasi DNA dapat dilakukan dengan
berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis atau bagian tanaman
dapat memberikan hasil yang berbeda, hal ini dikarenakan adanya
senyawa polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang
dapat menghambat pemurnian DNA Jamilah (2005).
1.2 Tujuan
Tujuan dari praktikum isolasi Dna kasar adalah sebagai
berikut :
- Untuk mengetahui definisi isolasi DNA kasar
- Untuk mengetahui faktor penentu keberhasilan dari isolasi DNA
kasar
- Untuk mengetahui tahapan isolasi DNA kasar dengan benar.
1.3 Manfaat
Untuk mengetahui cara men isolasi DSNA kasar yang benar
dari buah-buahan atau tubuhan, dan Mengetahui keefektifan deterjen
dan buah yang dipakai yang di gunakan dalam percobaan isolasi
DNA kasar.
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Definisi Isolasi DNA
isolasi DNA merupakan kegiatan yang dapat dilakukan
melalui tahapan-tahapan antara lain: preparasi ekstrak sel, pemurnian
DNA dari ekstrsk sel dan presipitasi DNA. Meskipun isolasi DNA
dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis
atau bagian tanaman dapat memberikan hasil yang berbeda, hal ini
dikarenakan adanya senyawa polifenol dan polisakarida dalam
konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA Jamilah
(2005).
DNA isolation is a routine procedure to collect DNA for
subsequent molecular or forensic analysis.
''Isolasi DNA adalah prosedur rutin untuk mengumpulkan DNA
untuk analisis molekul atau forensik berikutnya''(Wikipedia, 2012).
2.2 Macam Metode Isolasi DNA
A. Metode CTAB
Pada proses isolasi dengan metode CTAB dilakukan
pembuatan bufer lisis (yang terdiri atas 0,2 M Tris-Cl pH 7,5 ;
0,05M EDTA pH 8,0 ; 2 M NaCl ; 2 % CTAB) dan bufer
ekstraksi (terdiri dari 0,35 M sorbitol ; 0,1 M Tris-Cl pH 7,5 ; 5 mM
EDTA ; dH2O). Potongan daun dimasukkan tabung 1,5 ml yang telah
didinginkan dalam es, kemudian daun digerus dengan bantuan
nitrogen cair. Setelah itu ditambahkan bufer isolasi DNA (campuran
bufer lisis, bufer ekstraksi dan sarcocyl). Suspensi divortex sampai
tercampur merata, kemudian diinkubasi selama 1 jam, pada suhu 65o
C. Setelah 1 jam ditambah 750 µl kloroform - isoamil alkohol (24 :
1). Setelah homogen larutan disentrifugasi dengan kecepatan 12.000
rpm selama 5 menit, 40 C, lapisan atas diambil dan dimasukkan ke
dalam tube 1,5 ml, kemudian ditambahkan larutan isopropanol dan
divortex perlahan. Sentrifugasi dilakukan selama 5 menit, 12.000
rpm, pada suhu 40C, kemudian supernatan dibuang. Pelet dicuci
menggunakan 500 µl EtOH 70 %, kemudian disentrifugasi 12.000
rpm, 3 menit dan supernatan dibuang. Sentrifugasi dilakukan
kembali dengan kecepatan 12.000 rpm, 1 menit, kemudian
supernatan dibuang dengan mikropipet. Pelet dikeringkan dan
dilarutkan dengan 50 µl TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0 ; 1 mM EDTA
pH 8,0). DNA disimpan pada suhu -200 C (Sambrook et al., 1989).
B. Metode CTAB
DNA genomik jarak pagar diisolasi dengan menggunakan
200 mg daun, yang dimasukkan ke dalam tabung eppendorf dan
digerus dengan bantuan nitrogen cair. Ke dalam tabung ditambahkan
750 µl bufer ekstraksi CTAB. Campuran tersebut divorteks lalu
diinkubasi dalam pemanas air selama 60 menit pada suhu 650 C.
Setelah dibiarkan dingin hingga suhu kamar, campuran tersebut
ditambahkan dengan 750 µl kloroform - isoamil alkohol ( 24 : 1 ).
Campuran disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 12000
rpm pada suhu 40C. Lapisan atas dimasukkan ke dalam tabung
eppendorft lain yang mengandung isopropanol dan dicampur merata.
Setelah disentrifugasi selama 10 menit 11.000 rpm, endapan DNA
dicuci dengan menambahkan etanol 76 % dan dikeringkan. Endapan
DNA yang telah kering dilarutkan dalam 25 µl bufer TE (10 mM
Tris-HCl pH 8,0 ; 1 mM EDTA pH 8,0). DNA disimpan pada suhu 200 C (Doyle and Doyle, 1990).
C. Metode SDS
Pada pemakaian metode ekstraksi sebelum berlangsungnya
proses isolasi DNA dilakukan pembuatan bufer pengekstrak yang
terdiri atas 25 mM EDTA (pH 7,5), 50 mM TrisHCl (pH 8), 300 mM
NaCl, SDS 1% dan H2O. Potongan daun tanaman jarak pagar
dimasukkan tabung 1,5 ml yang telah didinginkan dalam es,
kemudian digerus dengan menambahkan 400 ul buffer pengekstrak.
Setelah cukup halus ditambahkan 100 ul buffer pengekstrak. Setelah
itu diambil 400 ul larutan dan ditambah dengan 400 ul chloroform.
Suspensi divortex sampai tercampur merata, kemudian dan setelah
homogen larutan disentrifus dengan kecepatan 13.000 rpm selama 1
menit pada suhu 40C. Lapisan atas diambil dan dimasukkan ke dalam
tube 1,5 ml, kemudian ditambahkan 800 µl Etabol absilut. Larutan
disentrifugasi selama 3 menit, 13.000 rpm, pada suhu 40C, kemudian
supernatan dibuang. Pelet dicuci kembali dengan menggunakan 500
µl EtOH 70 %. Supernatan dibuang, kemudian endapan dicuci
kembali dengan etanol 70%, dan disentrifugasi 13.000 rpm, pada
suhu 40C Zheng et al (1995).
Supernatan dibuang kembali, dan pelet dikeringkan dengan
menggunakan vakum. Setelah kering, pelet ditambah dengan 50 ul
TE dan DNA disimpan pada suhu -200C (Zheng et al , 1995).
Hasil isolasi DNA dengan berbagai teknik tersebut
kemudian dielektroforesis pada 0,8% gel agarosa pada kondisi 50V
selama 30 menit. Deteksi dilakukan menggunakan UV
transluminator dan dilakukan pemotretan gell (Fauziah, 2010).
2.3 Tahap Isolasi DNA
Ada 5 (lima) tahap untuk melakukan isolasi DNA, yaitu:
1. Isolasi jaringan
Tahap pertama yang dilakukan yaitu mengisolasi jaringan
yang ingin digunakan.
2. Pelisisan dinding dan membran sel
Tahap selanjutnya yaitu melisiskan dinding dan membran sel
dengan
cara penggerusan (homogenasi), sentrifugasi dengan
kecepatan lebih dari 10.000 rpm atau dengan menggunakan larutan
pelisis sel atau buffer ekstraksi. Inti sel harus dilisiskan, karena
substansi gen yang diinginkan ada di dalamnya. Penambahan larutan
pelisis sel ini bertujuan untuk melisiskan sel yang tidak mengandung
DNA agar sel yang mengandung inti sel dapat diisolasi atau
dipisahkan dari komponen-komponen sel lainnya yang tidak
berfungsi.
3. Pengekstraksian dalam larutan
Selanjutnya supernatan yang terbentuk dibuang dan
kemudian dilakukan ekstraksi di dalam larutan. Hal tersebut
bertujuan agar didapat ekstrak.
4. Purifikasi
Tahap ini bertujuan untuk membersihkan hasil ekstrak dari
zat-zat lainnya. Pada larutan tersebut kemudian diberikan RNAse
dan diinkubasi selama 10 menit pada suhu 65°C. Hal tersebut
bertujuan untuk mengoptimalkan kerja enzim yang sangat
dipengaruhi oleh temperatur. Penambahan RNAse berguna untuk
menyingkirkan kontaminasi RNA sehingga DNA dapat diisolasi
secara utuh.
5. Presipitasi
Tahap terakhir, yaitu presipitasi bertujuan untuk
mengendapkan protein histon, sehingga untai-untai DNA tidak lagi
menggulung (coiling) dan berikatan dengan protein histon, yang
menyebabkan DNA menjadi terlihat. Tahap presipitasi dilakukan
dengan cara meneteskan larutan presipitasi protein dan kemudian
divortex yang bertujuan untuk menghomogenkan larutan. Larutan
presipitasi protein terdiri atas amonium asetat yang jika berikatan
dengan protein mengakibatkan terbentuknya senyawa baru dengan
kelarutan lebih rendah, sehingga menyebabkan protein mengendap.
Larutan tersebut kemudian disentrifugasi kembali selama 5 menit
dengan kecepatan 13.000 rpm. Prinsip utama sentrifugasi adalah
memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara
memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat
akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan
terletak di atas (Istanti, 1999)
2.4 Manfaat Isolasi DNA
a. Visualisasi DNA dengan elektroforesis gel.
b. Peninjauan pola fragmen DNA hasil pemotongan secara enzimatik
melalui teknik Hibridisasi Southern
c. Isolasi DNA genomik dalam rangka pembuatan pustaka genomik.
d. Isolasi plasmid atau DNA fage dalam prosedur rutin peminakan
DNA
e. Isolasi DNA yang diperlukan sebagai cetakan (template) dalam
prosedur perbanyakan DNA secara in vitro melalui teknik PCR.
(Arumingtyas, 2012)
BAB III
METODOLOGI
3.1 Alat dan Bahan
Alat :
 Mortar
 Pistil
 Tabung Reaksi
 Spatula
 Beker glass
: untuk menghaluskan bahan
: untuk menghaluskan bahan
: untuk mengamati reaksi
: untuk mengambil bahan
: untuk tempat mencampur deterjen, garam,
ekstrak mangga, serta etanol
 Gelas ukur
: untuk mengukur volume larutan yang
digunakan
 Pipet
: untuk mengambil larutan
 Cutter/Pisau
: untuk memotong mangga
 Timbangan Analitik : untuk menimbang bahan
 Rak tabung reaksi
: untuk meletakkan tabung
Bahan :
 Mangga
: objek pengamatan
 Aquades
: sebagai pelarut
 Garam
: untuk memisahkan benang-benang DNA
 Etanol dingin
: untuk melihat DNA mangga berupa benang
halus putih
 Deterjen bubuk
: untuk melihat kemampuan merusak sel
 Deterjen cair
: untuk melihat kemampuan merusak sel
 Deterjen krim
: untuk melihat kemampuan merusak sel
3.2 Langkah Kerja
Timbang mangga 3 x 5 gram
↓
Dihaluskan dengan mortar
↓
Dimasukkan ke dalam gelas beker
↓
Tambah aquades 50 mL
↓
Tambah garam dan detergen
dengan perbandingan 2,5 gram : 2,5 gram
↓
Aduk hingga homogen
↓
Diamkan 15 menit
↓
Ekstrak bahan
↓
Ambil dengan pipet @5 mL
↓
Tabung Reaksi
↓
Tambahkan Etanol dingin
↓
Amati gumpalan berupa benang-benang putih
3.3 Analisa Perlakuan
Dalam peraktikum isolasi DNA kasar Penggunaan deterjen
berfungsi untuk melisiskan barier (penghalang) sel secara kimia
sebagai pengganti senyawa kimia yang mampu merusak dinding dan
membran sel antara lain lisozim yang dapat mendegesti senyawa
polimerik yang menyebabkan kekakuan sel dan etil endiamintetra
asetat (EDTA) yang berfungsi untuk menghilangkan ion Mg2+ yang
penting untuk mempertahankan keseluruhan struktur selubung sel,
serta menghambat enzim-enzim seluler ynag dapat merusak DNA
(ion Mg2+ merupakan kofaktor penting bagi DNAse yang biasa
"memakan" DNA). Detergen bisa menyebabkan kerusakan membran
sel dengan mengemulsi lipid dan protein sel serta menyela interaksi
polar yang menyatukan membran sel karena detergen mengandung
disodium EDTA dan lauryl sulfat yang memiliki fungsi yang sama
dengan
dodesil
sulfat.
Kegunaan garam memegang peranan penting yaitu untuk
menghilangkan protein dan karbohidrat karena garam dapat
menyebabkan keduanya terpresipitasi, dan bersama-sama dengan
detergen, keduanya berfungsi seperti halnya lysing buffer.
Dalam praktikum juga menggunakan Garam digunakan untuk
melarutkan DNA, karena ion Na+ yang dikandung oleh garam
mampu memblokir (membentuk ikatan) dengan kutub negatif fosfat
DNA, yaitu kutub yang bisa menyebabkan molekul-molekul saling
tolak mnolak satu sama lain sehinggga pada saat ion Na+
membentuk ikatan denagn kutub negatif fosfat DNA, DNA akan
terkumpul. Jadi nampak bahwa selain digunakan untuk
menghilangkan protein dan karbohidrat dan menjaga kesetabilan pH
lysing buffer, garam juga membantu proses pemekatan DNA. Dan
penggunaan Etanol dingin berfungsi untuk pengikatan strand DNA
yang telah terkumpul kerena pemekatan oleh garam, karena
kerapatan etanol lebih kecil dibandingkan kerapatan air maka etanol
akan berada di bagian atas larutan pada tabung reaksi. Strand-strand
DNA yang terikat oleh alkohol akan nampak sebagi benang-benang
putih yang terapung di atas filtrat.
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil
Dokumentasi
Mangga yang sudah dikupas
dan ditimbang dihaluskan
dengan menggunakan mortar
Mangga halus dimasukkan ke
dalam gelas ukur dan
ditambahkan garam serta
deterjen
Ditambahkan aquadesh dan
dihomogenkan kemudian
didiamkan 10 menit
Disaring dan diambil 5 ml
Hasil yang sudah dimasukkan
ke dalam tabung reaksi dan
diberi label dan diamati
Keterangan :
Tabung 1 : deterjen bubuk
Tabung 2 : deterjen cair
Tabung 3 : deterjen krim
4.2 Pembahasan
Dalam praktium Isolasi DNA kasar di dapatkan hasil
bahwa deterjen bubuk memiliki kemampuan merusak membran
sel yang paling tinggi dibandingkan dengan deterjen krim dan
deterjen cair. Hal tersebut ditandai dengan banyaknya benangbenang berwarna putih yang muncul dari larutan buah mangga
dan aquades tersebut.
Diantara detergen semua deterjen, deterjen bubuk
menghasilkan warna yang paling baik, yaitu putih, detergen
krim memberikan warna yang kurang baik karena menyebabkan
warna filtrat mendekati warna detergen, sehingga isolasi DNA
yang dihasilkan berwarna sama atau hampir sama dengan filtrat.
Sementara pada isolat yang dihasilkan dari filtrat yang
menggunakan detergen cair tidak menunjukkan adanya
prespitasi DNA yang baik, kalaupun ada, konsentrasi dan
viskositasnya sangat rendah. Pernyataan Jamilah tersebut dapat
kita berikan pada isolasi DNA yang terjadi pada buah dengan
konsentrasi air tinggi (Jamilah,2005).
V PENUTUP
5.1 Kesimpulan
Untuk praktikum isolasi DNA yang dilakukan dengan
mengunakan daging mangga arum manis yang di kupas dan di ambil
dagingnya kemudian di haluskan dan di ketahui DNA nya secara
kasar, diketahui pula bahwa jenis detergen berpenuh terhadap hasil
isolasi DNA dan jenis detergen tertentu memberikan pengaruh paling
baik terhadap jenis buah tertentu pula dengan kadar air berbeda. Dari
data dapat diketahui bahwa deterjen bubuk memiliki kemampuan
merusak membran sel yang paling tinggi dibandingkan dengan
deterjen krim dan deterjen cair. Hal tersebut ditandai dengan
banyaknya benang-benang berwarna putih yang muncul dari larutan
buah mangga dan aquades tersebut jadi dapat disimpulkan bahwa
penggunaan deterjen sanggat mempengaruhi hasil isolasi DNA kasar.
5.2 Saran
Praktikum : Untuk praktikum isolasi DNA kasar sudah baik,
tapi alangkah baiknya alat dan bahan praktikum di perbanyak
sehingga mahasiswa semua dapat praktikum satu persatu dengan
lebih jelas dan detail.
Asisten : embaknya baik dan enerjik dalam penyampaian
materi, semoga mbk nilam cepat sembuh ya katanya kemarin sakit.
Amin. Terimakasih ya mbak . Cius lo...me apa.,,,?
DAFTAR PUSTAKA
Arumingtyas, EL. 2011. Isolasi DNA dan RAPD. Disampaikan
pada Pelatihan
Fauziah, L. 2010. Isolasi DNA. Available on http://misspurplepharmacy.blogspot. com/2010/01/isolasi-dna.html.
Diakses tanggal 15 Februari 2012.
Istanti, Annie. 1999. Biologi Sel. Malang: jurusan Biologi FMIPA
UM.
Jamilah. 2005. Pengaruh Berbagai Macam Deterjen, Penambahan
Garam dan Ekstrak Nanas (Ananas Comusus) terhadap
Hasil Isolasi DNA Berbagai Macam Buah sebagai Topik
Praktikum Mata Kuliah Genetika. Skripsi tidak
diterbitkan. Malang: Prtogram Sarjana Biologi.
Mustahib. 2012. . Available on http://biologi.blogsome.com/
2012/02/11/isolasi-dna-metode-kitchen-preparation/.
Diakses tanggal 22 Februari 2012.