BAB III METODE PENELITIAN A. Tempat Penelitian Penelitian yang

BAB III
METODE PENELITIAN
A. Tempat Penelitian
Penelitian yang meliputi pemeliharaan hewan coba, pemberian perlakuan dan
pemeriksaam sampel darah dilakukan di laboratrium Pusat Studi Pangan dan Gizi
Pusat Antar Universitas Universitas Gajah Mada Yogyakarta.
B. Waktu Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Desember 2015 - januari 2016. Matrik
jadwal penelitian ada pada lampiran 10.
C. Jenis Penelitian
Penelitian
ini
merupakan
penelitian
eksperimental
laboratorik
dengan
randomized pre and post test control group design. Pada penelitian ini
menggunakan lima kelompok perlakuan yaitu kelompok kontrol negative (KN),
kontrol positif (KP), kelompok perlakuan satu (P1), kelompok perlakuan dua (P2)
dan (P3) kelompok pelakuan tiga (Wahyuningrum, 2012)..
D. Populasi dan Sampel Penelitian
Populasi penelitian ini adalah tikus putih (Rattus norvegirus) jantan, strain
wistar. Usia 8-9 minggu berat 180-200 gram. Jumlah sampel yang digunakan untuk
penelitian ini adalah sebanyak 30 ekor tikus. Sampel tersebut diperoleh dari
perhitungan besar sampel menurut rumus Federer yaitu (n-1) (t-1)>15
(Wahyuningrum, 2012).
Perhitungan besar sampel :
(n – 1) (r – 1) ≥ 15
(n – 1) (5 – 1) ≥ 15
(n – 1) 4 ≥ 15
4n – 4 > 15
4n > 19
n > 19/4
n ≥ 4,75 => n = 5
21
22
Keterangan :
n : jumlah ulangan (replikasi)
r : jumlah perlakuan
Berdasarkan perhitungan besar sampel menurut Federer diperoleh sampel per
kelompok adalah 5 ekor. Namun untuk menghindari drop out pada sampel
ditambahkan 10% dan penambahan 10% dihasilkan jumlah sampel 5,5 yang
dibulatkan menjadi 6 ekor. Jadi jumlah sampel pada penelitian ini adalah 5 ekor
untuk setiap kelompok perlakuan.
E. Variabel Penelitian
1. Variabel bebas.
Tepung daun kelor dengan dosis 500 mg/ kgBB/hari, 1000mg/ kgBB/hari, 1500
mg/ kgBB/hari
2. Variabel terikat :
a. kadar glukosa darah
b. kadar MDA
3. Variabel terkendali : jenis kelamin tikus, umur tikus, berat badan tikus, dosis
streptozotocin dan nikotinamid, pakan standar tikus.
F.
Definisi Operasional Variabel
1. Tepung daun kelor dibuat dari daun kelor yang dipetik dari kota cilacap dengan
tahap pengolahan daun segar menjadi daun kering, dilanjutkan pengolahan daun
kering menjadi tepung daun dan dibagi menjadi dosis 500 mg/kg BB, 1000
mg/Kg BB dan 1500 mg/Kg BB (Velaga et all tahun 2014 dengan modifikasi)
Satuan : mg
Skala : rasio
2. Kadar glukosa darah adalah banyaknya glukosa yang terkandung dalam 1 dl atau
darah tikus wistar yang diperiksa kuantitatif dengan metode enzimatik GODPAP
(Hanifah, 2014).
Satuan : mg/dl
Skala data : rasio
23
3. Malondialdehyde (MDA) adalah produk peroksidasi lipid yang digunakan
sebagai biomarker biologis untuk menilai stres oksidatif (Winarsi, 2007).
Pemeriksaan MDA dilakukan menggunakan metode Thio Barbituric Acid
Reactive Substance (TBARS) dengan spektofotometer (Dafriani, 2010).
Satuan : nmol/ml.
Skala data : rasio.
G. Prosedur Penelitian
1. Alat dan Bahan
a. Alat
1) Sonde lambung.
2) Tabung mikrohematokrit.
3) Rak tabung reaksi.
4) Tabung sentrifuge.
5) Gelas ukur kecil.
6) Spuit 5 ml.
7) Pengaduk.
8) Saringan.
9) Sentrifuge.
10) Pemanas water bath.
11) Cawan porselin.
12) Timbangan.
13) Kandang hewan percobaan beserta kelengkapan pemberian makanan.
b. Bahan
Bahan-bahan yang digunakan meliputi streptozotocin, nicotinamide,
tepung daun kelor, kit pemeriksaan glukosa, dan kit untuk analisis MDA.
24
c. Bahan Pakan Tikus
Komposisi pakan standar tikus Comfeed seperti pada Tabel 3.1.
Tabel 3.1 pakan standar tikus comfeed
Zat Gizi
Comfeed/ 100 gram
E (kkal)
344
P (gram)
19
L (gram)
4
KH (gram)
58
Sumber : Lutfiyah, 2015
2. Cara Kerja
a. Pembuatan tepung daun kelor
Pengolahan daun Kelor untuk membuat Serbuk Daun Kelor Premium
metode Kelorina, terdiri dari beberapa tahapan proses pengolahan sebagai
berikut :
1) Pengolahan Daun Segar
a) Pemanenan Daun Segar
Memilih daun segar berwarna hijau tua tanpa cacat.
b) Pencucian
Daun segar dimasukan ke dalam bak pencucian untuk menghilangkan
kotoran, debu dan bagian tanaman lainnya.
c) Penirisan
Daun Kelor segar hasil ditiriskan agar air yang masih menempel pada
daun dapat benar-benar hilang.
d) Pengeringan
Pengeringan dilakukan di dalam oven suhu dipertahankan stabil 400C
selama ± 10 jam sampai benar-benar kering.
2) Pengolahan Daun Kelor kering menjadi Tepung Daun
a) Penepungan
Daun kelor kering dihaluskan dengan menggunakan mesin penepung
stainless steel/grinder penghancur.
25
b) Pengayakan
Serbuk daun kelor disaring dengan ayakan stainless steel untuk
menghasilkan serbuk daun dengan tingkat kehalusan diatas 40 mesh.
(Krisnadi 2013 dengan modifikasi).
b. Persiapan hewan coba
1) Pemeliharaan tikus
Hewan coba yang digunakanadalah tikus sebanyak 30 ekor yang
terlebih dulu diadaptasikan selama 7 hari dengan diberi makan dengan
pakan standar dan minum secara ad libitum. Setelah adaptasi tikus dibagi
secara acak menjadi lima kelompok dan ditempatkan dalam kandang
khusus hewan coba secara terpisah. Pemeliharaan tikus dilakukan oleh
petugas yang terlatih di laboratrium Pusat Studi Pangan dan Gizi Pusat
Antar Universitas Gajah Mada Yogyakarta.
2) Induksi streptozotocin (STZ) dan nikotinamid (NA)
Induksi streptozotocin (STZ) diberikan dengan dosis sedang dalam
bentuk suntikan intraperitoneal. Dosis STZ dilarutkan dalam buffer sitrat
(pH 4,5) dan nikotinamid dilarutkan dalam garam fisiologis normal.
Model tikus diabetes melitus tipe 2 dibuat dengan cara menginduksi tikus
dengan injeksi nicotinamide (110 mg/kg bb) dibagian intraperitoneal dan
15 menit kemudian diinjeksi dengan STZ (45 mg/kg bb). Hiperglikemia
dikonfirmasi setelah 72 jam kemudian. Hewan dengan konsentrasi
glukosa darah lebih dari 250 mg/dL dianggap diabetes melitus tipe 2 dan
digunakan untuk percobaan (Ghazemi, 2014).
3) Kelompok perlakuan
Tikus wistar dibagi menjadi lima kelompok secara acak masingmasing enam ekor dengan perlakuan berbeda. Pembagian kelompok
sampel adalah sebagi berikut:
a) Kelompok KN: Kontrol Negatif, tikus normal dengan pemberian
akuades dan pakan standart comfeed secara ad libitum.
b) Kelompok KP: Kontrol Positif, tikus DM pasca induksi STZ dan NA
dengan pemberian akuades, pakan standart comfeed secara ad
libitum.
26
c) Kelompok P1: tikus DM pasca induksi STZ dan NA dengan
pemberian akuades pakan, standart comfeed secara ad libitum serta
perlakuan dengan tepung daun kelor dosis 500 mg/kg BB/hari.
d) Kelompok P2: tikus DM pasca induksi STZ dan NA dengan
pemberian akuades pakan, standart comfeed secara ad libitum serta
perlakuan dengan tepung daun kelor dosis 1000 mg/kg BB/hari.
e) Kelompok P3: tikus DM pasca induksi STZ dan NA dengan
pemberian akuades pakan, standart comfeed secara ad libitum serta
perlakuan dengan tepung daun kelor dosis 1500 mg/kg BB/hari.
c. Persiapan sampel uji
Sebelum pengambilan darah tikus dipuasakan selama 10 jam dengan
tetap diberikan air minum. Pengambilan darah dilakukan melalui plexus
retroorbitalis pada mata dengan mikro hematokrit. Darah ditampung dalam
mikrotube kemudian disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 1620
rpm. Selanjutnya sampel plasma darah dilakukan pengujian kadar glukosa
darah dan MDA.
d. Pengukuran kadar glukosa
Kadar
glukosa
ditentukan
secara
enzimatik
menggunakan
penambahanenzim glukosa oksidase (GOD). Prisip kerja metode enzimatik
dibantu enzim-enzim seperti contohnya katalase (reaksi Hantz) dan
peroksidase (reaksi trinder). Pereagen menggunakan pereagen GOD-PAP.
Absorbansi λ dan warna absorbansi metotde enzimatik intensitasnya paa λ
500 nm dengan warna merah (dari H2o2 yang terbentuk + peroksidasi).
Dengan prinsip dasar glukosa dioksidasi oleh oksigen dengankatalis enzim
glukosa oxidase (GOD) akan membentuk asam glukonik dan hydrogen
peroksida (H2O2). Dnagn adanya oksigen atau udara, glukosa dioksidasi
oleh enzim menjadi asam glukorunat disertai pembentukan H2O2. Enzim
peroksidase
(POD)
mengakibatkan
H2O2
membebaskan
O2
yang
mengoksidasi akseptor kromogen yang sesuia serta member warna yang
sesuai. Kadar glukosa darah ditentukan berdasarkan intensitas warna yang
27
terjadi, diukur secara spektofotometri. Hydrogen peroksida akan bereaksi
dengan 4-aminoantiyrin dan fenol dengan katalis peroksidase (POD)
membentuk quinoimine dan air. Quinoneimine ini merupakan indicator yang
menunjukkan kadar glulosa dalam darah. Darah diambil dari sinus orbitalis
tikus kemudian disentrifus selama 10 menit dengan kecepatan 2500. Serum
sebanyak 10 µl kemudian ditambah dengan 1 ml reagen GOD-PAP, divortek
selama 5 detik kemudian diinkubasi pada suhu 370 C selama 10 menit.
Absorbansi diukur dengan spektofotometer pada panjang gelombang 500 nm
(Dafriani, 2010)
e. Pengukuran MDA
MDA
diukur
menggunakan
metode
TBARS,
yakni
mengukur
konsentrasi Thiobarbituric Acid Reactive Substance. Asam fosfat sebanyak
750 µl dimasukkan dengan pipet ke dalam tabung polypropilen 13 ml.
kemudian ditambah 50 µl TEP standar/pengontrol kualitas/sampel
plasma/aquades ke dalam tabung. Campuran dikocok sampai homogeny
keudian ditambahkan 250 µl larutan TBA 40 mM. aquades sebanyak 450 µl
ditambahkan
ke dalam tabung dan tabung ditutup rapat. Campuran
dipanaskan selama satu jam, setelah pemanasan tabung ditempatkan ke
dalam ice bath untuk mendinginkan sampel. Sampel yang sudah dingin
diaplikasikan ke dalam set-pak C 18 Culumn. Absorbansi diukur dengan
spektofotometer dengan panjang gelombang 532 nm (Dafriani, 2010).
f. Pengumpulan data
Data yang dikumpulkan adalah data primer berupa kadar glukosa darah
dan kadar MDA sebelum dan sesudah pemberian tepung daun kelor. Analisis
kadar glukosa menggunakan metode enzimatic colorimetric test GODPAP
dan analisis status antioksidan dengan pengukuran MDA menggunakan
metode TBARS C18.
28
g. Euthanasia hewan coba
Setelah pengambilan sampel darah pasca perlakuan, dilakukan proses
euthanasia dengan larutan eter ( dengan kapas yang dibasahi eter, masukkan
dalam suatu tempat yang sesuai besar hewan cobanya (toples), kemudian
tikus dimasukkan dalam tempat tersebut, ditunggu sampai mati ). Setelah
dipastikan mati, kemudian bakar.
29
H. Diagram Alur Penelitian
Tikus wistar
aklimatisasi
7 hari
Induksi STZ dan NA untuk
pembuatan DM-2
Non induksi STZ dan NA
3 hari
KN
KP
P1
P2
P3
Pakan standar
Pakan standar
Pakan standar
Pakan standar
Pakan standar
Pengukuran Glukosa darah dan ROS(MDA) sebelum perlakuan
P1( 500 mg/KgBB)
KN
KP
Pakan standar
Pakan standar
Pakan standar
P2 (1000 mg/KgBB)
Pakan standar
P3 (1500 mg/KgBB)
Pakan standar
Pengukuran Glukosa darah dan ROS(MDA) sesudah perlakuan
Analisis Statistik
KETERANGAN
KN: kontrol negatif
KP: kontrol positif
Pn: kelompok perlakuan
TDK : Tepung daun kelor
MDA : Malondialdehyde
Pre : sebelum perlakuay
Post : sesudah perlakuan
STZ : streptozotocin
NA : nikotinamid
7 hari
30
I.
Analisis Data
Data yang diperoleh diolah menggunakan program komputer IBM SPSS
Statistics 21. Pertama, dilakukan uji normalitas dengan menggunakan ShapiroWilk. Data berdistribusi normal jika nilai p>0,05. Selanjutnya dilakukan uji
homogenitas data dengan nilai p>0,05 dengan pengertian data mempunyai varian
yang homogen.
Perbedaan dari 5 kelompok perlakuan dianalisis menggunakan uji statistik
dengan paired samples Ttest. Selanjutnya dilakukan uji regresi untuk mengetahui
seberapa besar pengaruh pemberian tepung daun kelor terhadap penurunan glukosa
darah dan malondialdehyde (MDA).