Teknologi DNA Rekombinan

Teknologi DNA
Rekombinan
ENZIM RESTRIKSI
 Fungsi: melindungi bakteri dari DNA asing (seperti virus).
 DNA organisme penghasil enzim mengalami metilasi
sehingga tidak dapat dipotong
 Enzim restriksi tipe I: memotong DNA pada jarak 1000 bp
atau lebih dari sisi pengenalan
 Enzim restriksi tipe II: memotong pada bagian tengah sisi
pengenalan.
 Memotong DNA untai ganda pada titik yang sama
menghasilkan ujung tumpul (blunt end)
 Memotong DNA pada titik yang berbeda menghasilkan
ujung lancip (sticky end)
 Jumlah bp menentukan kemungkinan untuk
menemukan sisi pemotongan.
 Untuk menghasilkan fragmen DNA yang lebih
panjang digunakan enzim restriksi dengan sisi
pengenalan enam atau lebih bp
DNA Ligase

DNA ligase dari T4 bacteriophage.

Mengkatalisis pembentukan ikatan antara 3’OH dari satu untai dan 5’-PO4 dari untai DNA
lain

Ligase bekerja lebih efisien pada ujung lancip
dibanding dengan ujung tumpul.
Restriction Fragment
Length
Polymorphism (RFLP)
Deteksi Asam Nukleat
 Ultraviolet
 DNA menyerap sinar UV karena struktur cincin
pada basa
 RNA dan juga nukleotida
menyerap sinar UV
 Konsentrasi DNA ditentukan pada panjang
gelombang 260 nm
Penandaan DNA dengan
Radioaktif
 Sinar UV dapat mendeteksi DNA, tetapi tidak
dapat membedakan molekul DNA yang
berbeda.
 Prekursor nukleotida radioaktif 32P atau 35S
ditambahkan dalam medium pertumbuhan.
 Autoradiografi digunakan untuk mendeteksi
DNA bertanda.
 Peluruhan radioaktif menghasilkan radiasi
yang dapat menyebabkan film fotografi
menjadi hitam
•
DNA radioaktif dapat dideteksi dengan
scintillation counting.
•
Peluruhan isotop radioaktif menghasilkan
partikel beta.
•
Cairan scintillation akan mengalami eksitasi
dan kemudian mengemisikan sinar
•
Scintilation counter akan mendeteksi sinar
yang diemisikan .
Deteksi DNA dengan
Fluoresens
•
Fluoresecence tags menyerap cahaya pada
satu panjang gelombang .
•
Atom mengalami eksitasi yang selanjutnya
akan memancarkan cahaya dengan panjang
gelombang berbeda ketika kembali ke
keadaan dasar.
•
Foton yang diemisikan akan dideteksi oleh
detektor
Biotin dan Digoxigenin
•
Biotin adalah vitamin
•
Digoxigenin adalah hormon steroid dari
tumbuhan foxglove.
•
Biotin atau digoxigenin berikatan dengan urasil
• DNA hasil sintesis mengandung dUTPbiotin/digoxigenin, menggantikan dTTP
DNA bertanda dengan senyawa yang
dapat berfluoresens
Visualisasi DNA bertanda:
DNA: Melting dan Reannealing
• DNA dapat mengalami ‘melting’ dan bergabung kembali
‘reanneal’
• Pemanasan dapat merusak ikatan hidrogen.
• Pada pendinginan perlahan dapat terbentuk ikatan
hidrogen antar kedua untai DNA yang saling komplemen.
Southern Blot
(Ed Southern)
• SB digunakan untuk menentuk kedekatan DNA dari satu
sumber dengan DNA dari sumber lain.
•
•
•
•
Isolasi DNA target
•
•
•
•
Transfer DNA untai tunggal ke membran
Pemotongan dengan enzim restriksi
Pemisahan fragmen DNA dengan elektroforesis
Pemisahan DNA untai ganda dengan cara menginkubasi
gel dengan asam kuat.
Pembuatan probe/pelacak
Denaturasi DNA pelacak.
Hibridisasi DNA target dengan DNA pelacak
•
High stringency: Temperatur tinggi dan
konsentrasi garam rendah. DNA templat dan
pelacak berhibridisasi sempurna
•
Low stringency: temperatur rendah dan kadar
garam tinggi. DNA templat dan pelacak
mempunyai mismatches.
Nothern Blot
•
Target molekul: RNA
• Variasi teknik hibridisasi: dot blot
Zoo Blot: Kemiripan urutan nukleotida antara
beberapa spesies yang berbeda
Fluorescene In Situ
Hybridization
•
Hibridisasi pelacak dengan DNA/RNA di dalam
sel.
•
Sumber DNA: sayatan jaringan, kultur
mamalia, kultur serangga, darah (sel darah
putih).
• Pemanasan sampel DNA
•
Hibridisasi dengan pelacak bertanda
(fluoresens)
Analisis FISH gen RUNX1 yang mengalami
peningkatan jumlah kopi pada penderita leukemia
akut karena polisomi pada kromosom 21.
RUNX1: Merah; TEL: Hijau
Vektor Kloning
•
Herbert W Boyer: enzim restriksi dan
pemodifikasi
•
Stanley N. Cohen: Plasmid resistan antibiotik
dan teknik transformasi dengan CaCl2.
Vektor Kloning
• Ukuran kecil, mudah dimanipulasi
• Dapat ditransfer dari sel ke sel
• Mudah diisolasi
• Mudah dideteksi dan diseleks
• Plasmi multi kopi (membantu utk mendapatkan
•
•
DNA dalam jumlah besar)
Mempunyai beberapa sisi pengenalan enzim
restriksi
Ada metode untuk mendeteksi keberadaan
DNA insert
Vektor Kloning Umum