7 bahan dan metode
advertisement
7 Prinsip dasar teknik ini adalah molekul DNA, RNA atau protein dapat dipisahkan berdasarkan laju perpindahannya oleh gaya gerak listrik di dalam matriks gel. Laju perpindahan tersebut bergantung pada ukuran molekulnya. Sampel molekul ditempatkan ke dalam sumur pada gel yang ditempatkan di dalam larutan penyangga yaitu TAE (Tris HCl-Acetic acid-EDTA), dan listrik dialirkan sebesar 80 Volt. Molekul-molekul sampel akan bergerak di dalam matriks gel ke arah salah satu kutub listrik sesuai muatannya. RNA dan DNA arah pergerakannya adalah menuju elektroda positif, disebabkan oleh muatan negatif pada rangka gula-fosfat yang dimilikinya (Nur & Adijuwana 1987). Gel yang digunakan adalah agarosa yang berasal dari ekstrak rumput laut yang telah dimurnikan. Marka atau penanda (marker) yang digunakan pada proses running merupakan campuran molekul dengan ukuran berbeda-beda yang dapat digunakan untuk menentukan ukuran molekul dalam pita sampel. Ukuran DNA dapat ditentukan dengan menyertakan marka atau penanda yang digunakan pada proses running. Setelah tahap running selesai, dilakukan metode pewarnaan (staining) dan penghilangan warna (destaining). Metode pewarnaan pada DNA atau RNA merupakan pewarnaan gel agarosa yang dilakukan dengan menggunakan larutan etidium bromida selama 15 menit. Hal ini dilakukan dengan tujuan agar molekul sampel berpendar dalam sinar ultraviolet. Penghilangan warna dilakukan dengan cara gel dimasukkan ke dalam aquades selama 5 hingga 7 menit (Mikkelsen & Corton 1960). Media pendukung yang digunakan dalam elektroforesis antara lain: kertas/membran selulosa, gel pati, gel poliakrilamida, dan gel agarosa. Media kertas merupakan media paling awal yang digunakan dalam teknik elektroforesis. Media ini digunakan untuk memisahkan protein. Media gel pati terbuat dari ekstrak pati kentang yang dibuat gel. Media tersebut kemudian disempurnakan menjadi gel poliakrilamid dan gel agarosa. Gel poliakrilamid dan agarosa dibedakan berdasarkan ukuran pori pada gel. Gel poliakrilamid yang mempunyai ukuran pori kecil, biasanya digunakan untuk memisahkan protein, molekul RNA, dan molekul DNA dengan ukuran yang sangat kecil. Sedangkan gel agarosa yang memiliki pori relatif lebih besar dari gel poliakrilamid, biasanya digunakan untuk memisahkan molekul DNA yang ukurannya lebih besar (Mikkelsen & Corton 1960). BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat Bahan-bahan yang digunakan adalah padi (daun padi) varietas aromatik (Pandan Wangi, Pulu Mandoti, Mentik Wangi, Sintanur, Pare Kembang, Gunung Perak, Gilirang, Rojo Lele), padi varietas nonaromatik (Ciherang, IR64, Niponbare, T309, Fatmawati), bufer ekstrak yang mengandung sodium dodesil sulfat (SDS), lauryl sarcosine, NaCl, Tris-HCl, dan etilendiamin tetraasetat (EDTA), untuk isolasi DNA. Bahan lain yang digunakan untuk isolasi DNA adalah isopropanol, etanol 70%, bufer tris-EDTA (TE) yang mengandung RNAse. Bahan yang digunakan pada reaksi PCR adalah 1x bufer PCR (10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 0,01% Gelatin), dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), primer Bradbury (ESP, EAP, IFAP, dan INSP) primer RM223, DNA, dan Taq DNA polimerase. Bahan lain yang digunakan adalah gel agarosa, etidium bromida (etbr), dan DNA standar yang digunakan pada analisis elektroforesis. Alat-alat yang digunakan untuk isolasi DNA yaitu tabung mikro, seperangkat mortar, tip pipet mikro, satu set pipet mikro, vorteks, sentrifus, dan inkubator. Alat yang digunakan untuk cek kualitas DNA adalah spektrofotometer dan seperangkat alat elektroforesis. Seperangkat alat dokumentasi gel (chemidoc gel system) digunakan untuk visualisasi hasil elektroforesis. Metode Penelitian Isolasi DNA Genom Padi Bibit padi yang telah berumur 3 minggu diisolasi DNA-nya dengan metode CTAB yang mengacu pada metode Doyle dan Doyle (1987). Sebanyak lebih kurang 0.5 gr daun padi dimasukkan ke dalam mortar steril. Ke dalam mortar ditambahkan sebanyak 1000 µl (2 x 500µl) bufer ekstraksi. Sampel hasil gerusan dimasukkan ke dalam tabung mikro 2 ml, kemudian diinkubasi di dalam penangas air pada suhu 65 C selama 15 menit. Selama inkubasi sampel dibolak-balik setiap 5 menit sekali. Setelah inkubasi selesai, sampel didiamkan pada suhu ruang selama beberapa saat, 8 kemudian ditambahkan sebanyak 100 µl natrium asetat 3M dan 1000 µl pelarut kloroform isoamilalkohol (Chisam). Campuran larutan pada tabung mikro digoyang-goyang perlahan untuk menghomogenkan semua larutan. Tabung mikro yang berisi campuran kemudian disentrifugasi pada kecepatan 10.000 g selama 5 menit. Sebanyak lebih kurang 600 µl supernatan (larutan di lapisan atas) dipindahkan ke tabung mikro 2 ml yang baru. Supernatan yang sudah dipindahkan kemudian ditambahkan dengan natrium asetat 3 M sebanyak 60 µl dan larutan isopropanol sebanyak 400 µl. Campuran larutan kemudian digoyanggoyang perlahan untuk menghomogenkan campuran larutan. Tabung disentrifuguasi pada kecepatan 10.000 g selama 5 menit. Supernatan dibuang, dan endapan DNA (pelet) dicuci dengan 50 µl ethanol 70%. Tabung disentrifugasi lagi pada kecepatan 10.000 g selama 3 menit dan kemudian supernatan dibuang. Endapan DNA dikeringkan menggunakan oven pada suhu 50 ºC selama lebih kurang 10 menit, dan dilarutkan kembali dalam 50 µl bufer TE yang mengandung RNase. Tabung diinkubasi pada 37 ºC selama 30 menit. Pengukuran Kualitas dan Kuantitas DNA Ekstrak DNA padi hasil isolasi dihitung konsentrasinya menggunakan alat spektrofotometer. Total volume yang digunakan untuk pengukuran pada spektrofotometer sebanyak 400 µl dan faktor pengenceran yang digunakan sebesar 200 kali. Larutan blanko yang digunakan adalah ddH2O sebanyak 400 µl. Pengukuran konsentrasi DNA dilakukan pada panjang gelombang 260 nm. Sedangkan untuk pengukuran kemurnian DNA dilakukan dengan perbandingan absorban 260/280 (A260/280). DNA yang murni mempunyai A260/280 = 1,8 hingga 2,0. Apabila nilainya kurang dari 1,8 maka sampel DNA masih mengandung kontaminan protein, dan untuk menghilangkannya ditambahkan protease. Apabila nilainya lebih dari 2,0 maka sampel DNA masih mengandung kontaminan RNA, dan untuk menghilangkannya ditambahkan ribonuklease. Kalibrasi spektrofotometer harus dilakukan sebelum digunakan untuk pengukuran sampel DNA. Sebanyak 400 µl ddH2O dimasukkan ke dalam kuvet lalu dimasukkan ke dalam spektrofotometer dan ditekan tombol read blank untuk kalibrasi. Sebanyak 2 µl sampel DNA dimasukkan ke dalam kuvet kemudian ditambahkan ddH2O sebanyak 398 µl. Konsentrasi DNA diukur pada panjang gelombang 260 nm dan kemurnian DNA diukur dengan perbandingan absorban 260/280 (OD 260/280). Tahap selanjutnya DNA diencerkan dengan konsentrasi akhir 50 µg/ml untuk proses amplifikasi PCR. Amplifikasi DNA Reaksi PCR dilakukan pada 25 µl volume yang mengandung 10 x bufer PCR (10 mM Tris-HCl (pH 8,3) sebanyak 2.5 µl, 1,5 µl MgCl2 50 mM, 0.5 µl masing-masing dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 5 mM, 1 µl masing-masing primer Bradbury (ESP, EAP, IFAP, dan INSP) 2 µM, 0.2 µl Taq DNA polimerase, template DNA 50 µg/ml sebanyak 2 µl, dan ditepatkan volumenya menjadi 25 µl dengan ddH2O sebanyak 14.3 µl. Pasangan primer yang digunakan mengikuti seperti yang diuraikan dalam Bradbury et al. (2005). Pasangan primer eksternal EAP dan ESP akan menghasilkan fragmen berukuran 580 sebagai kontrol positif untuk masing-masing sampel. Pasangan primer IFAP dan ESP akan menghasilkan fragmen alel aromatik berukuran 257 bp. Pasangan primer INSP dan EAP akan menghasilkan fragmen alel nonaromatik berukuran 355 bp. Primer lain yang digunakan adalah RM223 (GAGTGAGCTTGGGCTGAAAC dan GAAGGCAAGTCTTGGCACTG). Primer ini membedakan padi varietas aromatik dan nonaromatik berdasarkan ukuran pita DNAnya. Ukuran DNA yang diamplifikasi menggunakan primer ini adalah 120 bp-160 bp (Lang & Buu 2008). Mesin PCR yang digunakan untuk amplifikasi DNA adalah PCR TETRAD sebanyak 30 siklus. Program PCR yang digunakan sebagai berikut: denaturasi permulaan selama 2 menit pada suhu 94 ºC, denaturasi selama 30 detik pada suhu 94 ºC, proses penempelan primer selama 30 detik pada suhu 58 ºC, dan 45 detik pada suhu 94 ºC untuk perpanjangan primer. Perpanjangan primer terakhir selama 5 menit pada suhu 72 ºC. Elektroforesis DNA Gel agarose 1,5 % dibuat dengan cara melarutkan sebanyak 0.45 gr agarosa dengan 30 ml bufer TAE dan dipanaskan dengan microwave selama lebih kurang 1 menit. Setelah gel agarosa memadat, gel 9 dimasukkan ke dalam tangki elektroforesis yang berisi 1x bufer TAE. Sebanyak 10 µl produk PCR ditambahkan dengan 2 µl loading dye dan dicampur sempurna, kemudian dimasukkan ke dalam sumur gel. Disertakan 1 kb ladder sebagai marker untuk melihat ukuran DNA. Tahap selanjutnya sampel DNA dialiri arus dengan voltase 80 volt selama 35 menit. Gel agarosa diwarnai dengan larutan etidium bromida (10 mg/L) selama 10 menit. Tahap ini sering dikenal dengan staining gel (pewarnaan gel). Tahap selanjutnya adalah destaining gel (penghilangan warna gel). Tahap ini dilakukan dengan perendaman di dalam air selama lebih kurang 10 menit. Gel agarosa selanjutnya divisualisasi dengan chemidoc gel system. HASIL DAN PEMBAHASAN Uji Kualitas DNA Padi Isolasi DNA padi dilakukan dengan menggunakan metode CTAB. Kualitas DNA yang diisolasi tersebut diuji secara kualitatif dan kuantitatif dengan spektrofotometer dan gel agarosa. Data Tabel 3 menunjukkan hasil pengukuran kualitas DNA secara kuantitatif dan kualitatif yang meliputi konsentrasi dan kemurnian DNA. Dari seluruh sampel yang dihitung konsentrasi dan kemurniannya, secara umum konsentrasi DNA hasil isolasi menggunakan metode CTAB memiliki konsentrasi yang relatif besar. Konsentrasi DNA yang diperlukan untuk amplifikasi PCR tidak begitu besar, sehingga konsentrasi DNA yang sudah diperoleh sudah cukup digunakan untuk amplifikasi/perbanyakan DNA dengan mesin PCR. Konsentrasi DNA yang diperoleh dari hasil isolasi tidak seragam (Tabel 3). Oleh sebab itu, konsentrasi DNA yang sudah diperoleh diseragamkan dengan pengenceran. Hal tersebut dilakukan untuk menjamin bahwa jumlah DNA yang akan amplifikasi dengan PCR mempunyai konsentrasi yang sama dengan harapan jumlah amplifikasi DNA juga seragam. Konsentrasi DNA dari seluruh sampel diseragamkan menjadi 50 µg/ml dengan pengenceran. Kemurnian DNA diperoleh dari perbandingan absorban A260/280. Nilai kemurnian DNA berkisar antara 1.8-2.0 (Sambrook & Russell 1989). Nilai kemurnian DNA hasil isolasi sudah sesuai dengan batasan pada literatur. Tabel 3 Pengukuran Konsentrasi dan Kemurnian DNA daun padi Varietas padi Pare Kembang (A) Mentik Wangi (A) Pandan Wangai(A) Pulu Mandoti (A) Pinjan (A) Gilirang (A) Gunung Perak (A) Ciherang (NA) Nipponbare (NA) IR64 (NA) Fatmawati (NA) T309 (NA) Konsentrasi (µg/ml) 1481.0271 1963.0995 3417.4866 1022.0799 2217.8862 1184.1504 1068.8307 840.9152 729.3049 2164.5728 1349.0306 933.5104 A260/280 1.8577 1.8432 1.8472 1.8008 1.8394 1.8016 1.8382 1.9024 1.8874 1.9647 1.8471 1.8653 A: aromatik, NA: nonaromatik Oleh sebab itu, DNA hasil isolasi sudah dapat digunakan untuk amplifikasi PCR karena sudah tidak terkontaminasi polisakarida maupun protein. Gambar 4 dan Gambar 5 menunjukkan hasil uji kualitas DNA secara kuantitatif. Hasil tersebut diperoleh dari DNA hasil isolasi yang diuji menggunakan elektroforesis dengan gel agarosa 1.5 %. Gambar 4 menunjukkan DNA hasil isolasi belum murni/masih terkontaminasi RNA. Untuk menghilangkan kontaminasi RNA dilakukan penambahan enzim RNase yang akan mendegradasi RNA. Pola pita hasil elektroforesis yang menunjukkan DNA sudah murni ditunjukkan oleh Gambar 5. Sebagai kontrol positif atau pembanding digunakan DNA lambda yang konsentrasinya sudah diketahui. Konsentrasi DNA lambda yang digunakan adalah 20 ng/µl, 40 ng/µl, 60 ng/µl, dan 80 ng/µl. Konsentrasi DNA lambda ini dapat digunakan untuk menghitung konsentrasi DNA dengan cara membandingkan luas pita hasil elektroforesis. Namun demikian, hal tersebut tidak dilakukan karena pita DNA hasil elektroforesis yang diperoleh terdapat smear. Smear pita DNA tersebut disebabkan oleh DNA yang diperoleh ada yang terpotong, sehingga pita-pita DNA yang tidak sama ukurannya akan menimbulkan pita smear seperti pada gambar. Dengan demikian, konversi konsentrasi DNA sampel dengan DNA pembanding tidak bisa dilakukan. Pita smear DNA sampel (Gambar 5) bukan kontaminasi RNA, melainkan pitapita DNA yang terpotong. Hal tersebut mungkin disebabkan oleh pemipetan berulang-ulang, sehingga DNA akan terpotong.
