Perbandingan Beberapa Metode Molekuler dalam Uji

HASIL PENELITIAN
Gambaran morfologi sel epitel kelenjar
prostat
Terlihat perubahan morfologi terutama pada
pemberian dosis 600 mg/kg BB: sel epitel menjadi berbentuk kuboid sampai pipih, permukaan sel rata, dengan inti oval atau bulat.
Sel epitel tidak sampai berubah menjadi bentuk
skuamosa; inti sel juga tidak sampai rusak
atau hilang. Pada perlakuan dengan akuades
(sebagai kontrol), terlihat sel epitelnya berbentuk kolumner berwarna merah, permukaan
sel rata, dengan inti bulat di tengah.
Sterol adalah zat aktif yang terkandung
dalam buah pare. Zat ini dianggap dapat mempengaruhi metabolisme hormonal sehingga
berpengaruh juga pada kelenjar prostat, yakni
menyebabkan pengurangan berat dan ketebalan sel epitel kelenjar prostat.
PEMBAHASAN
Pembesaran kelenjar prostat jinak merupakan
pembesaran pada jaringan fibromuskular dan
struktur epitel kelenjar prostat; dapat bersifat
lambat sampai progresif. Penelitian ini belum
memperlihatkan gambaran yang mirip dengan
gambaran histopatologik pembesaran kelenjar
prostat jinak seperti yang diharapkan. Sel epitel
hanya terlihat hipertrofik. Keadaan tersebut
dapat terjadi karena induksi testosteron
propionat hanya diberikan selama 14 hari.
DAFTAR PUSTAKA
Pemberian ekstrak etanol daging buah pare
menyebabkan penurunan berat kelenjar prostat
tikus putih dibandingkan dengan pemberian
akuades. Hal tersebut sejalan dengan penelitian Naseem, dkk. (1998), yang menyimpulkan
bahwa ekstrak buah dan biji pare mempunyai efek androgenik dilihat dari pengaruhnya terhadap penurunan berat epididimis,
vesika seminalis, muskulus levator ani, dan
kelenjar prostat.
SIMPULAN
1. Ekstrak etanol buah pare (Momordica charantia) 70% dalam dosis 600 mg/kg BB dapat
menurunkan berat kelenjar prostat tikus yang
diinduksi dengan testosteron propionat.
2. Ekstrak etanol buah pare 70% dalam dosis
300 mg dan 600 mg/kg BB dapat mempengaruhi ketebalan sel epitel kelenjar
prostat tikus yang diinduksi dengan testosteron propionat. Sel epitel menjadi berbentuk kuboid sampai pipih, permukaan
sel rata, dengan inti oval atau bulat. Sel epitel
tidak sampai berubah menjadi bentuk skuamosa; inti sel juga tidak sampai rusak atau
hilang.
Perbandingan Beberapa Metode Molekuler dalam
Uji DNA HPV (Human Papillomavirus)
Sinta Sasika Novel1, Ratu Safitri1, Sri Hartini Harijanto2, Sukma Nuswantara3
1Jurusan
Biologi, FMIPA Universitas Padjadjaran, Jatinangor, 2Rumah Sakit Kanker Dharmais Slipi Jakarta Barat,
3Lembaga
Ilmu Pengetahuan Indonesia, Bogor
ABSTRAK
1. Achmadi IA. Pengobatan pembesaran prostat jinak dengan pemanasan. Simposium Penatalaksanaan Pembesaran
Prostat Jinak. Jakarta. 1993.
2. Cameron SA. Benign prostatic hypertrophy. Med Progr 1996.
3. Mardisiswojo S, Rajakmangunsudarso H. Cabe puyang warisan nenek moyang. Jakarta: Balai Pustaka. 1987.
4. Dixit VP, Khana P, Bhargava SK. Effect of Momordica charantia L. fruit extract on the testiscular function of dog. J
Med. Plants Res 1978; 34: 280.
5. Lilis Hastuti W. Pengaruh pemberian ekstrak etanol buah pare (Momordica charantia L.) terhadap perubahan kadar
insulin dalam serum darah kelinci jantan dengan toleransi glukosa. Skripsi. FF. UBAYA. Surabaya. 1996.
6. Bambang Prayogo W. Penelitian pendahuluan pengaruh perasan buah pare (Momordica charantia L.) pada spermato
genesis tikus. Skripsi. FF. Unair Surabaya. 1983.
7. Okabe H, et al. Studies on the constituents of Momordica charantia L. isolation and characterization of momordicaside
A and B, glycosides of a pentahydroxy cucurbitane triterpen. Chem Pharm Bull 1980; 28: 2753.
8. Claflin AJ, Vesely DL, Hudson JL. Inhibition of growth and guanylate cylase activity of an undifferentiated prostate adenocarcinoma by an extract of the balsam pear (Momordica charantia L.). Proc Natl Acad Sci USA 1978; 75(2): 989-93.
9. Winarno WM. Pengaruh pemberian infus daging buah pare (Momordica charantia L.) terhadap kelenjar prostat tikus
putih. Laporan Penelitian 1999-2000. Puslitbang Farmasi, Badan Litbangkes. Depkes RI. Jakarta. 2000.
10. Departemen Kesehatan RI. Farmakope Indonesia II. 1984.
11. Ham AW, David HC. Histology. 8th ed. JB. Lippincott Co. USA. 1979.
12. Materia Medika Indonesia III. Departemen Kesehatan RI. 1979.
13. Naseem MZ, Patill SR, Ravindra. Antispermatogenic and androgenic activities of Momordica charantia (Karela) in albino
rats. J Ethopharmacol 1998; 6(1): 9-16.
14. Wuryantari. Pengaruh ekstrak buah pare (Momordica charantia L.) terhadap kadar testosteron darah dan fertilitas
mencit (Mus musculus) jantan. Skripsi Mahasiswa UNAIR. 1990.
15. Ganong WF. Buku Ajar Fisiologi Kedokteran (Terjemahan). Edisi 14. Penerbit Buku Kedokteran EGC. Jakarta. 1995.
Pemberian ekstrak etanol daging buah pare
menyebabkan sel epitel kelenjar prostat terlihat lebih tipis dibandingkan dengan pemberian akuades. Pengurangan ketebalan sel
epitel kelenjar prostat terlihat sangat bermakna pada dosis 600 mg/kg BB. Wuryantari
(1990) menyatakan bahwa ekstrak buah pare
dapat menurunkan kadar testosteron darah.
Hal tersebut sesuai dengan teori perubahan
metabolisme hormon androgen, yaitu penurunan testosteron akan menurunkan kadar
5α-dihidroreduktase. Penurunan ini akan menurunkan kadar DHT (dihidrotestosteron)
dalam kelenjar prostat. Penurunan kadar
DHT ini akan menghambat pertumbuhan sel
epitel kelenjar prostat, sehingga akan mengurangi ketebalan sel epitel dan berat
kelenjar prostat.15
C DK 1 8 6 / Vo l . 38 no. 5/Jul i -A g us tus 2011
T EK N I K
Uji DNA HPV telah dipakai sebagai uji tambahan paling efektif cara mendeteksi keberadaan HPV sedini mungkin. Uji DNA HPV
dapat mengetahui golongan hr-HPV atau lr-HPV dengan menggunakan teknik HC II atau dengan metode PCR, uji DNA HPV juga
dapat melihat genotipe HPV dengan metode DNA-HPV Micro Array System, Multiplex HPV Genotyping Kit, dan Linear Array HPV
Genotyping Test.
Metode PCR dan Elektroforesis
PCR (Polymerase Chain Reaction) atau reaksi
berantai polimerase adalah suatu metode enzimatis untuk memperbanyak secara eksponensial suatu sekuen nukleotida tertentu secara
invitro[1]. PCR pertama kali dikembangkan oleh
Kary Mullis pada tahun 1985 seorang peneliti
dari CETUS Corporation[2]. PCR dapat melipat
memperbanyak molekul DNA dan memisahkan gen-gen; kelebihan metode ini adalah
suhu yang dapat tinggi dan rendah dengan
cepat selain itu PCR juga bekerja dengan
komponen yang jumlahnya sedikit[1].
Pada tahun 1990 Ting dan Manos telah mengembangkan suatu metode deteksi HPV
dengan PCR[3]. Metode tersebut dikembangkan
dengan mengidentifikasi suatu daerah homologi di dalam genotipe HPV yang kemudian digunakan sebagai dasar untuk mendesain
primer untuk amplifikasi[1]. Daerah homologi
tersebut panjangnya 20-25 pasangan basa
dan diketahui setelah dilakukan perbandingan
urutan nukleotida HPV-6, HPV-11, HPV-16,
HPV18, dan HPV-33 terutama pada daerah
ORF E1 dan L1[1,3]
Gambar 1. Alat PCR (Polymerase Chain Reaction)[2]
355
356
Prinsip kerja PCR dan elektroforesis yaitu (1)
isolasi DNA sampel dari bahan klinis atau dari
jaringan yang disimpan pada paraffin[4], (2)
proses amplifikasi DNA yang telah diisolasi;
proses amplifikasi sendiri terbagi tiga tahapan
yaitu denaturasi, annealing, dan elongasi.
Tahapan denaturasi terjadi pada suhu 970C[1].
Pada proses ini terjadi denaturasi linearisasi
DNA[5]. Tahap kedua adalah penempelan
primer atau annealing pada DNA target yang
akan diperbanyak, membutuhkan suhu sekitar
550C[6]. Tahap ketiga adalah elongasi (polimerisasi) membutuhkan suhu 720C agar siklus
polimerisasi lebih optimal[7], (3) hasil amplifikasi dideteksi menggunakan alat elektroforesis pada gel agarosa[1]; teknik elektroforesis adalah teknik yang memisahkan
molekul-molekul bentuk, muatan netto, dan
berat molekulnya dalam sebuah medan listrik
pada medium padat atau semipadat[5,7].
Metode PCR dan elektroforesis hanya digunakan untuk mendeteksi ada atau tidaknya
DNA HPV di dalam sel epitel yang dicurigai terinfeksi HPV[6]; sulit untuk menentukan genotipe HPV yang menginfeksi[4]. Proses genotyping dengan metode PCR dan elektroforesis
memerlukan waktu yang cukup lama, karena
hanya menggunakan satu kontrol positif untuk
satu genotipe HPV saja[5,7]; umumnya HPV-16
atau HPV-18 [1]. Pada gambar 2 dapat dilihat
nomor 1 sd.11, nomor 1 dan 2 merupakan
kontrol negatif dan kontrol positif genotipe
HPV-16. Nomor 3-11 adalah sampel-sampel
yang positif terinfeksi; ke-9 sampel menunjukkan sinyal yang sama dengan nomor 2,
menunjukkan bahwa ke-9 sampel tersebut
positif terinfeksi HPV, namun tidak cukup
untuk menentukan genotipe HPV dalam
setiap sampelnya[4,8].
Gambar 2. Hasil amplifikasi yang dideteksi menggunakan PCR pada pemeriksaan infeksi HPV[2,4]
Metode Hybrid Capture System (HC-II)
Hybrid Capture System (HC-II) adalah metode
pemeriksaan hibridisasi dengan teknologi terbaru di bidang biologi molekuler[2]. Teknik
HC-II memeriksa pada kondisi lebih awal yaitu
kemungkinan seseorang terinfeksi HPV sebelum virus tersebut membuat perubahan
pada serviks yang akhirnya dapat mengakibatkan terjadinya kanker serviks[9]. HC-II telah diakui dunia serta disahkan oleh FDA (Food
and Drug Administration) Amerika Serikat[10].
HC-II memiliki keakuratan yang tinggi dalam
mendeteksi infeksi HPV karena mampu mendeteksi keberadaan DNA HPV dalam jumlah
yang sangat kecil[9].
C D K 1 8 6 / V o l . 3 8 n o . 5 / J u l i- Ag u s t u s 2 0 1 1
TEKNIK
Teknik HC-II adalah antibody capture/solution
hybridization/signal amplication assay[9,10]
yang memakai deteksi kualitatif chemiluminescence terhadap DNA HPV; secara umum
HC-II ialah teknik berbasis DNA-RNA yang
dapat mendeteksi secara akurat dan cepat
dengan sensitivitas 98% dan spesifisitas HC-II
98%[10]
Prinsip kerja HC-II yaitu (1) menghancurkan
protein kapsid virus HPV dalam sampel yang
telah dimasukkan ke dalam botol sampel yang
telah disediakan[4], (2) Setelah kapsid dirusak,
tahap berikutnya adalah mendenaturasi DNA
untai ganda menjadi untai tunggal dengan
menambahkan larutan denaturasi[2]. Denaturasi
merupakan langkah awal prosedur untuk
mengeluarkan DNA (release DNA) target dari
sel[2], (3) hibridisasi antara DNA virus dengan
probe RNA menghasilkan DNA-RNA hybrid
yang ditangkap oleh antibodi yang kemudian akan bereaksi dengan antibodi kedua[4].
Antibodi kedua ini bertindak sebagai sinyal
amplifikasi; makin banyak hibrid DNA-RNA
yang tertangkap pada dinding capture plate
maka makin banyak pula antibodi kedua
yang dapat mengenali hibrid DNA-RNA[9],
(4) Kuantitas antibodi yang terikat pada hibrid
DNA-RNA diukur dengan menambahkan zat
chemiluminescent sehingga menghasilkan
sinyal chemiluminescent, (5) sinyal ini akan ditangkap oleh alat luminometer yang dihubungkan dengan komputer. Gambar 3 menunjukkan visualisasi prinsip kerja HC-II[10].
Gambar 3. Prinsip kerja HC-II (1) DNA yang sudah
terdenaturasi, (2) hibridisasi DNA Virus dengan
probe RNA, (3) hibrid DNA-RNA berikatan antibodi
spesifik, (4) ikatan antibodi dengan hibrid DNA-RNA
akan bereaksi dengan alkaline phosphatase, (5) reaksi
ini menghasilkan sinyal chemiluminescent, (6) sinyal
amplifikasi dalam bentuk emisi cahaya, diukur Luminometer, (7) pengukuran tersebut tersambung dengan
perangkat komputer menghasilkan nilai RLU (Relative
Light Unit)[2]
Penentuan nilai positif uji DNA HPV didasarkan pada perbandingan sampel dengan ratarata RLU/PV; jika perbandingan RLU/PC (relative
light unit/posirif kontrol) melebihi nilai ambang
C DK 1 8 6 / Vo l. 38 no. 5/Jul i -A g us tus 2011
positif maka spesimen dinyatakan positif
terhadap tes DNA HPV[9]. Penentuan konsentrasi ambang DNA HPV yang akan berpeluang terbentuknya kanker leher rahim adalah
sangat penting. Digene menetapkan nilai
ambang positif sebesar 1.0 RLU/PC[2,4,9].
Bila dibandingkan dengan PCR, HC-II memiliki
ketepatan 92-94% terhadap teknik pemeriksaan sitologi/histologi, waktu yang lebih
singkat, tidak terdapat atau hanya sedikit
kontaminasi, dan disertai dengan probe[2].
Probe A untuk melacak DNA lr-HPV seperti
HPV-6, HPV-11, HPV-42, HPV-43, dan HPV-44,
sedangkan probe B untuk melacak 13 tipe
DNA hr-HPV yaitu HPV-16, HPV-18, HPV-31,
HPV-33, HPV-35, HPV-39, HPV-45, HPV-51,
HPV-52, HPV-56, HPV-58, HPV-59, dan
HPV-68[10]. Namun HC-II tidak dapat digunakan untuk menentukan genotipe HPV karena
tes ini hanya memperkirakan kuantitatif jumlah
virus tanpa mengetahui genotipe HPV-nya[4,9,10].
Metode Multiplex HPV Genotyping Kit
Metode Multiplex HPV Genotyping Kit adalah
metode yang digunakan untuk mengetahui
genotipe HPV[4]. Multiplex HPV Genotyping
Kit dapat medeteksi 24 genotipe HPV :
HPV-6, HPV-11, HPV-16, HPV-18, HPV-26,
HPV-31, HPV-33, HPV-35, HPV-39, HPV-42,
HPV-43, HPV-44, HPV-45, HPV-51, HPV-52,
HPV-53, HPV-56, HPV-58, HPV-59, HPV-66,
HPV-68, HPV-70, HPV-73, dan HPV-82[4,11].
Prinsip kerja Multiplex HPV Genotyping Kit :
(1) ekstraksi sel untuk mengisolasi DNA, (2)
DNA yang telah diisolasi kemudian di amplifikasi menggunakan PCR yang telah diberi
label biotin pada primer sehingga DNA yang
diperbanyakpun akan terlabel biotin. Biotin
penting dalam proses deteksi hasil hibridisasi.
Primer akan mengamplifikasi DNA β-globin
manusia dan DNA ke-24 HPV, (3) hasil amplifikasi dihibridisasi menggunakan probe spesifik
dari ke-24 genotipe HPV; pada proses hibridisasi ini diperlukan sejumlah DNA untai
tunggal; untuk mendenaturasi DNA untai
ganda menjadi DNA untai tunggal pada
metode ini menggunakan suhu tinggi
sehingga DNA akan terdenaturasi, (4) kemudian proses deteksi menggunakan Luminex
analyzer : produk PCR akan terdeteminasi oleh
Phycoerythrin fluorescens[4,11].
T EK N I K
Metode DNA-HPV Micro Array
Metode DNA-HPV Micro Array adalah metode
yang digunakan untuk mengetahui genotipe
HPV[4]. DNA-HPV Micro Array dapat mendeteksi 24 genotipe HPV : HPV-6, HPV-11,
HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33, HPV-34,
HPV-35, HPV-39, HPV-40, HPV-42, HPV-43,
HPV-44, HPV-45, HPV-51, HPV-52, HPV-53,
HPV-54, HPV-56, HPV-58, HPV-59, HPV-66,
HPV-68, dan HPV-70[12].
Prinsip kerja DNA-HPV Micro Array : (1) ekstraksi sel untuk mengisolasi DNA, (2) DNA
yang telah diisolasi kemudian diamplifikasi
menggunakan PCR, (3) hasil amplifikasi dihibridisasi menggunakan probe spesifik dari
ke-24 genotipe HPV; proses hibridisasi ini
memerlukan sejumlah DNA untai tunggal,
(4) kemudian proses deteksi sehingga akan
terlihat genotipe-genotipe HPV pada sampel
yang diperiksa[4,12]. (gambar 4).
Gambar 4. Hasil deteksi genotipe HPV[12]
Linear Array HPV Genotyping Test
Metode ini sudah digunakan pada banyak
penelitian mengenai HPV[13]; di RS Kanker
Dharmais digunakan untuk diagnosis infeksi
HPV penyebab kanker serviks dan kutil[4]. Teknik
ini adalah salah satu teknik terbaru di dunia
molekuler untuk mendeteksi HPV[13]. Kelebihan
teknik ini adalah dapat diketahuinya tipe
HPV yang menginfeksi, apakah tipe lr-HPV
atau hr-HPV yang dapat menyebabkan kaker
serviks. Linear Array HPV Genotyping Test
mampu mendeteksi 37 genotipe HPV baik
hr-HPV maupun lr-HPV secara bersamaan[13,14].
Ke-37 genotipe HPV yaitu HPV-6, HPV-11,
HPV-16, HPV-18, HPV-26, HPV-31, HPV-33,
HPV-35, HPV-39, HPV-40, HPV-42, HPV-45,
HPV-51, HPV-52, HPV-53, HPV-54, HPV-55,
HPV-56, HPV-58, HPV-59, HPV-61, HPV-62,
HPV-64, HPV-66, HPV-67, HPV-68, HPV-69,
HPV-70, HPV-71, HPV-72, HPV-73, HPV-81,
HPV-82, HPV-83, HPV-84, HPV-IS39, dan
HPV-CP6108[13].
357
Hibridisasi asam nukleat mempunyai dua unsur
utama yaitu DNA target dan pelacak. DNA
target yaitu DNA yang telah terdenaturasi.
Pelacak yang digunakan memiliki urutan
spesifik untuk 37 genotipe HPV[4].
(1)
(3)
(2)
(4)
Gambar 5. Perangkat diagnostik Linear Array HPV
Genotyping Test (1) PCR N9700, (2) reagen, (3) typing
tray, dan (4) Linear Array HPV Genotyping Strip[4].
Prinsip kerja Linear Array HPV Genotyping
Test terbagi menjadi empat tahapan[14]. Tahap
pertama ekstrasi DNA dari sampel menggunakan Amplilute Liquid Media Extration
Kit, ekstraksi dimulai dengan melisis jaringan
menggunakan buffer ATL, merusak protein
dengan Proteinase K, merusak RNA dengan
RNase sehingga akan diperoleh DNA yang
diinginkan[4,13].
Tahap kedua yaitu amplifikasi DNA menggunakan PCR TC9700[4]. Prinsip dasar PCR pada
metode Linear Array HPV Genotyping Test
adalah enzim AmpliTaq Glod DNA polymerase memperbanyak sekuen spesifik yang dimulai dengan pelekatan primer dan menyatukan dNTP-dNTP yang berlangsung dalam
reaksi termal[13,14]. Proses pra-denaturasi dan
denaturasi DNA membutuhkan suhu 950C,
penempelan atau annealing membutuhkan
suhu 550C. Suhu 550C adalah suhu hasil
optimasi agar primer tidak salah menempel
(mispriming)[1]. Proses elongasi membutuhkan
waktu 1 menit dan suhu 720 C, hal tersebut
sesuai dengan teori bahwa untai DNA tunggal
yang disintesis oleh Taq polimerase membutuhkan suhu 720C[5,7].
Tahap ke tiga yaitu hibridisasi DNA; pada
proses ini diperlukan sejumlah DNA untai
tunggal sehingga DNA hasil amplifikasi harus
didenaturasi menjadi DNA untai tunggal[13,17].
Salah satu perlakuan untuk memecah ikatan
hidrogen antar basa nitrogen adalah dengan
penambahan senyawa alkali seperti NaOH
yang terdapat pada larutan pendenaturasi[18].
358
Gambar 6. Mekanisme hibridisasi dan deteksi pada
metode LA HPV GT (a) membran nilon pada strip (b)
pelacak yang berada di atas membrane (c) DNA hasil
amplifikasi (d) larutan hibridisasi (e) DNA yang sudah
terlabel biotin (f) biotin label non radioaktif (g) streptavidan yang berikatan dengan biotin dan horseradish
-peroxidase (h) H2O2 dan TMB[4]
Pada tahap ke empat, prinsipnya DNA akan
berikatan dengan pelacak yang menempel
pada membran nilon bermuatan[17]. DNA sudah
diberi label biotin sehingga ikatan antara
pelacak dan DNA akan terdeteksi dan menghasilkan sinyal[5]. Sinyal tersebut akan ditangkap
oleh streptavidin-horseradish peroxidase menandakan bahwa ikatan pelacak dan DNA
berhasil[4]. Streptavidin-horseradish peroxidase
akan berikatan dengan H2O2 dan TMB (Tetramethylbenzine)[13]. Ikatan ini akan menghasilkan
warna biru pada membran nilon yang menunjukkan genotipe HPV[17]. Hasil deteksi akan
terlihat berwarna biru di atas Linear Array HPV
Genotyping Strip yang akan menunjukkan
genotipe HPV sampel[4].
Gambar 7. Hasil deteksi LA HPV Genotyping Test (1)
β-globin high, β-globin low, HPV-16, HPV-42 (2)
β-globin high, β-globin low, HPV-11, HPV-61,
HPV-68[4]
SIMPULAN
1. Metode PCR dan elektroforesis dapat
mengetahui keberadaan HPV tanpa mengetahui genotipe secara spesifik.
2. Metode Hybrid Capture II System digunakan untuk mengetahui keberadaan HPV
dengan memperkirakan kuantitas/jumlah
virus tanpa mengetahui genotipe HPV-nya.
3. Metode Multiplex HPV Genotyping Kit digunakan untuk mendeteksi 24 genotipe
HPV.
4. Metode DNA-HPV Micro Array digunakan
untuk mendeteksi 24 genotipe HPV.
5. Metode Linear Array HPV Genotyping Test
digunakan untuk mendeteksi 37 genotipe
HPV.
DAFTAR PUSTAKA
1. Yuwono T. Teori dan Aplikasi PCR. Yogyakarta: Penerbit
Andi, 2006.
2. Nuswantara S. Seminar Deteksi Dini dan Penanganan
Terkini Kanker Leher Rahim: Deteksi Human Papilloma Virus
Dalam Pencegahan Dini Kanker Leher Rahim. Bandung:
Santosa Bandung International Hospital, 2008.
3. Lörincz AT, Reid R, Jenson AB, Greenburg MD, Lancaster W,
Kurman RJ. Human Papillomavirus Infection of The Cervix:
Relative Risk Associations of 15 Common Anogenital Types.
Obstetr. Gynecol. 1998; 79: 328-37.
4. Novel SS, Safitri R, Nuswantara S. Analisis Distribusi G e n o tipe HPV Dengan Metode Linear Array HPV Genotyping Test.
Bandung: Biologi FMIPA-UNPAD, 2009.
5. Bartlett JMS, Stirling J. PCR Protocols. Totowa: Human Press,
1999.
6. Nuswantara S. Dasar-dasar Molekuler. Bandung: Laboratorium Bioteknologi Sandia Biotech Diagnostic Centre,
Santosa Bandung International Hospital, 2007.
7. Brown TA. Essential Molecular Biology. Inggris: Oxford Univ
Press., 1995.
8. Wolfe SL. An Introduction to Cell and Molecular Biology.
Belmont: Wadsworth Publ. Co. 1995.
9. Novel SS, Safitri R, Nuswantara S. Aplikasi Hybrid Capture
II System dalam Deteksi Dini Kanker Serviks. CDK 2009;
36(1): 24-6.
10. Castle PE, Lorincz AT, Lohnas IM. Result of Human Papillomavirus DNA Testing with the Hybrid Capture II Assay are
Reproducible. Clin. Microbiol. 2002; 40: 1088-90.
11. Monk BJ, Tewari KS. The Spectrum and Clinical Sequelae
of Human Papillomavirus Infection. Gynecol. Oncol.2008;
107: 6-13.
12. Zhao Y, Lin H, Shen D, Xuan Y, Lin Z. Distribution of HPV
Genotypes in Uterine Cervical Lesions in Yanbian, Northern
China. Pathol. Internat. 2008; 58: 643-7.
13. van Hamont D, van Ham MAPC, Bakkers JMJ., Massuger
LFAG, Melchers WJG. Evaluation of The SPF10-INNO LiPA
Human Papillomavirus (HPV) Genotyping Test an the Roche
Linear Array HPV Genotyping Test. Clin. Microbiol. 2006;
44(9): 3122-9.
14. van Doorn LJ, Quint W, Kleter B, Olivera HS. Genotyping of
Human Papillomavirus in Liquid Cytology Cervical Specimens by the PGMY Line Blot Assay and the SPF10 Line
Probe Assay. Clin. Microbiol. 2002; 40(3): 979-83.
15. Verteramo R, Pierangeli A, Mancini E. Human Papillomaviruses and Genital Co-infections in Gynaecological
Outpatients. BMC Infect. Dis. 2009; 9(16): 1-7
16. Syrjanen KJ. HPV Infections and Oesophageal Cancer.
J. Clin. Pathol. 2002; 55(10): 721-8.
17. Sudjadi. Bioteknologi Kesehatan. Yogyakarta: Kanisius,
2008.
18. Yuwono T. Biologi Molekuler. Jakarta: Erlangga, 2005.
C D K 1 8 6 / V o l . 3 8 n o . 5 / J u l i- Ag u s t u s 2 0 1 1
TEKNIK
Teknik HC-II adalah antibody capture/solution
hybridization/signal amplication assay[9,10]
yang memakai deteksi kualitatif chemiluminescence terhadap DNA HPV; secara umum
HC-II ialah teknik berbasis DNA-RNA yang
dapat mendeteksi secara akurat dan cepat
dengan sensitivitas 98% dan spesifisitas HC-II
98%[10]
Prinsip kerja HC-II yaitu (1) menghancurkan
protein kapsid virus HPV dalam sampel yang
telah dimasukkan ke dalam botol sampel yang
telah disediakan[4], (2) Setelah kapsid dirusak,
tahap berikutnya adalah mendenaturasi DNA
untai ganda menjadi untai tunggal dengan
menambahkan larutan denaturasi[2]. Denaturasi
merupakan langkah awal prosedur untuk
mengeluarkan DNA (release DNA) target dari
sel[2], (3) hibridisasi antara DNA virus dengan
probe RNA menghasilkan DNA-RNA hybrid
yang ditangkap oleh antibodi yang kemudian akan bereaksi dengan antibodi kedua[4].
Antibodi kedua ini bertindak sebagai sinyal
amplifikasi; makin banyak hibrid DNA-RNA
yang tertangkap pada dinding capture plate
maka makin banyak pula antibodi kedua
yang dapat mengenali hibrid DNA-RNA[9],
(4) Kuantitas antibodi yang terikat pada hibrid
DNA-RNA diukur dengan menambahkan zat
chemiluminescent sehingga menghasilkan
sinyal chemiluminescent, (5) sinyal ini akan ditangkap oleh alat luminometer yang dihubungkan dengan komputer. Gambar 3 menunjukkan visualisasi prinsip kerja HC-II[10].
Gambar 3. Prinsip kerja HC-II (1) DNA yang sudah
terdenaturasi, (2) hibridisasi DNA Virus dengan
probe RNA, (3) hibrid DNA-RNA berikatan antibodi
spesifik, (4) ikatan antibodi dengan hibrid DNA-RNA
akan bereaksi dengan alkaline phosphatase, (5) reaksi
ini menghasilkan sinyal chemiluminescent, (6) sinyal
amplifikasi dalam bentuk emisi cahaya, diukur Luminometer, (7) pengukuran tersebut tersambung dengan
perangkat komputer menghasilkan nilai RLU (Relative
Light Unit)[2]
Penentuan nilai positif uji DNA HPV didasarkan pada perbandingan sampel dengan ratarata RLU/PV; jika perbandingan RLU/PC (relative
light unit/posirif kontrol) melebihi nilai ambang
C DK 1 8 6 / Vo l. 38 no. 5/Jul i -A g us tus 2011
positif maka spesimen dinyatakan positif
terhadap tes DNA HPV[9]. Penentuan konsentrasi ambang DNA HPV yang akan berpeluang terbentuknya kanker leher rahim adalah
sangat penting. Digene menetapkan nilai
ambang positif sebesar 1.0 RLU/PC[2,4,9].
Bila dibandingkan dengan PCR, HC-II memiliki
ketepatan 92-94% terhadap teknik pemeriksaan sitologi/histologi, waktu yang lebih
singkat, tidak terdapat atau hanya sedikit
kontaminasi, dan disertai dengan probe[2].
Probe A untuk melacak DNA lr-HPV seperti
HPV-6, HPV-11, HPV-42, HPV-43, dan HPV-44,
sedangkan probe B untuk melacak 13 tipe
DNA hr-HPV yaitu HPV-16, HPV-18, HPV-31,
HPV-33, HPV-35, HPV-39, HPV-45, HPV-51,
HPV-52, HPV-56, HPV-58, HPV-59, dan
HPV-68[10]. Namun HC-II tidak dapat digunakan untuk menentukan genotipe HPV karena
tes ini hanya memperkirakan kuantitatif jumlah
virus tanpa mengetahui genotipe HPV-nya[4,9,10].
Metode Multiplex HPV Genotyping Kit
Metode Multiplex HPV Genotyping Kit adalah
metode yang digunakan untuk mengetahui
genotipe HPV[4]. Multiplex HPV Genotyping
Kit dapat medeteksi 24 genotipe HPV :
HPV-6, HPV-11, HPV-16, HPV-18, HPV-26,
HPV-31, HPV-33, HPV-35, HPV-39, HPV-42,
HPV-43, HPV-44, HPV-45, HPV-51, HPV-52,
HPV-53, HPV-56, HPV-58, HPV-59, HPV-66,
HPV-68, HPV-70, HPV-73, dan HPV-82[4,11].
Prinsip kerja Multiplex HPV Genotyping Kit :
(1) ekstraksi sel untuk mengisolasi DNA, (2)
DNA yang telah diisolasi kemudian di amplifikasi menggunakan PCR yang telah diberi
label biotin pada primer sehingga DNA yang
diperbanyakpun akan terlabel biotin. Biotin
penting dalam proses deteksi hasil hibridisasi.
Primer akan mengamplifikasi DNA β-globin
manusia dan DNA ke-24 HPV, (3) hasil amplifikasi dihibridisasi menggunakan probe spesifik
dari ke-24 genotipe HPV; pada proses hibridisasi ini diperlukan sejumlah DNA untai
tunggal; untuk mendenaturasi DNA untai
ganda menjadi DNA untai tunggal pada
metode ini menggunakan suhu tinggi
sehingga DNA akan terdenaturasi, (4) kemudian proses deteksi menggunakan Luminex
analyzer : produk PCR akan terdeteminasi oleh
Phycoerythrin fluorescens[4,11].
T EK N I K
Metode DNA-HPV Micro Array
Metode DNA-HPV Micro Array adalah metode
yang digunakan untuk mengetahui genotipe
HPV[4]. DNA-HPV Micro Array dapat mendeteksi 24 genotipe HPV : HPV-6, HPV-11,
HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33, HPV-34,
HPV-35, HPV-39, HPV-40, HPV-42, HPV-43,
HPV-44, HPV-45, HPV-51, HPV-52, HPV-53,
HPV-54, HPV-56, HPV-58, HPV-59, HPV-66,
HPV-68, dan HPV-70[12].
Prinsip kerja DNA-HPV Micro Array : (1) ekstraksi sel untuk mengisolasi DNA, (2) DNA
yang telah diisolasi kemudian diamplifikasi
menggunakan PCR, (3) hasil amplifikasi dihibridisasi menggunakan probe spesifik dari
ke-24 genotipe HPV; proses hibridisasi ini
memerlukan sejumlah DNA untai tunggal,
(4) kemudian proses deteksi sehingga akan
terlihat genotipe-genotipe HPV pada sampel
yang diperiksa[4,12]. (gambar 4).
Gambar 4. Hasil deteksi genotipe HPV[12]
Linear Array HPV Genotyping Test
Metode ini sudah digunakan pada banyak
penelitian mengenai HPV[13]; di RS Kanker
Dharmais digunakan untuk diagnosis infeksi
HPV penyebab kanker serviks dan kutil[4]. Teknik
ini adalah salah satu teknik terbaru di dunia
molekuler untuk mendeteksi HPV[13]. Kelebihan
teknik ini adalah dapat diketahuinya tipe
HPV yang menginfeksi, apakah tipe lr-HPV
atau hr-HPV yang dapat menyebabkan kaker
serviks. Linear Array HPV Genotyping Test
mampu mendeteksi 37 genotipe HPV baik
hr-HPV maupun lr-HPV secara bersamaan[13,14].
Ke-37 genotipe HPV yaitu HPV-6, HPV-11,
HPV-16, HPV-18, HPV-26, HPV-31, HPV-33,
HPV-35, HPV-39, HPV-40, HPV-42, HPV-45,
HPV-51, HPV-52, HPV-53, HPV-54, HPV-55,
HPV-56, HPV-58, HPV-59, HPV-61, HPV-62,
HPV-64, HPV-66, HPV-67, HPV-68, HPV-69,
HPV-70, HPV-71, HPV-72, HPV-73, HPV-81,
HPV-82, HPV-83, HPV-84, HPV-IS39, dan
HPV-CP6108[13].
357
Hibridisasi asam nukleat mempunyai dua unsur
utama yaitu DNA target dan pelacak. DNA
target yaitu DNA yang telah terdenaturasi.
Pelacak yang digunakan memiliki urutan
spesifik untuk 37 genotipe HPV[4].
(1)
(3)
(2)
(4)
Gambar 5. Perangkat diagnostik Linear Array HPV
Genotyping Test (1) PCR N9700, (2) reagen, (3) typing
tray, dan (4) Linear Array HPV Genotyping Strip[4].
Prinsip kerja Linear Array HPV Genotyping
Test terbagi menjadi empat tahapan[14]. Tahap
pertama ekstrasi DNA dari sampel menggunakan Amplilute Liquid Media Extration
Kit, ekstraksi dimulai dengan melisis jaringan
menggunakan buffer ATL, merusak protein
dengan Proteinase K, merusak RNA dengan
RNase sehingga akan diperoleh DNA yang
diinginkan[4,13].
Tahap kedua yaitu amplifikasi DNA menggunakan PCR TC9700[4]. Prinsip dasar PCR pada
metode Linear Array HPV Genotyping Test
adalah enzim AmpliTaq Glod DNA polymerase memperbanyak sekuen spesifik yang dimulai dengan pelekatan primer dan menyatukan dNTP-dNTP yang berlangsung dalam
reaksi termal[13,14]. Proses pra-denaturasi dan
denaturasi DNA membutuhkan suhu 950C,
penempelan atau annealing membutuhkan
suhu 550C. Suhu 550C adalah suhu hasil
optimasi agar primer tidak salah menempel
(mispriming)[1]. Proses elongasi membutuhkan
waktu 1 menit dan suhu 720 C, hal tersebut
sesuai dengan teori bahwa untai DNA tunggal
yang disintesis oleh Taq polimerase membutuhkan suhu 720C[5,7].
Tahap ke tiga yaitu hibridisasi DNA; pada
proses ini diperlukan sejumlah DNA untai
tunggal sehingga DNA hasil amplifikasi harus
didenaturasi menjadi DNA untai tunggal[13,17].
Salah satu perlakuan untuk memecah ikatan
hidrogen antar basa nitrogen adalah dengan
penambahan senyawa alkali seperti NaOH
yang terdapat pada larutan pendenaturasi[18].
358
Gambar 6. Mekanisme hibridisasi dan deteksi pada
metode LA HPV GT (a) membran nilon pada strip (b)
pelacak yang berada di atas membrane (c) DNA hasil
amplifikasi (d) larutan hibridisasi (e) DNA yang sudah
terlabel biotin (f) biotin label non radioaktif (g) streptavidan yang berikatan dengan biotin dan horseradish
-peroxidase (h) H2O2 dan TMB[4]
Pada tahap ke empat, prinsipnya DNA akan
berikatan dengan pelacak yang menempel
pada membran nilon bermuatan[17]. DNA sudah
diberi label biotin sehingga ikatan antara
pelacak dan DNA akan terdeteksi dan menghasilkan sinyal[5]. Sinyal tersebut akan ditangkap
oleh streptavidin-horseradish peroxidase menandakan bahwa ikatan pelacak dan DNA
berhasil[4]. Streptavidin-horseradish peroxidase
akan berikatan dengan H2O2 dan TMB (Tetramethylbenzine)[13]. Ikatan ini akan menghasilkan
warna biru pada membran nilon yang menunjukkan genotipe HPV[17]. Hasil deteksi akan
terlihat berwarna biru di atas Linear Array HPV
Genotyping Strip yang akan menunjukkan
genotipe HPV sampel[4].
Gambar 7. Hasil deteksi LA HPV Genotyping Test (1)
β-globin high, β-globin low, HPV-16, HPV-42 (2)
β-globin high, β-globin low, HPV-11, HPV-61,
HPV-68[4]
SIMPULAN
1. Metode PCR dan elektroforesis dapat
mengetahui keberadaan HPV tanpa mengetahui genotipe secara spesifik.
2. Metode Hybrid Capture II System digunakan untuk mengetahui keberadaan HPV
dengan memperkirakan kuantitas/jumlah
virus tanpa mengetahui genotipe HPV-nya.
3. Metode Multiplex HPV Genotyping Kit digunakan untuk mendeteksi 24 genotipe
HPV.
4. Metode DNA-HPV Micro Array digunakan
untuk mendeteksi 24 genotipe HPV.
5. Metode Linear Array HPV Genotyping Test
digunakan untuk mendeteksi 37 genotipe
HPV.
DAFTAR PUSTAKA
1. Yuwono T. Teori dan Aplikasi PCR. Yogyakarta: Penerbit
Andi, 2006.
2. Nuswantara S. Seminar Deteksi Dini dan Penanganan
Terkini Kanker Leher Rahim: Deteksi Human Papilloma Virus
Dalam Pencegahan Dini Kanker Leher Rahim. Bandung:
Santosa Bandung International Hospital, 2008.
3. Lörincz AT, Reid R, Jenson AB, Greenburg MD, Lancaster W,
Kurman RJ. Human Papillomavirus Infection of The Cervix:
Relative Risk Associations of 15 Common Anogenital Types.
Obstetr. Gynecol. 1998; 79: 328-37.
4. Novel SS, Safitri R, Nuswantara S. Analisis Distribusi G e n o tipe HPV Dengan Metode Linear Array HPV Genotyping Test.
Bandung: Biologi FMIPA-UNPAD, 2009.
5. Bartlett JMS, Stirling J. PCR Protocols. Totowa: Human Press,
1999.
6. Nuswantara S. Dasar-dasar Molekuler. Bandung: Laboratorium Bioteknologi Sandia Biotech Diagnostic Centre,
Santosa Bandung International Hospital, 2007.
7. Brown TA. Essential Molecular Biology. Inggris: Oxford Univ
Press., 1995.
8. Wolfe SL. An Introduction to Cell and Molecular Biology.
Belmont: Wadsworth Publ. Co. 1995.
9. Novel SS, Safitri R, Nuswantara S. Aplikasi Hybrid Capture
II System dalam Deteksi Dini Kanker Serviks. CDK 2009;
36(1): 24-6.
10. Castle PE, Lorincz AT, Lohnas IM. Result of Human Papillomavirus DNA Testing with the Hybrid Capture II Assay are
Reproducible. Clin. Microbiol. 2002; 40: 1088-90.
11. Monk BJ, Tewari KS. The Spectrum and Clinical Sequelae
of Human Papillomavirus Infection. Gynecol. Oncol.2008;
107: 6-13.
12. Zhao Y, Lin H, Shen D, Xuan Y, Lin Z. Distribution of HPV
Genotypes in Uterine Cervical Lesions in Yanbian, Northern
China. Pathol. Internat. 2008; 58: 643-7.
13. van Hamont D, van Ham MAPC, Bakkers JMJ., Massuger
LFAG, Melchers WJG. Evaluation of The SPF10-INNO LiPA
Human Papillomavirus (HPV) Genotyping Test an the Roche
Linear Array HPV Genotyping Test. Clin. Microbiol. 2006;
44(9): 3122-9.
14. van Doorn LJ, Quint W, Kleter B, Olivera HS. Genotyping of
Human Papillomavirus in Liquid Cytology Cervical Specimens by the PGMY Line Blot Assay and the SPF10 Line
Probe Assay. Clin. Microbiol. 2002; 40(3): 979-83.
15. Verteramo R, Pierangeli A, Mancini E. Human Papillomaviruses and Genital Co-infections in Gynaecological
Outpatients. BMC Infect. Dis. 2009; 9(16): 1-7
16. Syrjanen KJ. HPV Infections and Oesophageal Cancer.
J. Clin. Pathol. 2002; 55(10): 721-8.
17. Sudjadi. Bioteknologi Kesehatan. Yogyakarta: Kanisius,
2008.
18. Yuwono T. Biologi Molekuler. Jakarta: Erlangga, 2005.
C D K 1 8 6 / V o l . 3 8 n o . 5 / J u l i- Ag u s t u s 2 0 1 1