laporan praktikum - Blog UB

LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI PERTANIAN
“ISOLASI DNA HALUS”
DISUSUN OLEH :
NAMA
: Joko Pilianto
NIM
: 115040213111043
KELOMPOK : Jumat, 09:15
ASISTEN
: Nilam
PROGRAM STUDI AGROEKOTEKNOLOGI
FAKULTAS PERTANIAN
UNIVERSITAS BRAWIJAYA
MALANG
2012
1
I PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari DNA. Salah
satu prinsisp isolais DNA yaitu dengan sentrifugasi. Sentrifugasi
merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat
molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul
besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan
berada pada bagian atas tabung. Hasil sentrifugasi akan
menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada
bagian atas dan pelet pada bagian bawah (Asris, 2010).
Polymerase chain reaction (PCR) merupakan fasilitas dalam
mempelajari genetik tanaman maupun hewan. Sidik DNA, analisis
forensik, pemetaan genetik dan filogenetik dapat dipelajari dengan
PCR. Beberapa teknik analisis keanekaragaman genetik,
membutuhkan amplifikasi daerah genom tertentu dari suatu
organisme (Demeke dan Adams. 1994).
Primer biasanya terdiri dari 10-20 nukleotida dan dirancang
berdasarkan daerah konservatif dalam genom tersebut. Makin
panjang primer, makin spesifik daerah yang diamplifikasi. Jika suatu
18 kelompok organisme memang berkerabat dekat, maka primer
dapat digunakan untuk mengamplifikasi daerah tertentu yang sama
dalam genom kelompok tersebut. Beberapa faktor seperti konsentrasi
DNA, ukuran panjang primer, komposisi basa primer, konsentrasi
ion Mg, dan suhu hibridisasi primer harus dikontrol dengan hati-hati
agar dapat diperoleh pita-pita DNA yang utuh dan baik (Suryanto,
2003).
Keberhasilan teknik ini lebih didasarkan kepada kesesuaian
primer dan efisiensi dan optimasi proses PCR. Reaksi berantai
polymerase (Polymerase Chain Reaction, PCR) adalah suatu metode
enzimatis untuk melipatgandakan secara eksponensial suatu sekuen
nukleotida tertentu dengan cara in vitro. Metode ini telah banyak
digunakan untuk berbagai macam manipulasi dan analisis genetik
baik berupa molekul DNA maupun RNA (Yuwono, 2006).
2
1.2 Tujuan
 Untuk mengetahui pengertian isolasi DNA dan PCR
 Untuk mengetahui uji kualitas DNA
 Untuk mengetahui komponen dan tahapan PCR
 Untuk mengetahui manfaat PCR
3
II. TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Pengertian Isolasi DNA dan PCR
Isolasi DNA adalah suatu langkah mempelajari DNA. Salah
satu prinsisp isolais DNA yaitu dengan sentrifugasi. Sentrifugasi
merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat
molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul
besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan
berada pada bagian atas tabung. Hasil sentrifugasi akan
menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada
bagian atas dan pelet pada bagian bawah (Asris, 2010).
Penggunaan DNA untuk analisis atau manipulasi biasanya
perlu diisolasi dan dimurnikan sampai batas tertentu. DNA pulih dari
sel dengan metode yang mungkin paling lembut pecahnya sel untuk
mencegah DNA dari fragmentasi oleh geseran mekanik (Walker,
2009).
Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan suatu proses
sintesis enzimatik untuk mengamplifikasi nukleotida secara in vitro
(Fatchiyah, 2012).
PCR (Polymerase Chain Reaction) merupakan suatu teknik
perbanyakan (amplifikasi) potongan DNA secara in vitro pada
daerah spesifik yang dibatasi oleh dua buah primer oligonukleotida.
Primer yang digunakan sebagai pembatas daerah yang diperbanyak
adalah DNA untai tunggal yang urutannya komplemen dengan DNA
templatnya. Proses tersebut mirip dengan proses replikasi DNA
secara in vivo yang bersifat semi konservatif (Mahmudin, 2010).
2.2 Uji Kualitas DNA
Untuk mengetahui uji kualitas DNA perlu di lakukan uji
Analisa kualitas dengan melakukan serangkaian proses yang
berperan untuk mengetahui konsentrasi dan menganalisa kualitas
dari DNA tersebut. Kualitas DNA sangat erat kaitannya dengan
kemurnian DNA terhadap berbagai kontaminan seperti kontaminan
protein. Kemurnian DNA dapat diukur melalui rasio antara absorpsi
4
suspensi DNA pada panjang gelombang 256 nm terhadap panjang
gelombang 280 nm (Anonymousa, 2008)
2.3 Komponen Dan Tahapan PCR
Pada reaksi PCR diperlukan DNA template, primer spesifik,
ensim DNA polimerase yang thermostabil, buffer PCR, ion
Mg2+, dan thermal cycler.
Template DNA
Ukuran target amplifikasi biasanya kurang dari 1000
pasangan basa (bp) atau 1KB, Hasil amplifikasi yang efisien antara
100-400bp. Walaupun kemungkinan hasil amplifikasi lebih dari 1 kB
tetapi prosesnya kurang efisien, karena produk yang panjang rentan
terhadap inhibitor yang mempengaruhi kerja ensim DNA polymerase
dan waktu yang diperlukan lebih lama. Hal ini dapat menyebabkan
hasil amplifikasi yang tidak diinginkan .
Primers
Primer disusun dari sintesis oligonukleotida sepanjang 1532bp dan primer ini harus mampu mengenali urutan yang akan
diamplifikasi. Untuk standar amplifikasi sepasang primer akan
mempunyai kisaran pasangan basa sekitar 20 basa panjangnya pada
tiap primernya. Kandungan GC harus antara 45-60%. Annealing
temperatur antara primer yang digunakan harus berkisar antara 1°C.
Ujung 3’ dari setiap primer harus G atau C, akan tetapi hindari
susunan nukleotida G/C berturut-turut tiga pada ujung ini, misal
CCG, GCG, GGC, GGG, CCC, GCC. Pada penentuan atau
penyusunan sepasang primer, penting diperhatikan urutan primer
tidak saling komplementer sehingga membentuk dimer-primers,
berikatan satu sama lain, atau membentuk hairpins. Hal lainnya
hindari menyusun primer pada daerah DNA repetitif.
Taq DNA polymerase
Enzim ini bersifat thermostabil dan diisolasi dari Thermus
aquaticus. Aktivitas polimerisasi DNAnya dari ujung-5’ ke ujung-3’
dan aktivitas enzimatik ini mempunyai waktu paruh sekitar 40 menit
pada 95ºC. Biasanya untuk setiap 100μl volume reaksi ditambahkan
2,0-2,5 unit.
5
PCR buffer dan konsentrasi Mg2+
Buffer standar untuk PCR tersusun atas 50 mM KCl, 10 mM
Tris-Cl (pH 8.3) dan 1.5 mM MgCl2. Buffer standard ini akan
bekerja dengan baik untuk DNA template dan primer dengan kondisi
tertentu, tetapi mungkin tidak optimum dengan kombinasi yang
lain. Produk PCR buffer ini terkadang dijual dalam bentuk tanpa
atau dengan MgCl2.
Konsentrasi ion magnesium dalam PCR buffer merupakan
faktor yang sangat kritikal, karena kemungkinan dapat
mempengaruhi proses annealing primer, temperatur dissosiasi untai
DNA template, dan produk PCR. Hal ini disebabkan konsentrasi
optimal ion Mg2+ itu sangat rendah. Hal ini penting untuk preparasi
DNA template yang tidak mengandung konsentrasi chelating agent
yang tinggi, seperti EDTA atau phosphat. Ion Mg2+ yang bebas bila
terlalu rendah atau tidak ada, maka biasanya tidak menghasilkan
produk akhir PCR, sedang bila terlalu banyak ion Mg2+yang bebas
akan menghasilkan produk PCR yang tidak diinginkan.
Nucleotides (dNTPs)
Konsentrasi yang biasanya digunakan untuk setiap dNTP
adalah 200 μM. Pada konsentrasi ini penting untuk mengatur
konsentrasi ke-empat dNTP pada titik estimasi Km untuk setiap
dNTP. 50mM, harus selalu diatur pH7.0. Konsentrasi yang tinggi
akan menimbulkan ketidakseimbangan dengan enzim polymerase.
Sedang pada konsentrasi rendah akan memberikan ketepatan dan
spesifitas yang tinggi tanpa mereduksi hasil akhir. Total konsentrasi
dNTP dan ion saling terkait dan tidak akan merubah secara bebas.
PCR Thermal Cycler
PCR thermal cycler pertama kali dikembangkan oleh
perusahaan PerkinElmer sebagai pemegang paten asli. Pada saat ini
telah diproduksi berbagai macam tipe alat PCR thermal cycler ini
dari berbagai perusahaan yang bergerak dalam bioteknologi.
Walaupun nama masing-masing alat itu berbeda tetapi prinsip
kerjanya sama (Fachtiyah, 2012).
6
2.3 Manfaat PCR
Seleksi yaitu Untuk memilih tanaman yang sifatnya sesuai
dengan yang diinginkan. MAS (Marker Assisted Selection): penanda
pembantu seleksi. Keuntungan seleksi dengan PCR yaitu mampu
menyeleksi dalam waktu cepat, tidak perlu menunggu hingga
tanaman dewasa.
Uji kemurnian benih Uji perlindungan varietas tanaman agar
hak paten benih tidak dibajak oleh orang lain
Untuk mengetahui keragaman genetik, hal ini penting
diketahui untuk proses persilangan, sehingga di dapat varietas unggul,
jika keragaman tinggi maka kekerabatannya akan semakin tinggi,
begitu pula sebaliknya (Puspita, 2010).
7
III. METODOLOGI
3.1 Alat, bahan, dan fungsi
3.1.1 Alat
 Mortar & pestle : untuk menghaluskan bahan
 gelas ukur
: untuk mengukur larutan yang akan
digunakan
 Tabung eppendorf : sebagai tempat untuk bahan yg diuji
 tissue
: untuk membersihkan
 gunting
: untuk menggunting bahan yang akan
digunakan
 mikropipet
: untuk mengambil larutan dalam jumlah
yang kecil
 spatula
: sebagai alat untuk mencampur bahan
 erlenmeyer
: tabung untuk wadah bahan yang diuji
 microwave
: sebagai alat untuk pensterilan
 mesin vortex
: sebagai alat untuk menghomogenkan
bahan
 timbangan analitik : sebagai alat untuk menimbang bahan
 stirer
: sebagai alat untuk mencampurkan bahan
 pH meter
: untuk mengukur pH
 mesin centrifuge : untuk mengetahui perbedaan lapisan antara
supernatan dan lapisan lainnya
 autoclave
: untuk pensterilan bahan
 freezer
: untuk penginkubasian larutan
3.1.2 Bahan
 Buffer ekstraksi CTAB dan Merkaptoethanol : untuk melisis
membran sel daun
 nitrogen cair
: untuk mempermudah penggerusan
 PVP (polyvinilpirolidone) : untuk melindungi agar DNA tidak
rusak
 CHISAM (Chloroform, Isoamilalkohol) : untuk mendegradasi
protein
 buffer pencuci
: sebagai larutan penyangga
8




buffer TE
RNAse
Isopropanol
Daun srikaya
: sebagai larutan penyangga
: sebagai enzim dalam isolasi DNA
: untuk resipitasi
: sebagai bahan yang diuji
3.2 Cara Kerja
+ buffer ekstrasi
CTAB (1 ml)
timbang sample 0,3
gr + PVP 1 % + N2 -196 ºC
+ β mercaptoetanol 5 μl
+ inkubasi 30’ 65 ºC
+ chisam 500 μl Di vortex sentrifuge 10000 rpm 10’
Ambil supernatan
+ chisam 1 x volume supernatan
Sentrifuge 10000 rpm 10’
+ isopropanol 0,45 x volume supernatan invert
Inkubasi freezer 30’
Sentrifuge 10000 rpm 10’
Buang isopropanol
DNA pellet + buffer pencuci 200 μl 2x
+ RNAse 1 μl
+ resuspensi dengan elution buffer 20-50 μl
Simpan untuk elektroforesis
9
Dokumentasi langkah kerja
3.3 Analisa Perlakuan
Untuk Perlakuan Pada praktikum isolasi DNA ini bahan
yang digunakan adalah daun srikaya. Langkah pertama yang
dilakukan adalah mengisi tabung eppendorf dengan 1 ml buffer
ekstraksi CTAB (CTAB 3%, NaCl 1,4 M, EDTA 0,002M dan Tris HCl 0,1M) dan 5 µl mercaptoethanol. Daun srikaya ditimbang 0,3
gram dan digerus dalam mortar dengan bantuan nitrogen cair dan
ditambah PVP 1%, kemudian dimasukkan kedalam tabung eppendorf
yang sudah berisi 1 ml buffer ekstraksi CTAB dan 5 µl
10
mercaptoethanol. Setelah itu ekstrak daun divortex hingga homogen.
Ekstrak daun diinkubasi dalam suhu 65 oC selama 30 menit sambil
dibolak-balik tiap 10 menit. Kemudian ditambahkan 500 µl chisam
(Chloroform : Isoamylalcohol (24:1)).
Untuk lebih lanjutnya Setelah itu ekstrak daun divortex
hingga homogen. Ekstrak daun kemudian disentrifuge selama 10
menit dengan kecepatan 10000 rpm. Dan diambil supernatannya.
Supernatan dimasukkan pada mikrovivet baru dan ditambahkan
chisam 1 x volume supernatan. Larutan supernatan dan chisam
disentrifuge selama 10 menit dengan kecepatan 10000 rpm. Fase atas
dimasukkan tabung baru ditambah isopropanol 0,45 x volume
supernatan. Larutan tersebut dibolak-balik perlahan hingga tampak
benang-benang putih dalam larutan. Larutan diinkubasi dalam
freezer selama 30 menit. Setelah diinkubasi, larutan disentrifugasi
selama 10 menit dengan kecepatan 10000 rpm setelah itu supernatan
dibuang dengan hati-hati agar endapan DNA pellet tidak ikut
terbuang. Endapan DNA pellet dicuci dengan buffer pencuci dengan
cara menambahkan 200 μl buffer pencuci ke dalam tube, kemudian
cairan di buang. Pencucian ini dilakukan 2 kali. Setelah itu endapan
DNA pellet dikering anginkan. Endapan DNA kemudian
diresuspensi dengan 20-50 μl buffer TE lalu ditambah 1 μl RNAse
dan disimpan dalam lemari es untuk elektroforesis.
11
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Gambar Hasil Elektroforesis
Gambar Elektroforesis berwarna (asli) dan Gambar Elektroforesis
hitam putih.
Keterangan:
SAMPLE 1
= KUBIS
SAMPLE 2
= KUBIS (ADA)
SAMPLE 3
= KUBIS (ADA)
SAMPLE 4
= TOMAT
SAMPLE 5
= TOMAT
SAMPLE 6
= BAYAM
SAMPLE 7
= BAYAM (ADA)
SAMPLE 8
= BAYAM
SAMPLE 9
= UBI JALAR
SAMPLE 10 = UBI JALAR
SAMPLE 11 = UBI JALAR
SAMPLE 12 = JERUK (ADA)
SAMPLE 13 = JERUK (ADA)
4.2 Analisa Gambar Hasil Elektroforesis
Dapat kita ketahui Dari hasil gambar diatas dapat diketahui
bahwa penyinaran dibawah lampu UV dapat dilihat berupa potongan
pita-pita DNA yang mempunyai fragmen-fragmen. Pada daun
srikaya dapat diketahui bahwa salah satunya potongan fragmen pita
DNA yang banyak terurai dan kurang sempurna karena pengaruh
12
konsentrasi agarose yang menyebabkan DNA bermigrasi, sehingga
fragmen-fragmennya lebih besar.
Dari setiap bahan yang dilakukan untuk praktikum ini tidak
semua akan muncul pita DNA saat dielektroforesis. Hal ini
dikarenakan kurang efektifnya perlakuan saat praktikum dan
kesterilan alat dan bahan praktikum. Hal ini menyebabkan tidak
munculnya pita DNA saat dielektroforesis dibawah lampu UV.
Pada elektroforesis tersebut terdapat bermacam-macam
kontaminasi, diantaranya smear (semburan) yang diakibatkan karena
adanya kontaminasi protein dan DNA terdegradasi, berapi-api yang
disebabkan karena adanya kontaminasi polisakarida, dan pita tebal
dibawah bagian bawah gel agarose yang disebabkan karena adanya
kontaminasi RNA. Dari gambar hasil elektroforesis ini dapat
diketahui bahwa adanya kontaminasi polisakarida dengan
ditunjukkan adanya gambar berapi-api diatas pita DNA yang sangat
tebal (Asris, 2010).
13
V. PENUTUP
5.1 Kesimpulan
Pada praktikum kali ini isolasi DNA ini dapat disimpulkan
bahwa isolasi DNA bertujuan untuk mengetahui DNA murni dari
suatu organisme dengan bantuan zat kimia untuk memurnikannya.
Dari hasil sentrifuge pertama dihasilkan 3 lapisan yaitu lapisan
supernatan, lapisan organik, dan lapisan fenol. Dan pada sentrifuge
kedua dihasilkan 2 lapisan, yaitu lapisan DNA pellet dan lapisan
supernatan. DNA pellet ini lah yang nantinya akan diuji kualitas
DNAnya yang sering disebut dengan elektroforesis tetapi dalam
praktikum kami masih banyak kekurangan karena masih belum
sefring melakukan isolasi DNA jadi hasil yang di dapatkan tidak
maksimal.
5.2 Saran
Praktikumnya berjalan dengan baik dan perlu di persiapkan
alatnya terlebih dahulu agar lebih lancar.
14
DAFTAR PUSTAKA
Anonymousa. 2008. 260/280 and 260/230 Ratios. [terhubung
berkala] www.nanodrop.com. Diakses tanggal 25 November
2012
Asris. 2010. Isolasi DNA. http://asris07.student.ipb.ac.id/
2010/06/19/isolasi-dna/. Diakses tanggal 25 November 2012
Fatchiyah. 2012. Dasar Teknik Amplifikasi DNA. http://fatchiyah.
lecture.ub.ac.id/general/bbbb/. Diakses tanggal 25 November
2012
Mahmudin. 2010. Polymerase Chain Reaction. http://mahmuddin.
wordpress.com/2010/08/31/polymerase-chain-reaction-pcr/.
Diakses tanggal 25 November 2012
Puspita. 2010. ISOLASI DNA. http://puspitt.multiply.com/journal/
item/14/ISOLASIDNA?&show_interstitial=1&u=%2Fjournal
%2Fitem. Diakses tanggal 25 November 2012.
Walker. 2009. Molecular Biology and Biotechnology. RSC
Publisher : Cambridge.
15