8 BAB II KAJIAN PUSTAKA 2.1 Radikal Bebas Radikal

8
BAB II
KAJIAN PUSTAKA
2.1 Radikal Bebas
Radikal bebas adalah suatu atom, gugus, atau molekul yang memiliki satu
atau lebih elektron yang tidak berpasangan pada orbit paling luar, termasuk atom
hidrogen, logam-logam transisi, dan molekul oksigen. Adanya ‘elektron tidakberpasangan’ ini, menyebabkan radikal bebas secara kimiawi menjadi sangat
aktif. Radikal bebas dapat bermuatan positif (kation), negatif (anion), atau tidak
bermuatan (Halliwell dan Gutteridge, 2000).
Sumber radikal bebas bisa berasal dari proses metabolisme dalam tubuh
(internal) dan dapat berasal dari luar tubuh (eksternal). Dari dalam tubuh
mencakup superoksida (O2*), hidroksil (*OH), peroksil (ROO*), hidrogen
peroksida (H2O2), singlet oksigen (1O2), oksida nitrit (NO*), dan peroksinitrit
(ONOO*). Dari luar tubuh antara lain berasal dari: asap rokok, polusi, radiasi,
sinar UV, obat, pestisida, limbah industri, dan ozon (Siswono, 2005).
Radikal bebas pada umumnya dapat mempunyai efek yang sangat
menguntungkan, seperti membantu destruksi sel-sel mikroorganisme dan kanker.
Akan tetapi, produksi radikal bebas yang berlebihan dan produksi antioksidan
yang tidak memadai dapat menyebabkan kerusakan sel-sel jaringan dan enzimenzim. Kerusakan jaringan dapat terjadi akibat gangguan oksidatif yang
disebabkan oleh radikal bebas asam lemak atau dikenal sebagai peroksidasi lipid.
Aktivitas radikal bebas dapat menjadi penyebab atau mendasari berbagai keadaan
9
patologis. Di antara senyawa-senyawa oksigen reaktif, radikal hidroksil (‘OH)
merupakan senyawa yang paling berbahaya karena mempunyai tingkat reaktivitas
sangat tinggi. Radikal hidroksil dapat merusak tiga jenis senyawa yang penting
untuk mempertahankan integritas sel yaitu:
(1) Asam lemak tak jenuh jamak (PUFA) yang merupakan komponen penting
fosfolipid penyusun membran sel
(2) DNA, yang merupakan piranti genetik dari sel.
(3) Protein, yang memegang berbagai peran penting seperti enzim, reseptor,
antibodi,
pembentuk matriks, dan sitoskeleton (Halliwell dan Gutteridge,
2000 ; Papas, 1999).
Regulasi jumlah radikal bebas secara normal dalam sistem biologis tubuh
dilakukan oleh enzim-enzim antioksidan endogenous seperti enzim SOD, GPx,
dan CAT. Pengukuran radikal bebas di dalam tubuh sangat sulit dilakukan karena
radikal bebas bereaksi sangat cepat sehingga seringkali dilakukan pengukuran
tidak langsung melalui produk turunannya seperti MDA dan 4-hidroksinonenal.
Kedua senyawa tersebut sering digunakan untuk pengukuran reaksi radikal bebas
lipid (Nabet, 1996).
2.2 Malondialdehida
Menurut Leibler et al. (1997), MDA merupakan produk enzimatis dan
nonenzimatis dari pemecahan prostaglandin endoperoksida dan produk akhir dari
lipid peroksidasi.
MDA merupakan molekul reaktif yang memiliki rumus
molekul C3H4O2 dan dikenal sebagai penanda (marker) peroksidasi lipid.
10
Pengukuran MDA banyak dilakukan oleh para peneliti sebagai indeks
tidak langsung dari kerusakan oksidatif yang disebabkan oleh peroksidasi lipid.
Menurut pernyataan Tokur et al. (2006), prinsip pengukuran MDA adalah rekasi
satu molekul MDA dengan dua molekul asam tiobarbiturat (TBA) membentuk
kompleks senyawa MDA-TBA yang berwarna pink dan kuantitasnya dapat dibaca
dengan spektrofotometer.
Beberapa penelitian mengenai MDA dilakukan oleh para ahli seperti yang
dilakukan oleh Prangdimurti et al. (2006), yang menyatakan bahwa terjadi
penurunan kadar MDA pada hati tikus Sprague Dawley yang diberi asupan
ekstrak daun suji. Hasil penelitian Jawi et al. (2008) juga menyatakan terjadinya
penurunan kadar MDA pada darah dan hati mencit jantan galur Swiss setelah
diberi asupan ekstrak ubi jalar ungu. Puspawati (2009) menyatakan bahwa asupan
sorgum dan jewawut yang kaya antioksidan dapat menurunkan kadar MDA pada
hati tikus Sprague Dawley. Penelitian yang dilakukan oleh Kutlu et al. (2009)
pada tikus hiperkolesterolemia yang disuplementasi dengan ‘apricot cernel oil’,
memberikan hasil yang signifikan terhadap penurunan MDA pada hatinya.
2.3 Antioksidan
Antioksidan merupakan senyawa yang dapat menghambat spesies oksigen
reaktif, spesies nitrogen, dan radikal bebas lainnya sehingga mampu mencegah
penyakit-penyakit degeneratif seperti kardiovaskular, kanker, dan penuaan.
Senyawa antioksidan merupakan substansi yang diperlukan tubuh untuk
menetralisir radikal bebas dan mencegah kerusakan yang ditimbulkan oleh radikal
11
bebas terhadap sel normal, protein, dan lemak. Senyawa ini memiliki struktur
molekul yang dapat memberikan elektronnya kepada molekul radikal bebas tanpa
terganggu sama sekali fungsinya dan dapat memutus reaksi berantai (Halliwell
dan Gutteridge, 2000).
Rajalakshmi dan Narisimhan (1996) menggolongkan antioksidan menjadi
tiga tipe yaitu :
(1) Antioksidan primer
Senyawa-senyawa yang berfungsi sebagai antioksidan primer mampu
memutus rantai reaksi pembentukan radikal bebas dengan memberikan ion
hidrogen atau elektron pada radikal bebas sehingga menjadi produk yang stabil.
Senyawa yang digolongkan sebagai antioksidan primer adalah kelompok senyawa
polifenol, asam askorbat (vitamin C), kelompok senyawa asam galat, BHT, BHA,
TBHQ, PG, dan tokoferol.
(2) Antioksidan sekunder
Antioksidan sekunder berfungsi untuk mencegah terbentuknya radikal
bebas, menginaktifkan singlet oksigen, menyerap radiasi ultraviolet dan bekerja
sinergis dengan antioksidan primer. Senyawa yang digolongkan sebagai
antioksidan sekunder adalah asam tiodipropionat, dilauril dan distearil ester.
(3) Chelator sequestransts
Senyawa yang tergolong sebagai chelator berfungsi sebagai pengikat
logam-logam yang dapat mengkatalis reaksi oksidasi lemak seperti Fe dan Cu.
Belitz et al. (2009) menyatakan bahwa terikatnya logam-logam tersebut oleh
chelating agent mampu meningkatkan efisiensi reaksi antioksidan, menghambat
12
oksidasi asam askorbat dan vitamin-vitamin yang larut lemak. Senyawa yang
digolongkan sebagai chelator atau chelating agent adalah asam sitrat, suksinat,
oksalat, laktat, malat, tartarat, asam polifosfat, ethylenediaminetetraacetic acid
(EDTA), asam amino dan peptida. Senyawa golongan asam karboksilat seperti
asam sitrat, asam nikotinat, asam salisilat dan asetil salisilat disamping berfungsi
sebagai chelator, juga memiliki keaktifan sebagai antioksidan. Dari keempat
senyawa golongan asam karboksilat tersebut, asam sitrat merupakan antioksidan
yang
paling
efektif
dan
memiliki
sifat
sebagai
radioprotektor
(Gromovaya et al., 2002).
Sumber-sumber antioksidan yang dapat dimanfaatkan oleh manusia
dikelompokkan menjadi tiga yaitu (1) antioksidan yang sudah ada di dalam tubuh
manusia yang dikenal dengan enzim antioksidan (SOD, GPx, dan CAT), (2)
antioksidan sintetis yang banyak digunakan pada produk pangan seperti BHA,
BHT, PG, dan TBHQ, dan (3) antioksidan alami yang diperoleh dari bagianbagian tanaman seperti kayu, kulit kayu, akar, daun, buah, bunga, biji, dan serbuk
sari, juga dapat diperoleh dari hewan dan mikroba. Jenis antioksidan yang banyak
didapatkan dari bahan alami berupa vitamin C dan E, beta karoten, pigmen seperti
antosianin
dan
krolofil,
flavonoid,
dan
polifenol
(Siswono,
2005
;
Ardiansyah, 2007).
BHA, BHT, PG, dan TBHQ adalah senyawa antioksidan sintetis yang
sudah dipergunakan secara luas oleh masyarakat dunia, tetapi hasil penelitian
Amarowicz et al. (2000) menyatakan bahwa penggunaan bahan sintetis ini dapat
meningkatkan resiko penyakit karsinogenesis. Sementara itu beberapa studi
13
epidemiologi menunjukkan adanya peningkatan konsumsi antioksidan alami yang
terdapat dalam buah, daun, bunga, rimpang, dan bagian-bagaian lain dari
tumbuhan untuk menghindari penyakit-penyakit degeneratif (Ghiselli et al., 1998).
Adanya beberapa mikronutrien pada tumbuhan seperti vitamin A, C, E, asam
folat, karotenoid, antosianin, dan polifenol memiliki kemampuan menangkap
radikal bebas sehingga dapat dijadikan pengganti konsumsi antioksidan sintetis
(Gill et al., 2002).
2.4 Enzim Antioksidan
Enzim antioksidan atau antioksidan endogenous enzimatik adalah SOD,
CAT, GPx, dan glutation reduktase (GSH).
SOD adalah metaloenzim yang
mengkatalis dismutasi radikal anion superoksida (O2’) menjadi hidrogen
peroksida (H2O2) dan oksigen (O2) di dalam mitokondria. Selanjutnya H2O2 di
dalam mitokondria akan mengalami detoksifikasi oleh enzim katalase menjadi
senyawa H2O dan O2, sedangkan H2O2 yang berdifusi ke dalam sitosol akan
didetoksifikasi oleh enzim glutation peroksidase (Ihnat, et al., 2007). Enzim ini
bersifat tidak stabil terhadap panas, cukup stabil pada kondisi basa, dan masih
mempunyai aktivitas walaupun disimpan sampai lima tahun pada suhu 5oC.
Menurut Haliwell dan Gutteridge (2000), aktivitas SOD tertinggi ditemukan di
hati, kelenjar adrenalin, ginjal, darah, limfa, pankreas, otak, paru-paru, lambung,
usus, ovarium, dan timus.
CAT adalah enzim yang disusun oleh lebih dari 500 asam amino dan
memiliki gugus forfirin atau dikenal sebagai hemoprotein. Enzim ini mengkatalis
14
senyawa hidrogen peroksida (H2O2) menjadi oksigen (O2) dan air (H2O).
Menurut Haliwell dan Gutteridge (2000), aktivitas CAT optimal pada pH 7 dan
meningkat dengan meningkatnya akumulasi H2O2. Enzim CAT mampu
mengkonversi 40 juta molekul hidrogen peroksida menjadi molekul air dan
oksigen
setiap
detiknya.
Disamping
itu,
enzim
CAT
juga
mampu
mendetoksifikasi senyawa formaldehid, fenol dan alkohol. CAT dengan
konsentrasi yang tinggi ditemukan pada hati, darah, ginjal, otak, paru-paru,
jaringan adiposa, dan kelenjar adrenal. GPx adalah selanoprotein yang terdiri atas
empat sub unit protein yang mengkatalis reaksi reduksi H2O2 menjadi air (H2O).
Glutation banyak ditemukan dalam hati.
isoform glutation peroksidase yaitu
Sampai saat ini ditemukandelapan
GPx1 (ditemukan pada sitosol, mereduksi
hidrogen peroksida), GPx2(enzim ekstraselular pada saluran pencernaan), GPx3
(enzim ekstraselular pada plasma), GPx4 (enzim yang mereduksi hidroperoksida
lipid), GPx5 (enzim pada epididymal), GPx6 (enzim pada olfactory), GPx7, dan
GPx8 (putative).
2.5 Senyawa Antioksidan Alami
Senyawa antioksidan alami pada umumnya berupa vitamin C, vitamin E,
karotenoid, senyawa fenolik, dan polifenolik yang dapat berupa golongan
flavonoid, turunan asam sinamat, kuomarin, tokoferol, dan asam-asam organik
polifungsional. Golongan flavonoid yang memiliki aktivitas antioksidan meliputi
flavon, flavonol, isoflavon, katekin, flavonol, dan kalkon. Sementara turunan
asam sinamat meliputi asam kafeat, asam ferulat, asam klorogenat, dan lain-lain
15
(Prakash, 2001 ; Kumalaningsih, 2006). Gromovaya et al. (2002) menyatakan
bahwa dari hasil penelitiannya terhadap beberapa senyawa golongan asam
karboksilat seperti asam sitrat, asam nikotinat, asam salisilat, dan asetil salisilat
memiliki aktivitas antiradikal yang cukup tinggi dan pada umumnya berperan
dalam mereduksi radikal hidroksil dan hidrogen peroksida.
2.5.1 Vitamin E
Vitamin E ditemukan pada tahun 1922, oleh Evans dan Bishop, dengan
istilah tokoferol (dari bahasa Yunani, tocos berarti kelahiran anak dan phero
berarti mengasuh). Vitamin E adalah nama umum untuk semua metil-tokol, jadi
istilah tokoferol bukan sinonim dari vitamin E, namun pada praktek sehari-hari,
kedua istilah tersebut disinonimkan. Struktur kimia tokoferol alfa diperlihatkan
pada Gambar 2.1 (Landvik et al., 2002 di dalam Cadenas dan Packer, 2002) .
Vitamin E tidak larut di dalam air tetapi larut dalam minyak dan lemak.
Terdapat delapan bentuk vitamin E yaitu berupa tokoferol alfa, beta, gamma, dan
delta serta empat bentuk tokotrienol homolog (alfa, beta, gamma, dan delta). Dari
delapan bentuk tersebut, alfa tokoferol memiliki aktivitas biologis yang paling
tinggi (Landvik et al., 2002 di dalam Cadenas dan Packer, 2002).
Sumber
vitamin E di alam banyak dijumpai pada minyak bunga matahari, minyak biji
kapas, taoge, kacang-kacangan dan kentang manis (Kumalaningsih, 2006).
16
Gambar 2.1
Struktur Molekul α –tokoferol (Landvik et al., 2002 di dalam Cadenas dan
Packer, 2002)
Fungsi vitamin E di dalam tubuh adalah melindungi asam-asam lemak tak
jenuh pada membran sel, mampu meningkatkan respon imun, sebagai zat pengatur
(regulasi) pada aktivasi Protein Kinase C, fungsi mitokondria, metabolisme
protein dan produksi hormon.
Vitamin E juga melindungi vitamin A dari
kerusakan yang terjadi di dalam tubuh. Fungsi vitamin E sangat penting bagi
tubuh seperti dapat mencegah kanker, penyakit kardiovaskuler, proses penuaan,
osteoporosis dan meningkatkan kinerja sistem kekebalan tubuh (Landvik et al.,
2002 di dalam Cadenas dan Packer, 2002).
Penelitian yang dilakukan oleh
Ahmad et al. (2006) menyatakan bahwa vitamin E memiliki aktivitas antioksidan
dalam mengurangi degradasi tirosin akibat fotosensitisasi Psoralen in vitro. Kushi
et al., (1996) dan Yochum et al., (2000) melaporkan adanya hubungan terbalik
antara asupan vitamin E dengan kejadian kematian karena kardiovaskuler.
Sebagai antioksidan, vitamin E berfungsi melindungi senyawa-senyawa
yang mudah teroksidasi, antara lain ikatan rangkap dua pada UFA (Unsaturated
Fatty Acid), DNA, dan RNA dan ikatan atau gugus – SH (sulfhidril) pada protein.
17
Apabila senyawa-senyawa tersebut teroksidasi, maka akan terbentuk ”radikal
bebas”, yang merupakan hasil proses peroksidasi. Radikal bebas yang terjadi akan
mengoksidasi senyawa-senyawa protein, DNA, RNA, dan UFA. Vitamin E akan
bertindak sebagai reduktor dan menangkap radikal bebas tersebut. Vitamin E
dalam hal ini berperan sebagai scavenger. Scavenger yang lain selain vitamin E
adalah vitamin C, enzim glutation reduktase, dismutase, dan peroksidase yang
bersifat larut dalam air. Scavenger yang larut dalam lemak adalah vitamin E dan
ß-karoten (Traber, 2002 di dalam Cadenas dan Packer, 2002).
Vitamin E lebih mudah diserap usus apabila terdapat lemak dan dalam
kondisi tubuh yang mempermudah penyerapan lemak. Tokoferol dari makanan
diserap oleh usus ditransportasikan ke hati melalui sistim limfatik dan saluran
darah. Di hati, tokoferol disebarkan ke sel-sel jaringan tubuh melalui saluran
darah. Di dalam plasma darah, tokoferol bergabung dengan lipoprotein, terutama
VLDL ( Very Low Density Lipoprotein) (Weber and Rimbach, 2002 di dalam
Cadenas dan Packer, 2002).
Sekitar 40% sampai dengan 60% tokoferol dari makanan yang dikonsumsi
dapat diserap oleh usus. Peningkatan jumlah yang dikonsumsi akan menurunkan
persentase yang diserap. Vitamin E disimpan terutama dalam jaringan adiposa,
otot dan hati. Dalam keadaan normal, kadar vitamin E dalam plasma darah
berkisar antara 0,5 mg/ml sampai dengan 1,2 mg/ml (Landvik et al., 2002 di
dalam Cadenas dan Packer, 2002).
Asam lemak tidak jenuh ganda (PUFA/ Poly Unsaturated Fatty Acid),
dapat menurunkan penyerapan dan penggunaan vitamin E. Hal ini berkaitan
18
kemungkinan dengan kecenderungan vitamin E bersifat mudah teroksidasi. Oleh
karena itu, kebutuhan vitamin E akan bertambah seiring dengan semakin
bertambahnya konsumsi PUFA. Dengan demikian, peningkatan konsumsi PUFA
yang tidak diikuti dengan peningkatan asupan vitamin E akan menimbulkan
penurunan secara gradual α-tokoferol dalam plasma (Kumalaningsih, 2006).
Di dalam hati, α-tokoferol diikat oleh α-TTP (α-tokoferol transfer protein).
Setelah menjalankan fungsinya sebagai antioksidan, tokoferol dapat teroksidasi
menjadi tokoferil (tokoferol bentuk radikal) bentuk radikal ini dapat direduksi
kembali menjadi tokoferol oleh kerja sinergi dari antioksidan yang lain, misalnya
vitamin C dan glutation. Vitamin E diekskresikan dari tubuh bersama dengan
empedu melalui feses, sebagian lagi melalui urin setelah diubah lebih dahulu
menjadi asam tokoferonat dan tokoferonalakton yang dapat berkonjugasi dengan
glukoronat (Traber, 2002 di dalam Cadenas dan Packer, 2002).
2.5.2 Vitamin C
Vitamin C adalah vitamin yang larut di dalam air dan sangat banyak
dijumpai pada tanaman sebagai L-asam askorbat dan sumber vitamin C di alam
adalah buah-buahan dan sayur-sayuran. Vitamin ini sangat labil terhadap suhu dan
oksigen. Struktur kimia vitamin C disajikan pada Gambar 2.2 (Padayatty et al.,
2002 di dalam Cadenas dan Packer, 2002).
Fungsi vitamin C adalah membantu penyerapan zat besi di dalam tubuh,
menghambat produksi nitrosamin (zat pemicu kanker), memperbaiki sistem
kekebalan tubuh, menjaga kesehatan gigi, gusi, pembuluh-pembuluh kapiler,
mencegah oksidasi lemak dan membantu penyembuhan luka (Carr dan Frei, 2002
19
di dalam Cadenas dan Packer, 2002 ; Kumalaningsih, 2006). Vitamin C terbukti
juga dapat meningkatkan kadar hemoglobin pada tikus putih apabila diberikan
sebesar 14,4 mg per 200 g berat badan per hari (Wahyuni, 2007).
Gambar 2.2
Struktur Molekul Asam Askorbat (Padayatty et al., 2002 di dalam Cadenas dan
Packer, 2002)
Vitamin C merupakan bagian dari sistem pertahanan tubuh terhadap
senyawa oksigen reaktif dalam plasma dan sel.
Vitamin C mampu bereaksi
dengan radikal bebas kemudian mengubahnya menjadi radikal askorbil yang
nantinya segera berubah menjadi dehidroaskorbat (Zakaria et al., 1996). Vitamin
C berperan menekan risiko kanker saluran pencernaan, terbukti dari penelitian
yang dilakukan oleh Zakaria et al. (2000) yang menunjukkan adanya peningkatan
kemampuan proliferasi sel B dan sel T pada konsumsi buah dan sayuran selama
30 hari. Temuan ini mengindikasikan bahwa asupan sayuran dan buah-buahan
dalam jumlah memadai dapat mengurangi resiko penyakit kanker.
Pada
umumnya
penggunaan
vitamin
C
sebagai
antioksidan
dikombinasikan dengan sumber antioksidan lain seperti vitamin E, buah-buahan
dan sayur-sayuran yang mengandung pigmen antosianin, klorofil dan golongan
20
senyawa flavonoid. Penelitian yang dilakukan oleh Jeng et al. (1996) menyatakan
bahwa kombinasi konsumsi vitamin C dan E ( 1 g vitamin C dan 400 mg
vitamin E all-rac-α-tocoferil asetat) selama 14 hari dapat meningkatkan produksi
IL-1 sebesar 1,8 kali dan TNF-α sebesar 1,5 kali. Sementara bagi kelompok yang
diberi konsumsi vitamin C saja hasilnya tidak memberikan efek yang signifikan.
Dilaporkan pula bahwa produksi sitokin pada 40 orang meningkat setelah diberi
suplementasi 1 g vitamin C dan 400 mg vitamin E all-rad-α tokoferol selama
waktu 28 hari.
Vitamin C atau asam askorbat disintesis dari glukosa di dalam hati hewan
yang tergolong mamalia. Manusia tidak bisa mensintesis vitamin C karena tidak
memiliki enzim glunolakton oksidase yang dapat mensisntesis asam askorbat dari
glukosa. Oleh sebab itulah manusia harus menyuplai vitamin C dari luar tubuh
yaitu dari konsumsi makanan dan minumannya. Karena sifatnya yang larut dalam
air, vitamin C mudah diserap oleh tubuh dan mudah pula dikeluarkan apabila
asupan berlebih (Carr dan Frei, 2002 di dalam Cadenas dan Packer, 2002).
Vitamin C atau asam askorbat mendonorkan dua elektron yang berasal
dari ikatan rangkap antara karbon kedua dan ketiganya. Senyawa reaktif yang
diberi elektron oleh vitamin C kemudian berubah menjadi senyawa yang stabil.
Vitamin C kemudian berubah menjadi bentuk radikal semidehidroaskorbat atau
radikal askorbil yang tidak reaktif. Senyawa ini dapat larut di dalam air sehingga
mudah mengeluarkannya dari dalam tubuh.
Berdasarkan mekanisme donor
elektron yang dilakukan oleh vitamin C inilah maka vitamin C berfungsi sebagai
21
antioksidan yang tergolong scavenger (Landvik et al., 2002 dan Padayatty et al.,
2002 di dalam Cadenas dan Packer, 2002).
2.5.3 Karotenoid
Karotenoid adalah suatu kelompok pigmen berwarna kuning, oranye, atau
merah oranye, memiliki sifat larut dalam lemak atau pelarut organik tetapi tidak
larut di dalam air.
Senyawa ini sensitif terhadap alkali, udara (O2), sinar, dan
suhu yang tinggi. Terdapat sekitar 700 jenis karotenoid yang dibagi menjadi dua
kelas yaitu xanthophyll dan karoten. Senyawa karotenoid yang populer adalah
beta karoten. Senyawa ini dapat diubah menjadi vitamin A di dalam tubuh
(Deming et al., 2002 di dalam Cadenas dan Packer, 2002).
Fungsi
biologis
karotenoid
adalah
sebagai
antioksidan,
regulasi
komunikasi intraseluler, regulasi diferensiasi sel dan apoptosis, meningkatkan
respon imun, dan membantu penghambatan mutagenesis dan transformasi
malignan di dalam sel (Palozza et al., 2001 dan Sumantran et al., 2000). Hasil
studi epidemiologi menyatakan bahwa asupan karotenoid berhubungan dengan
pencegahan beberapa penyakit kronis dan resiko terjadinya kanker paru pada
kelompok pekerja asbestos dan perokok (Deming et al., 2002 di dalam Cadenas
dan Packer, 2002).
Pada kondisi tertentu, vitamin A (beta karoten) berperan sebagai sparing
effect vitamin E. Bila tekanan dalam tubuh tinggi, vitamin E diangkut darah
melalui LDL dan HDL, namun bila tekanan oksigen rendah, vitamin E digantikan
oleh beta karoten (Suryohudoyo, 1995).
Sistem kerja seperti ini sangat
menguntungkan karena kedua senyawa tersebut mampu berperan sebagai
22
antioksidan sehingga dapat mempertahankan status antioksidan endogen secara
bergantian.
Senyawa karotenoid tersebar luas dalam tanaman. Senyawa ini terdapat
dalam kloroplast daun atau batang tanaman yang berwarna hijau. Karotenoid juga
banyak dijumpai pada umbi dan buah-buahan. Sumber karotenoid adalah wortel,
jeruk, pisang, pepaya, semangka, dan tomat. Gambar 2.3 menunjukkan struktur
kimia karotenoid (Anonim, 2010b).
Gambar 2.3
Struktur Molekul Karotenoid (Anonim, 2010b)
2.5.4 Senyawa fenolik (polifenol)
Polifenol adalah kelompok zat kimia yang ditemukan sangat luas pada
tanaman. Zat ini memiliki ciri khas yakni memiliki banyak gugus fenol pada
molekulnya, dan berperan dalam memberi warna pada tumbuhan seperti warna
daun saat musim gugur. Dari sejumlah penelitian pada tanaman obat dilaporkan
23
bahwa banyak tanaman obat yang mengandung polifenol dalam jumlah besar.
Efek antioksidan terutama disebabkan karena adanya senyawa fenol seperti
flavonoid dan asam fenolat. Biasanya senyawa-senyawa yang memiliki aktivitas
antioksidan adalah senyawa fenol yang mempunyai gugus hidroksi yang
tersubstitusi pada posisi ortho dan para terhadap gugus –OH dan –OR (Okawa et
al., 2001).
Senyawa polifenol yang khas terdapat pada teh adalah
epigallocatechin gallate (EGCG) dan epicatechin gallate (ECG).
Sementara itu
senyawa polifenol pada rimpang kunyit disebut kurkumin (Gambar 2.4), pada jahe
disebut zingerol, dan pada kulit buah-buahan adalah tannin (Anonim, 2010c).
Gambar 2.4
Senyawa Kurkumin (Anonim, 2010c)
Senyawa polifenol dapat berupa golongan asam-asam fenolat, polimer
fenolat, dan flavonoid. Asam-asam fenolat membentuk bermacam-macam
kelompok senyawa yang termasuk hidroksibenzoat dan asam hidroksisinamat.
Polimer fenolat tersusun dari senyawa yang memiliki berat molekul besar seperti
tannin. Ada dua jenis tanin yaitu: hydrolysable tannin dan condensed tannin.
Hydrolysable tannin adalah senyawa tanin yang dapat dihidrolisis dengan asam,
alkali atau enzim menjadi senyawa-senyawa yang lebih sederhana seperti gula dan
asam tanat (asam galat dan elagat) (Hagerman, 2002).
24
Galotanin adalah contoh hydrolysable tannin, yang mana molekulnya
tersusun dari asam galat dan gula, sedangkan elagitanin adalah hydrolysable
tannin yang molekulnya tersusun dari asam elagat dan gula (Gambar 2.5).
Condensed tannin juga disebut proanthosianidin merupakan tanin yang tersusun
dari flavonoid seperti katekin atau epikatekin, contohnya prosianidin B-2 yang
disajikan pada Gambar 2.6 (Hagerman, 2002).
Gambar 2.5
Struktur Molekul Galotanin (Hydrolysable Tannin)
(Hagerman, 2002)
Gambar 2.6
Struktur Molekul Prosianidin B-2 (Condensed Tannin)
(Hagerman, 2002)
25
Flavoniod merupakan senyawa yang sangat banyak dijumpai pada
tanaman atau merupakan golongan senyawa polifenol yang paling banyak
terdapat pada tanaman. Struktur dasar dari flavonoid disajikan pada Gambar 2.7
(Fuhrman dan Aviram, 2002 di dalam Cadenas dan Packer, 2002). Antosianin dan
antoxantin juga termasuk kelompok flavonoid.
Antosianin adalah pigmen
tanaman yang bertanggungjawab pada munculnya warna merah, biru, dan ungu,
sedangkan antoxantin adalah pigmen yang tidak berwarna, berwarna putih atau
putih kekuningan. Senyawa antioksidan alami polifenol ini adalah multifungsional
dan dapat beraksi sebagai (1) pereduksi, (2) penangkap radikal bebas, (3)
pengkelat logam, dan (4) peredam terbentuknya singlet oksigen. Aktivitas
antioksidan flavonoid tergantung pada struktur molekulnya terutama gugus prenil
(CH3)2C=CH-CH2-. Gugus prenil flavonoid dikembangkan untuk pencegahan atau
terapi terhadap penyakit-penyakit yang diasosiasikan dengan radikal bebas
(Birt et al., 2001).
Penelitian yang dilakukan oleh Cai et al. (2004) menyatakan bahwa
kandungan senyawa fenolik dari 112 tanaman obat Cina memiliki koefisien
korelasi positif dan sangat kuat (R2 = 96,4%) dengan aktivitas antioksidannya
sehingga disimpulkan bahwa senyawa fenolik memberikan kontribusi yang
signifikan pada kapasitas antioksidan tanaman obat.
Klopotek et al. (2005) menyatakan bahwa kandungan vitamin C dan
senyawa fenolik pada buah strawberi yang sudah mengalami pengolahan
(prosesing) mengalami penurunan yang cukup signifikan. Hal ini mengakibatkan
aktivitas antioksidan pada produk segar lebih tinggi dibandingkan dengan produk
26
olahan. Penelitian yang dilakukan oleh Indriati et al. (2002) menyatakan bahwa
buah jambu mete yang mengalami penundaan pengolahan mengakibatkan
penurunan senyawa polifenol yang dapat menurunkan aktivitas antioksidannya.
Sementara itu penelitian yang dilakukan oleh Kobayashi et al. (2008) menyatakan
bahwa kandungan senyawa fenolik dan aktivitas antioksidan yang dianalisis dari
buah pawpaw mengalami penurunan selama proses pematangan.
Struktur Flavonoid:
Senyawa Fenolik
terdiri dari tiga cincin
benzene dengan group
hidroksil (OH)
1. Hilangkan OH pada (1): flavon
Tanpa gula, molekul disebut aglikon
2. Ganti (OH) pada (1) dengan cincin ke tiga:
isoflavon
3. Ganti O pada (2) dengan H: antosianin
4. Ganti OH pada (3) dengan glukosa;
hilangkan OH pada (4); hilangkan OH
pada (1): glukosida
Gambar 2.7
Struktur Dasar Molekul Flavonoid (Birt et al., 2001)
Senyawa flavonoid khususnya senyawa quersetin selain berfungsi sebagai
antioksidan untuk mencegah penyakit degeneratif dan kronis,
juga memiliki
kapasitas melindungi jaringan otot jantung (myocardial) dari iskemia dan luka
reperfusi sehingga memiliki potensi sebagai cardioprotective effect pada tikus
putih (Ikizler et al., 2007).
27
2.6 Kapasitas Antioksidan
Kapasitas atau aktivitas antioksidan menggambarkan kemampuan suatu
senyawa yang mengandung antioksidan untuk menghambat laju reaksi
pembentukan radikal bebas. Penentuan kapasitas antioksidan yang terdapat dalam
tumbuhan pada umumnya menggunakan spektrofotometer.
Eksplorasi bahan-
bahan alam terutama senyawa bioaktif yang terdapat pada tumbuh-tumbuhan dan
mikroorganisme yang hidup di darat maupun di air secara terus menerus diteliti
untuk mendapatkan senyawa antioksidan yang berfungsi untuk menjaga kesehatan
tubuh manusia (Shahidi, 1997 ; Prakash, 2001).
Reaksi yang umum terjadi pada mekanisme penangkapan radikal bebas oleh
antioksidan digolongkan menjadi dua yaitu mekanisme Hidrogen Atom Transfer
(HAT) dan Electron Transfer (ET). Reraksi HAT pada umumnya terjadi akibat
peroksidasi lemak yaitu antara radikal (X*) dengan antioksidan (AH) seperti pada
reaksi di bawah ini :
X* + AH ----------> XH + A’
(1)
Sementara itu reaksi ET terjadi akibat reaksi reduksi oksidasi (redoks) antara
radikal (X*) dengan antioksidan (AH) yang menghasilkan produk stabil (XH) dan
air (H2O). Produk inilah yang dapat mempengaruhi warna menjadi memudar.
Tahapan reaksinya disajikan pada reaksi di bawah ini :
X* + AH -----------> X- + AH*+
H2O
(2)
AH*+ ---------> A* + H3O+
(3)
X- + H3O+ -------> XH + H2O
(4)
28
2.6.1 Pengukuran kapasitas antioksidan in vitro
Beberapa metode pengukuran kapasitas antioksidan secara in vitro yang
digunakan
dewasa
ini
adalah
beta
karoten
bleaching,
1,1-Diphenyl-2-
Picrylhydrazyl (DPPH Radical Scavenging) method, Thiobarbituric AcidReactive-Substances
(TBARS)
assay,
Rancimat
assay,
Oxygen
Radical
Absorbance Capacity (ORAC) assay, Total Radical-Trapping Antioxidant
Parameter (TRAP) dan Ferric Reducing/Antioxidant Power (FRAP) assay, Trolox
Equivalent Antioxidant Capacity (TEAC) method, Peroxyl Radical Scavenging
Capacity (PSC) dan Total Oxyradical Scavenging Capacity (TOCS) method dan
Folin-Ciocalteau Total Phenolic assay, dan lain-lain (Mermelstein, 2009).
Menurut Prior et al. (2005), metode analisis yang didasari atas reaksi HAT adalah
ORAC, TRAP, dan TOCS, sedangkan metode analisis berdasarkan reaksi ET
adalah FRAP, TEAC, dan DPPH.
Klopotek et al. (2005) menyatakan bahwa metode FRAP assay dan TEAC
assay yang digunakan untuk mengukur perubahan aktivitas antioksidan buah
strawberi segar dan olahannya memberikan hasil yang tidak jauh berbeda.
Penelitian yang dilakukan oleh Gill et al. (2002) menghasilkan bahwa aktivitas
antioksidan pada buah plum menggunakan FRAP assay lebih tinggi (40,4 mg
sampai dengan 127,2 mg ekivalen vitamin C) dibandingkan dengan pengukuran
menggunakan DPPH Radical Scavenging Method (27,4 mg sampai dengan 61,1
mg ekivalen vitamin C).
Penelitian lain menunjukkan bahwa analisis aktivitas antioksidan
menggunakan Total Phenolic assay dan FRAP assay memiliki hubungan positif
29
yang sangat kuat (R2 = 94,8%) pada daun, batang, dan ekstrak buah tanaman
Momordica charantia L. (Kubola dan Siriamornpun, 2008).
2.6.2 Pengukuran kapasitas antioksidan in vivo
Wolfe dan Liu (2007) menyatakan bahwa di samping analisis in vitro,
perlu melakukan analisis kapasitas antioksidan pada hewan coba atau manusia
untuk mendapatkan efikasi aktual antioksidan tersebut di dalam tubuh. Tetapi
dikatakan pula bahwa penelitian ini memerlukan waktu dan biaya yang cukup
besar dan sulit mengetahui perbedaan pengaruh spesifik dari antioksidan dengan
asupan pangan sehari-hari.
Beberapa penelitian mengenai kapasitas antioksidan secara in vivo
dilakukan menggunakan mencit, tikus, dan manusia. Prangdimurti et al. (2006),
menyatakan bahwa terjadi peningkatan aktivitas SOD dan CAT pada hati tikus
Sprague Dawley yang diberi asupan ekstrak daun suji.
Jawi et al. (2008)
melakukan penelitian mengenai aktivitas antioksidan pada ubi jalar ungu
menggunakan mencit jantan galur Swiss dan menghasilkan bahwa ekstrak ubi
jalar ungu dapat meningkatkan kapasitas antioksidan pada hati mencit tersebut.
Hasil penelitian Puspawati (2009) juga menyatakan bahwa asupan sorgum dan
jewawut yang kaya antioksidan dapat meningkatkan aktivitas SOD, CAT, dan
GPx pada hati tikus Sprague Dawley. Penelitian yang dilakukan oleh Kutlu et al.
(2009) pada tikus hiperkolesterolemia yang disuplementasi dengan ‘apricot cernel
oil’, memberikan hasil yang signifikan terhadap peningkatan aktivitas enzim GPx
dan CAT pada hatinya.
30
2.6.3 Pengukuran kapasitas antioksidan dengan kultur sel
Wolfe dan Liu (2007) mengembangkan metode kultur sel yang dikenal
dengan Cellular Antioxidant Activity (CAA) assay untuk menguji kapasitas
antioksidan di dalam sel. Metode ini dapat menjelaskan mekanisme biologis
seperti distribusi dan penyerapan antioksidan oleh sel serta mekanisme
penghambatan atau peredaman radikal bebas di dalam sel.
Pengukuran aktivitas antioksidan pada beberapa ekstrak buah-buahan
menggunakan CAA assay dilakukan oleh Wolfe et al. (2008). Penelitian ini
menunjukkan bahwa blueberi memiliki nilai CAA yang paling tinggi diikuti oleh
buah pome (delima), blackberi, strawberi, rasberi, cranberi, dan apel. Di samping
itu, Wolfe dan Liu (2008) juga melakukan penelitian pengukuran aktivitas
antioksidan pada beberapa ekstrak fitokimia dan mendapatkan hasil bahwa
senyawa kuersetin memiliki nilai CAA Assay yang paling tinggi, kemudian
diikuti kaemferol, epigalokatekin galat, myrsetin, dan luteolin.
2.7 Tinjauan Umum Bunga Kamboja
Tanaman Kamboja atau dikenal dengan Frangipani (Plumeria sp.)
merupakan jenis tumbuhan berbunga yang berasal dari Amerika Tengah dan
Afrika. Tanaman ini ditemukan oleh Charles Plumier, seorang botanis Perancis
(Anonim, 2010a). Kamboja merupakan jenis tanaman tropis yang tumbuh subur
di dataran rendah sampai ketinggian tanah 700 m di atas permukaan laut. Ciri
khas tanaman ini mudah tumbuh dan berkembang biak serta tidak memerlukan
perawatan khusus. Tanaman Kamboja dapat bertahan hidup sampai ratusan tahun
31
karena merupakan tanaman sekulen yaitu jenis tanaman yang dapat menyimpan
air pada seluruh bagian mulai dari akar, batang, daun, dan bunganya. Dewasa ini
terutama di daerah Bali, kamboja merupakan salah satu maskot tanaman penghias
halaman rumah, kantor, dan taman umum. Bunga Kamboja saat ini tidak saja
berwarna putih dan kuning tetapi ada jenis persilangan baru berwarna pink,
oranye, merah, dan merah tua. Tanaman Kamboja dengan warna bunga putih dan
kuning termasuk dalam genus dan spesies Plumeria alba, sedangkan kamboja
dengan warna bunga orange, pink, merah, dan merah tua termasuk dalam
Plumeria rubra (Gilman dan Watson, 1994).
Tanaman Kamboja menyimpan banyak manfaat, mulai dari akar, batang,
getah, daun, kulit batang dan bunganya. Akar kamboja digunakan untuk
mengobati kencing nanah (gonorrhoe), daunnya dapat mengobati bisul bernanah,
kulit batang untuk menyembuhkan tumit pecah-pecah. Getah Kamboja
bermanfaat sebagai pengurang rasa sakit akibat gigi berlubang, mengobati gusi
bengkak serta dapat mematangkan bisul (Anon., 2007). Sedangkan air rebusan
bunga Kamboja kering berkhasiat untuk menurunkan demam, sebagai obat batuk
dan membantu melancarkan pencernaan (Anonim, 2006). Selain itu air rebusan
Bunga Kamboja juga dapat digunakan untuk mengobati kudis dan sakit kulit
(Anonim, 2010). Menurut Amin (2010), bunga Kamboja kering dijadikan bahan
campuran pada proses pembuatan minuman herbal di Korea, Jepang dan Vietnam.
Menurut penelitian yang dilakukan oleh Wrasiati et al. (2008), ekstrak air
dengan suhu 90oC dari bunga Kamboja Cendana kering memiliki total polifenol
sebesar 18,7 % dan aktivitas antioksidan sebesar 7,44 %, sedangkan ekstrak air
32
bunga Kamboja Lokal kering memiliki total polifenol dan aktivitas antioksidan
yang lebih rendah yaitu sebesar 12,4 % dan 6,22 %. Kandungan lain yang penting
bagi kesehatan adalah kadar serat sebesar 20,33 %, total asam sebesar 6,02 %, dan
kadar sari sebesar 38 % .
2.8 Ekstraksi
Ekstraksi adalah proses pemisahan suatu bahan dari campurannya. Pada
umumnya ekstraksi dilakukan dengan menggunakan pelarut yang didasarkan pada
kelarutan komponen terhadap komponen lain dalam campuran (Anon., 2000).
Bahan yang akan diekstrak biasanya berupa bahan kering yang telah dihancurkan,
biasanya berbentuk bubuk atau simplisia (Sembiring, 2007).
Bahan-bahan aktif seperti senyawa antimikroba dan antioksidan yang
terdapat pada tumbuhan pada umumnya diekstrak dengan pelarut. Pada proses
ekstraksi dengan pelarut, jumlah dan jenis senyawa yang masuk ke dalam cairan
pelarut sangat ditentukan oleh jenis pelarut yang digunakan dan meliputi dua fase
yaitu fase pembilasan dan fase ekstraksi. Pada fase pembilasan, pelarut membilas
komponen-komponen isi sel yang telah pecah pada proses penghancuran
sebelumnya. Pada fase ekstraksi, mula-mula terjadi pembengkakan dinding sel
dan pelonggaran kerangka selulosa dinding sel sehingga pori-pori dinding sel
menjadi melebar yang menyebabkan pelarut dapat dengan leluasa masuk ke dalam
sel.
Bahan isi sel kemudian terlarut dalam pelarut sesuai dengan tingkat
kelarutannya lalu berdifusi keluar akibat adanya gaya yang ditimbulkan perbedaan
konsentrasi bahan terlarut yang terdapat di dalam dan di luar sel (Voigt, 1995).
33
Menurut Harborne (1987), Proses pengekstraksian komponen kimia dalam
sel tanaman yaitu pelarut organik akan menembus dinding sel dan masuk ke
dalam rongga sel yang mengandung zat aktif, zat aktif akan larut dalam pelarut
organik di luar sel, maka larutan terpekat akan berdifusi keluar sel dan proses ini
akan berulang terus sampai terjadi keseimbangan antara konsentrasi cairan zat
aktif di dalam dan di luar sel.
2.8.1 Tujuan dan kondisi ekstraksi
Tujuan ekstraksi adalah untuk menarik semua komponen kimia yang terdapat
dalam simplisia. Secara umum, terdapat empat situasi dalam menentukan tujuan
ekstraksi menurut Anonim, 1986 dan Harborne, 1987 yaitu :
(1) Senyawa kimia telah diketahui identitasnya untuk diekstraksi dari organisme.
Dalam kasus ini, prosedur yang telah dipublikasikan dapat diikuti dan dibuat
modifikasi yang sesuai untuk mengembangkan proses atau menyesuaikan dengan
kebutuhan pemakai.
(2) Bahan diperiksa untuk menemukan kelompok senyawa kimia tertentu,
misalnya alkaloid, flavanoid atau saponin, meskipun struktur kimia sebetulnya
dari senyawa ini bahkan keberadaannya belum diketahui. Dalam situasi seperti
ini, metode umum yang dapat digunakan untuk senyawa kimia yang diminati
dapat diperoleh dari pustaka. Hal ini diikuti dengan uji kimia atau kromatografik
yang sesuai untuk kelompok senyawa kimia tertentu
(3) Organisme (tanaman atau hewan) digunakan dalam pengobatan tradisional,
dan biasanya dibuat dengan cara, misalnya Tradisional Chinese Medicine (TCM)
seringkali membutuhkan herba yang dididihkan dalam air untuk diberikan sebagai
34
obat. Proses ini harus ditiru sedekat mungkin jika ekstrak akan melalui kajian
ilmiah biologi atau kimia lebih lanjut, khususnya jika tujuannya untuk
memvalidasi penggunaan obat tradisional.
(4) Sifat senyawa yang akan diisolasi belum ditentukan sebelumnya dengan cara
apapun. Situasi ini (utamanya dalam program skrining) dapat timbul jika
tujuannya adalah untuk menguji organisme, baik yang dipilih secara acak atau
didasarkan pada penggunaan tradisional untuk mengetahui adanya senyawa
dengan aktivitas biologi khusus
2.8.2 Metode ekstraksi
Beberapa metode ekstraksi dengan pelarut yang digunakan untuk
mendapatkan senyawa aktif pada tanaman adalah metode maserasi, perkolasi,
soxhletasi, refluks, destilasi uap air, rotavapor, ekstraksi cair-cair, dan
kromatografi lapis tipis.
(1) Maserasi
Penyarian zat aktif yang dilakukan dengan cara merendam serbuk
simplisia dalam cairan penyari yang sesuai selama beberapa jam sampai tiga hari
pada temperatur kamar terlindung dari cahaya, cairan penyari akan masuk ke
dalam sel melewati dinding sel. Isi sel akan larut karena adanya perbedaan
konsentrasi antara larutan di dalam sel dengan di luar sel. Larutan yang
konsentrasinya tinggi akan terdesak keluar dan diganti oleh cairan penyari dengan
konsentrasi rendah (proses difusi). Peristiwa tersebut berulang sampai terjadi
keseimbangan konsentrasi antara larutan di luar sel dan di dalam sel. Selama
proses maserasi dilakukan pengadukan dan penggantian cairan penyari setiap hari.
Endapan yang diperoleh dipisahkan dan filtratnya dipekatkan (Sudjadi, 1986).
35
(2) Perkolasi
Penyarian zat aktif yang dilakukan dengan cara serbuk simplisia
dimaserasi selama tiga jam, kemudian simplisia dipindahkan ke dalam bejana
silinder yang bagian bawahnya diberi sekat berpori, cairan penyari dialirkan dari
atas ke bawah melalui simplisia tersebut, cairan penyari akan melarutkan zat aktif
dalam sel-sel simplisia yang dilalui sampai keadan jenuh. Gerakan ke bawah
disebabkan oleh karena gravitasi, kohesi, dan berat cairan di atas dikurangi gaya
kapiler yang menahan gerakan ke bawah. Perkolat yang diperoleh dikumpulkan,
lalu dipekatkan (Sudjadi, 1986).
(3) Soxhletasi
Penarikan komponen kimia yang dilakukan dengan cara serbuk simplisia
ditempatkan dalam klonsong yang telah dilapisi kertas saring sedemikian rupa,
cairan penyari dipanaskan dalam labu alas bulat sehingga menguap dan
dikondensasikan oleh kondensor bola menjadi molekul-molekul cairan penyari
yang jatuh ke dalam klonsong menyari zat aktif di dalam simplisia dan jika cairan
penyari telah mencapai permukaan sifon, seluruh cairan akan turun kembali ke
labu alas bulat melalui pipa kapiler hingga terjadi sirkulasi. Ekstraksi sempurna
ditandai bila cairan di sifon tidak berwarna, tidak tampak noda jika di KLT, atau
sirkulasi telah mencapai 20-25 kali. Ekstrak yang diperoleh dikumpulkan dan
dipekatkan (Sudjadi, 1986).
(4) Refluks
Penarikan komponen kimia yang dilakukan dengan cara sampel
dimasukkan ke dalam labu alas bulat bersama-sama dengan cairan penyari lalu
36
dipanaskan, uap-uap cairan penyari terkondensasi pada kondensor bola menjadi
molekul-molekul cairan penyari yang akan turun kembali menuju labu alas bulat,
akan menyari kembali sampel yang berada pada labu alas bulat, demikian
seterusnya berlangsung secara berkesinambungan sampai penyarian sempurna,
penggantian pelarut dilakukan sebanyak tiga kali setiap 3 jam sampai 4 jam.
Filtrat yang diperoleh kemudian dikumpulkan dan dipekatkan (Sudjadi, 1986).
(5) Destilasi uap air
Penyarian minyak menguap dengan cara simplisia dan air ditempatkan
dalam labu berbeda. Air dipanaskan dan akan menguap, uap air akan masuk ke
dalam labu sampel sambil mengekstraksi minyak menguap yang terdapat dalam
simplisia, uap air dan minyak menguap yang telah terekstraksi menuju kondensor
dan akan terkondensasi, lalu akan melewati pipa alonga, campuran air dan minyak
menguap akan masuk ke dalam corong pisah, dan akan memisah antara air dan
minyak atsiri (Anon., 2000).
(6) Rotavapor
Proses pemisahan ekstrak dari cairan penyarinya dengan pemanasan yang
dipercepat oleh putaran dari labu alas bulat, cairan penyari dapat menguap sekitar
5-10º C di bawah titik didih pelarutnya disebabkan oleh karena adanya penurunan
tekanan. Dengan bantuan pompa vakum, uap larutan penyari akan menguap naik
ke kondensor dan mengalami kondensasi menjadi molekul-molekul cairan pelarut
murni yang ditampung dalam labu alas bulat penampung (Sudjadi, 1986).
37
(7) Ekstraksi cair-cair
Ekstraksi cair-cair merupakan pemisahan komponen kimia di antara dua
fase pelarut yang tidak saling bercampur di mana sebagian komponen larut pada
fase pertama dan sebagian larut pada fase kedua, lalu kedua fase yang
mengandung zat terdispersi dikocok dan didiamkan sampai terjadi pemisahan
sempurna dan terbentuk dua lapisan fase cair. Komponen kimia akan terpisah ke
dalam kedua fase tersebut sesuai dengan tingkat kepolarannya dengan
perbandingan konsentrasi yang tetap (Harborne, 1987).
(8) Kromatografi lapis tipis
Pemisahan komponen kimia berdasarkan prinsip adsorbsi dan partisi, yang
ditentukan oleh fase diam (adsorben) dan fase gerak (eluen). Komponen kimia
bergerak naik mengikuti fase gerak karena daya serap adsorben terhadap
komponen-komponen kimia tidak sama sehingga komponen kimia dapat bergerak
dengan kecepatan yang berbeda berdasarkan tingkat kepolarannya, hal inilah yang
menyebabkan terjadinya pemisahanantara senyawa yang satu dengan yang lainnya
(Sudjadi, 1986).
Pada umumnya senyawa aktif pada tanaman diperoleh dengan cara
ekstraksi menggunakan pelarut. Senyawa aktif yang sebagian besar berupa
polifenol memiliki spektrum luas dengan sifat kelarutan pada suatu pelarut yang
berbeda-beda. Hal ini disebabkan oleh gugus hidroksil yang dimiliki oleh
senyawa tersebut berbeda jumlah dan posisinya. Dengan demikian, ekstraksi
menggunakan berbagai pelarut akan menghasilkan komponen polifenol dan
keaktifan yang berbeda (Pambayun et al., 2007).
38
Menurut Cowan (1999), senyawa polifenol yang terdapat pada tumbuhan
pada umumnya diekstrak dengan metanol dan etanol. Sementara itu beberapa
penelitian yang berhubungan dengan senyawa polifenol dan aktivitas antioksidan
menggunakan pelarut air dan dikolrometan (Septiana et al., 2002), pelarut etil
asetat dan kloroform (Pambayun et al., 2007), campuran pelarut metanol, air dan
asam asetat (Unver et al., 2009), etil asetat, heksan dan eter (Kuncahyo dan
Sunardi, 2007).
Proses ekstraksi bahan tumbuhan meliputi dua fase yaitu fase pembilasan
dan fase ekstraksi. Pada fase pembilasan, pelarut membilas komponen-komponen
isi sel yang telah pecah pada proses penghancuran sebelumnya.
Pada fase
ekstraksi, mula-mula terjadi pembengkakan dinding sel dan pelonggaran kerangka
selulosa dinding sel sehingga pori-pori dinding sel menjadi melebar yang
menyebabkan pelarut dapat dengan leluasa masuk ke dalam sel. Bahan isi sel
kemudian terlarut dalam pelarut sesuai dengan tingkat kelarutannya lalu berdifusi
keluar akibat adanya gaya yang ditimbulkan perbedaan konsentrasi bahan terlarut
yang terdapat di dalam dan di luar sel (Voigt, 1995).
Pada Tabel 2.1 ditunjukkan jenis-jenis pelarut yang digunakan untuk
mengekstrak berbagai jenis senyawa bioaktif pada tumbuhan. Cowan (1999)
menyatakan bahwa etanol dan metanol merupakan pelarut yang paling sering
digunakan untuk mengekstrak senyawa antimikroba dan antioksidan dari
tumbuhan karena seyawa-senyawa tersebut umumnya merupakan senyawa
aromatik dan organik jenuh.
39
Menurut Al-Farsi et al. (2005), perbedaan pelarut yang digunakan pada
proses ekstraksi berpengaruh terhadap kandungan fenol dan aktivitas antioksidan
tanaman Phoenix dactylifera. Pada penelitian tersebut, pelarut yang dibandingkan
adalah air, fosfat bufer, metanol, dan aseton dan pelarut yang menghasilkan
ekstrak dengan kandungan fenol tertinggi adalah ekstrak metanol yaitu sebesar
343 mg GAE/100 g dan aktivitas antioksidan tertinggi terdapat pada ekstrak
buffer fosfat yaitu sebesar 9986 µmol TE/g. Cai et al. (2004) juga menyatakan
bahwa ekstrak air dan metanol dari 112 tanaman obat Cina menghasilkan total
fenol dan aktivitas antioksidan yang berbeda-beda.
Beberapa tanaman yang
diekstrak dengan air memiliki total fenol dan aktivitas antioksidan yang lebih
tinggi dibandingkan dengan tanaman yang diekstrak dengan pelarut etanol atau
metanol. Hodzic et al. (2009) menyatakan bahwa ekstraksi dengan air pada suhu
40oC dari beberapa serealia seperti oat, barley, jagung dan gandum menghasilkan
total fenol dan aktivitas antioksidan cukup tinggi.
Hasil penelitian Septiana et al. (2002) menunjukkan bahwa ekstrak
diklorometana jahe memiliki total fenol dan aktivitas antioksidan yang lebih besar
dibandingkan dengan ekstrak airnya.
Kuncahyo dan Sunardi (2007) juga
menyatakan bahwa ekstrak fraksi eter dari belimbing wuluh memiliki aktivitas
antioksidan yang lebih besar dibandingkan dengan fraksi airnya.
Moselhy dan Junbi (2010) meneliti tentang aktivitas antioksidan bubuk
Cinnamon yang diekstrak dengan pelarut air dan etanol. Kedua ekstrak tersebut
mengandung senyawa aktif golongan polifenol yang cukup tinggi dan mampu
40
menurunkan kadar MDA, meningkatkan aktivitas enzim SOD dan CAT pada hati
tikus yang diinduksi dengan CCl4.
Tabel 2.1
Jenis-jenis Pelarut yang Digunakan untuk Mengekstrak Berbagai Jenis Senyawa
Aktif dari Tumbuhan
Senyawa aktif
Pelarut
air
Etanol
Polifenol
Tannin
√
Antosianin
√
√
√
√
√
√
Flavon
kloroform
dikloroMetanol
eter
Aseton
√
√
Flavonol
√
Terpenoid
√
Polipeptida
√
Alkaloid
metanol
√
√
Kuomarin
Sumber: Cowan (1999)
√
√
√
√
√
√
√