Disampaikan dalam Kongres Nasional Pertama, Asosiasi

POSTER-3
The Role of Mast Cells on Receptor Antigen Presenting Cell Expression
After PROTEIN IMMUNOGEN Brucella abortus S-19 Injection
Oleh :Budi Utomo1, Retno Bijanti2
1,2
Laboratorium Phatology Clinic Laboratory,
Faculty of Veterinary Medicine Klinik Veteriner
Airlangga University, Mulyorejo Kampus C UNAIR, Surabaya 60115
Telp: 031-5552785, Fax : 031-5993015
Abstract
Brucellosis caused by Brucella spp is a major zoonotic disease. Brucella are
facultativr intraseluler bacteria which develop mainly in the Reticulo Endothelial Syatem
(RES) and occasionally in other target organs, such as joints and placenta, and can
cause abortus in cattle. The major species involved in bovine brucellosis is Brucella
abortus. In many parts of the world, vaccination of cattle is done by inoculation calves
with Brucella abortus S-19 . In fact, the virulent and apparently unstable, creating the
need for improved vaccines for addition, Brucella spp may ar may not provide cross
protection against Brucella spp, hampering the acceleration of vaccine development.
Serodiagnosis by conventional tests, which principally measure antibody to Smooth
Lipopolysaccharide (S-LPS), does not permit a clear cut distinction between vaccinated
and infected cattle. Thus, work actually performed in the field of bovine brucellosis
identifies protective antigens and antigens useful for diagnosis. The purpose of the
present study will to investigate by SDS-PAGE and Immunoblot analysis (WesternBlotting ) using the anti-OMP poliklonal antibody the potential usefulness of these Outer
Membrane Proteins as diagnostic antigens. The result of the molecular weight of Outer
Membrane Proteins (OMP) by using SDS-PAGE is 6,5 ; 20,1 ; 29,0 ; 66,0 ; 116,0 ;
205,0 kDa. In the next stage of the research characterization protein OMP is 13,4 ; 14,6
; 37,2 ; 61,8 and 164,1 kDa ,by using the anti-OMP polyclonal antibody the potential
usefulness of these OMPs as diagnostic antigens . Inlast step from protein OMP by
using indirect ELISA , the OD are 0,325; 0,586; 0,975; 0,643; 0,598 and the highest OD
is 0,975 ( protein OMP with molecule weight 37,2 kDa ). “Uji tantang” with protein OMP
37,2 kDa to Rabbit immunization, after three weight, take blood serum and by using
indirect ELISA measured. The result is 0,968, so that the conclusion is the protein
OMPs with molecule weight 37,2 kDa have potential as Kitt diagnostic.
Key words: Zoonotic, SDS-Page, Western Blotting, Outer Membrane
Pendahuluan
Brucellosis adalah penyakit pada ternak yang bersifat zoonosis disebabkan oleh
bakteri dari genus brucella . Pada sapi , domba dan kambing penyakit ini menyerang
organ saluran reproduksi terutama plasenta sehingga menyebabkan keguguran ,
sehingga dikenal juga dengan sebutan penyakit “ Keluron Menular “, Contagious
Abortion atau Epizootic Abortion.
Disampaikan dalam Kongres Nasional Pertama,
Asosiasi Farmakologi dan Farmasi Veteriner Indonesia, Denpasar 26 Maret 2011
1
POSTER-3
Diagnosis yang tepat penyakit brucellosis sangat diperlukan untuk membantu upaya
pencegahan dan penanggulangannya. Diagnosis terhadap penyakit brucellosis di
lapangan selama ini hanya berdasarkan dari sejarah penyakit, tanda klinis dan
perubahan pasca mati, sedangkan diagnosis di laboratorium dilakukan isolasi –
identifikasi kuman penyebab dan uji serologis (Alton et al, 1988)
Salah satu factor yang ikut mempengaruhi rendahnya proses vaksinasi terhadap
penyakit Brucella adalah transisi penyakit dan pengaruh lingkungan dan ekspresi gene
(environment effect and gene expression) (Widjajanto, 2007). Dari penelitian yang
telah dilakukan oleh Ratnasari dkk (2004) diketahui bahwa antigen Brucella abortus S19 didapat dari Outer Membrane Protein diduga mempunyai sifat Immunogen.
Peran protein immunogenic untuk dipakai dalam proses peningkatan antibody dan
penyuntikkan Outer Membrane Protein Brucella abortus S-19 adalah sangat penting
dan tidak lepas pula mengetahui peran Mast Cells yang mempunyai fungsi sebagai
komponen selluler dari sistim imun (Bellanti, 1993 ).
Pentingnya mengtahui peran Mast Cells yang mempunyai fungsi sebagai komponen
seluler dari sistim imun , distribusinya perivaskuler dan tersebar pada berbegai daerah
“ part of entery” (Bellanti, 1993 ). Sebagai sel imun , Mast cells memiliki berbagai
kemampuan sebagaimana yang dimiliki oleh netrofil dan makrofag , selain itu Mast
Cells masih mempunyai kelebihan dalam hal ber umur panjang dan memiliki reseptor
untuk Ig E . Reaksi Mast Cells setempat dan berbagai sel imun lainnya merupakan “
first layer defense mechanism “ yang penting (Widjajanto, 2004 ).
Granula Mast Cells bersama dengan granula dan eosinofil serta berbagai mediator
yang dilepaskan oleh makrofag dan netrofil merupakan komponen “innate” .Limfosit T
dan limfosit B serta IgG dan IgE merupakan komponen imun spesifik yang memandu
aktifitas “sistim Innate “ (Ratnasari dkk , 2004) .
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui hubungan Mast Cells dengan ekspresi
reseptor Antigen Presenting Cells (APC) setelah injeksi Outer Membrane Protein
immunogen Brucella abortus S-19. Penting untuk mengetahui mekanisme antara Mast
Cells dengan Antigen Brucella abortus S-19 setelah injeksi Outer Membrane Protein
immunogen ,karena peran keduanya sangat mempengaruhi kualitas peran dari protein
yang imunogenik- antigenic dan nantinya sangat mempengaruhi pula kualitas vaksin.
Materi dan metode
Pembiakan Kuman Brucella abortus S-19
Pembiakan Kuman Brucella abortus S -19 dibiakkan pada media Potato Agar (PA),
yang ditempatkan pada botol-botol roux diinkubasikan pada suhu 37 derajat Celcius
selama dua hari. Kemudian koloni kuman Brucella abortus yang larut dalam larutan
stabilizer dipanen ke dalam tabung . Kemudian larutan disaring dengan kain kasa steril,
lalu ambil sebanyak 2 cc masukkan kedalam tabung eppendorf.
Pembuatan protein Membran Luar (OMP)
Supernatant hasil biakan kuman Brucella abortus S-19 masukkan ke dalam tabung
sonikasi dengan ditambahkan larutan Phosphate Buffer Solution (PBS) . Sentrifus
dengan kecepatan 5000 rpm selama 20 menit, supernatant hasil sentrifus di sonikasi
Disampaikan dalam Kongres Nasional Pertama,
Asosiasi Farmakologi dan Farmasi Veteriner Indonesia, Denpasar 26 Maret 2011
2
POSTER-3
dengan alat Ultrasonic homogenizer frekwensi 25 kHz selama 3 X 3 menit ( 3 kali
sonikasi setiap sonikasi lamanya 3 menit dan setiap 3 menit sonikasi dihentikan selama
1 menit). Selama proses sonikasi, tabung sonikasi tempat sampel kuman Brucella
abortus dimasukkan dalam wadah yang berisi air es (es batu) dan garam, lalu sentrifus
dengan kecepatan 12.000 rpm selama 20 menit, ambil supernatant dan masukkan
dalam microcup (supernatant inilah yang kita sebut sebagai protein membrane luar
(OMP).
Analisis Protein dengan Teknik SDS PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate
Polycrilamid Gel Electrophoresis)
Teknik ini dilakukan untuk menentukan berat molekul protein Brucella abortus S-19.
Pada teknik ini menggunakan larutan separating gel 12,5% dan larutan stacking gel
15% (Rantam, 2003). Hasil gel yang telah menunjukkan adanya band protein.
Perhitungan berat molekul dilakukan dengan perbandingan band protein yang
dimaksud dengan standar yaitu marker protein (Color Burst Electroforesis Marker, No.
C.4105) (Rantam.,2003 ).
Pembuatan Antibodi Poliklonal terhadap Brucella abortus S-19
Pembuatan antibody poliklonal terhadap Brucella abortus S-19 dibuat dengan cara
menyuntikkan protein OMP Brucella abortus S-19 dengan dosis ½ dari dosis sapi yaitu
nerkisar 20 sampai 60 X 10 pangkat Sembilan/ 0,5 ml pada kelinci jantan melalui
subkutan. Booster dilakukan dengan mencampurkan protein membrane luar (OMP)
Brucella abortus S-19 dengan Complete Freund’s Adjuvant (CFA), booster pertama
dilakukan dua minggu setelah imunisasi. Booster kedua dilakukan dengan interval 10
hari dengan menginjeksi campuran protein membrane luar (OMP) .
Karakteristik Protein Membran Luar (OMP) Brucella abortus S-19 dengan Teknik
Western Blotting
Gel dari hasil SDS –PAGE yang mengandung protein yang terpisah berdasarkan
berat molekulnya dilepas dari glass plate dan diletakkan diatas lima kertas Whatmann
yang telah di susun dan dipotong dengan ukuran 10 X 12 cm yang telah dibasahi
dengan Buffer Transblot dan ratakan sehingga tidak ada udara dibawah gel, kemudian
letakkan lima kertas whatmann diatas membrane nitroselulose terlihat ada pitanya
(Band) sebagai dokumen.
Uji antigenitas dengan Indirect ELISA
Prinsip dari teknik Indirect ELISA yaitu mereaksikan antigen sampel dengan
antibody yang dilabel enzim . Kompleks antigen dengan antibody yang dilabel enzim
kemudian dipisahkan dengan antigen dan antibody yang bebas , lalu di inkubasi
dengan substrat kromogenik yang semula tidak berwarna , tetapi kemudian menjadi
berwarna apabila di hidrolisa oleh enzim , intensitas warna yang terbentuk dapat di ukur
dan merupakan parameter untuk antigen yang di uji ( Rantam, 2003).
Antibody poliklonal protein OMP berat molekul spesifik dengan Uji Tantang
Imunisasi protein dengan berat molekul protein OMP spesifik di suntikkan ke hewan
coba kelinci , ambil serum ( antibody anti OMP murni / hasil elusi ).
Disampaikan dalam Kongres Nasional Pertama,
Asosiasi Farmakologi dan Farmasi Veteriner Indonesia, Denpasar 26 Maret 2011
3
POSTER-3
Uji antigenitas dengan teknik indirect ELISA
Uji antigenitas protein OMP dengan berat molekul yang spesifik berat molekul pada
uji ELISA dengan OD tertinggi. Bila terbukti terjadi ikatan antigen antibody dengan
protein OMP berat molekul spesifik , maka berarti protein Outer Membrane Protein
Brucella abortus S-19 mempunyai potensi immunogenic sehingga protein OMP
tersebut dapat dipakai sebagai bahan Kitt Diagnostik / vaksin .
Diskusi
Hasil elektroforesis Outer Membrane Protein Brucella abortus S-19 dengan SDSPage dari analisis karakterisasi protein maka diketahui berat molekul protein membrane
luar (OMP) adalah sebagai berikut : 6,5 kDa; 20,1 kDa; 29,0 kDa; 66,0 kDa; 116,0 kDa;
205,0 kDa .
M
1
2
kDa
205,0
116,0
66,0
29,0
20,1
6,5
Gambar
1.
Profil protein OMP B.abortus S-19 dengan
Page ( M=marker , dan nomer 1,2 = sampel OMP ).
teknik
SDS-
Hasil analisis berdasarkan berat molekulnya pada penelitian ini , maka isolate OMP
B.abortus S-19 dapat dikatagorikan sebagai protein yang mempunyai kemampuan
imunogenik, dan dapat merupakan protein yang imunogen seperti yang dikatakan oleh
Disampaikan dalam Kongres Nasional Pertama,
Asosiasi Farmakologi dan Farmasi Veteriner Indonesia, Denpasar 26 Maret 2011
4
POSTER-3
Cloeckaert,et al (1992) bahwa protein imunogen yang efektif mempunyai berat molekul
( BM) lebih besar dari 10.000 Da.
Kresno, 2000 dan Rantam, 2003 mengatakan bahwa Polycrylamide Gel
Electrophoresis (PAGE) merupakan standard metoda pengujian terhadap berat molekul
protein , struktur subunit dan kemurnian protein . Karena protein merupakan molekul
yang amphoteric dan mengandung kedua grup karboksil negative dan grup amino yang
positif. Semenjak protein dikarakterisasi point isolectric akan bergerak dengan
kecepatan yang berbeda kedaerah elektrik. Selama PAGE protein dipisahkan seperti
migrasi melalui matrik tiga dimensi dengan elektrik , maka matrik mempunyai dua
fungsi yaitu memisahkan protein sesuai dengan ukuran , bentuk dan muatan listrik dan
hal ini memerlukan pH buffer yang sesuai . Polyacrylamiide adalah matrik pilihan untuk
memisahkan protein yang mempunyai range dengan berat molekulnya antara 500250.000 pada SDS-PAGE , protein di elektroforesis dalam ionic detergent sodium
dodecyl sulfate (SDS). Deterjent akan mengikat residu hidropobik dan bagian belakang
peptide dari protein , diperkirakan salah satu dari setiap asam amino,sehingga dapat
membuka rantai peptide secara komplit . Dengan demikian protein SDS-Komplek
migrasi melalui polyacrylamide tergantung dari berat molekul ,protein migrasi dengan
cepat melalui pelarur ion melalui stacking gel kedalam separating gel. Protein
terkonsentrasi pada garis yang tipis dan terlarut pada Band yang tipis , pada metoda
SDS-PAGE setelah diwarnai akan terlihat Band dengan berat molekul yang besar
Menurut Cloeckaert et al., (1992), OMP Brucella abortus dengan berat molekul
protein sebesar 36-38 kDa sensitive untuk mendeteksi hewan yang terinfeksi kuman
brucella .
Hasil karakterisasi Outer Membrane Protein B.abortus S-19 dengan metode Western
Blotting menunjukkan adanya protein yang dikenali oleh antibodinya, yaitu protein
dengan berat molekul sebagai berikut : 13,4 kDa., 14,6 kDa., 37,2 kDa., 61,8 kDa .,
164,1 kDa.
Hasil uji Western Blott dimana terjadi ikatan antara protein antigenic OMP dengan
antibody anti OMP spesifik dan dapat dikembangkan lebih lanjut untuk mencari protein
dengan berat molekul yang lebih spesifik dengan teknik elusi sebagai kitt diagnostic.
Hal ini menurut Cloeckaert et al., (1992), bahwa protein OMP B.abortus S-19 dengan
protein yang berat molekulnya 36- 38 kDa sensitive untuk mendeteksi hewan yang
terinfeksi kuman brucella. Menurut Rantam (2003), mengatakan bahwa pada umumnya
protein yang tidak dimurnikan mengandung banyak protein yag berbeda dan tidak
spesifik . Untuk itu dalam mengukur single protein spesifik diperlukan uji biokimia.
Metode Western-Blotting digunakan untuk mendeteksi berat molekul protein dari
campuran antigen dan digunakan untuk membedakan kros reaksi diantara protein.
Pada tahap sebelumnya dilakukan pemisahan protein dengan SDS-Page, kemudian
ditransfer ke membrane nitroselulose yang sesuai dan akhirnya di label dengan
antibody dan di visualisasikan dengan pewarnaan . Fraksi-fraksi protein yang telah
dipisahkan satu sama lain dengan probe antibody yang sesuai. Protein yang diikat
pada membrane dapat mempertahankan antigenitasnya dengan muda direaksikan
dengan antibody.Adanya pita tertentu pada blott menubjukkan antigen spesifik dalam
sample atau antibody pada probe. Setelah dilakukan pengukuran nilai OD pada uji
indirect ELISA terhadap antibody protein OMP dapat dilihat pada Table 1 dibawah ini :
Disampaikan dalam Kongres Nasional Pertama,
Asosiasi Farmakologi dan Farmasi Veteriner Indonesia, Denpasar 26 Maret 2011
5
POSTER-3
Tabel 1. Hasil OD dengan teknik indirect ELISA protein OMP berbagai berat molekul
Hal
Sampel OMP
Nilai OD
Hasil OD dengan teknik indrect ELISA protein OMP berbagai berat molekul
13,4 kDa
14,6 kDa
37,2 kDa
61,8 kDa
164,1 kDa
0,325
0,586
0,975
0,643
0,598
Kesimpulan
Protein spesifik OMP yang mempunyai sifat imunogenik, setelah uji indirect ELISA
maka OD tertinggi adalah protein OMP dengan berat molekul 37,2 kDa ( OD =0,975 ).
Protein OMP dengan berat molekul 37,2 kDa setelah diimunisasikan pada kelinci(Uji
tantang), dengan indirect ELISA OD = 0,968 sehingga mempunyai sifat imunogenik
dapat di gunakan sebagai Kitt diagnostic. Hasil penelitian direkomendasikan bahwa
Protein OMP dengan berat molekul 37,2 kDa selain dapat digunakan sebagai bahan
Kitt Diagnostic dapat pula disarankan sebahai bahan pembuatan bahan vaksin yang
poten.
Ucapan Terima kasih.
Terima kasih kami sampaikan kepada Direktorat Jenderal Perguruan Tinggi, Rektor
Universitas Airlangga melalui Ketua Lembaga Penelitian dan Pengabdian kepada
Masyarakat yang telah menyetujui untuk mendanai penelitian kami ini
Daftar pustaka
Alton,G.G., L.M.Jones and D.E.Pietiz. 1988. Laboratory Techniques in Brucellosis 3 rd
Ed.WHO.Switzerland.
Bellanti,J.A. 1993. Immunologi III. Diterjemahkan oleh Prof.Dr.A.Samik Wahab. Gajah
Mada University Press. Yogyakareta .Hal.86-95, 173-188.
Cloeckaert,A., P.Kerhofs and J.N.Limet.1992. Antibody Response to Brucella Outer
Membrane Proteins in Bovine Brucellosis: Immunoblot Analysis and Competitiv
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Using Monoclonal Antibodies. Journal of
Clinical Microbiology Dec. 1992. pp. 3168-3174.
Kresno,S.B. 2000. Immunologi. Diagnosis dan Prosedur Laboratorium, Edisi ke tiga.
Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia. Jakarta.
Rantam,F.A. 2003. Metode Immunologi. Airlangga University Press. Surabaya.
Disampaikan dalam Kongres Nasional Pertama,
Asosiasi Farmakologi dan Farmasi Veteriner Indonesia, Denpasar 26 Maret 2011
6
POSTER-3
Ratnasari,R., J.Rahmahani., T.Juniastutik dan Suwarno. 2004. Isolasi dan Karakterisasi
lipopolisaccharida Brucella abortus S-19. Guna Pembuatan Antigen Dianostik untuk
aplikasi Teknik ELISA. Laporan Penelitian Fakultas Kedokteran Hewan Universitas
Airlangga. Surabaya.
Widjajanto,E. 2004. Mast cell Induced Apoptosis of Limphoid Cells, Proposed
Mechanism of
Hemopoietic Stem Cells Depletion in Hypocelluler Marrow. Th 8th
International Conggress of Asian Society of Clinical Pathology and Laboratory
Medicine (ASCPLM). In Joint Meeting with The 1st Off-Shore Scientific Meeting of the
College of Pathologist,Academy of Medicine Malaysia (Cpath-Amm) and
the 5th
National Conggress of the Indonesian Association of Clinical Pathologist
(PDSPatklin).Selects Conventional Hall,Medan-Indonesia, November 29-December
02,2004.
Widjajanto, E, 2007. Mast Cell, Fakta dan Potensinya Dalam Perspektif Laboratory
Medicine.Disampaikan pada Saat Rapat Terbuka Senat Universitas Brawidjaja
Malang, 2 April 2007.
Disampaikan dalam Kongres Nasional Pertama,
Asosiasi Farmakologi dan Farmasi Veteriner Indonesia, Denpasar 26 Maret 2011
7