BAB III. METODE PENELITIAN 3.1. Rancangan Penelitian

BAB III. METODE PENELITIAN
3.1. Rancangan Penelitian
Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental dengan berbasis
rancangan posttest only group design.
3.2. Populasi dan Sampel
3.2.1. Populasi Penelitian
Populasi dalam ini adalah tikus betina (Rattus norvegicus) yang diperoleh
dari Laboratorium Fakultas Kedokteran Universitas Islam Indonesia.
3.2.2. Sampel Penelitian
Sampel yang diambil pada penelitian ini adalah tikus putih (Rattus
norvegicus) galur Sprague-Dawley yang dikembangkan oleh Laboratorium
Fakultas Farmasi Universitas Islam Indonesia yang memenuhi kriteria inklusi dan
eksklusi.
Kriteria inklusi pada penelitian ini adalah tikus yang sehat dan tidak cacat,
berumur 1 bulan dan memiliki berat 40-60 gram. Kriteria eksklusi mencakup tikus
mati dalam penelitian dan tikus sakit dalam penelitian.
Jumlah sampel menurut WHO adalah minimal 5 ekor tiap kelompok. Pada
penelitian ini digunakan 10 ekor tikus yang dibagi menjadi 2 kelompok, yaitu
kelompok kontrol dan kelompok perlakuan dengan masing-masing kelompok
terdiri dari 5 ekor tikus.
3.3. Variabel Penelitian
3.3.1. Variabel Terikat
Variabel terikat pada penelitian ini adalah gambaran histologi perubahan
dan pertumbuhan sel usus halus.
3.3.2. Variabel Bebas
Variabel bebas dalam penelitian ini adalah infusa daun kelor (Moringa
oleifera) dengan dosis 400 mg/kgBB/hari dalam sediaan 50cc yang diberikan
selama 60 hari.
17
18
3.4. Definisi Operasional
1. Infusa air daun kelor (Moringa oleifera) adalah ekstrak hasil dari pengeringan
dan penyerbukan daun kelor yang diambil daun yang tidak terlalu muda dan
tidak terlalu tua tanpa tangkai. Dosis yang digunakan pada pada penelitian ini
adalah 400 mg/kgBB/hari dicampurkan dalam 50 ml aquades dan diberikan
selama 60 hari per oral ad libitum.
2. Gambaran histopatologi usus halus yang dimaksud dalam penelitian adalah
panjang dan lebar vili usus halus tikus putih. Perubahan histologi sel usus halus
tikus putih dengan pewarnaan Hematoksilin eosin. Pengamatan menggunakan
mikroskop cahaya Olympus CX 21 Pengamatan daerah yang akan diteliti
menggunakan mikroskop dengan pembesaran lensa objektif 4x dan lensa okuler
10x. Masing-masing sampel diambil + 5 lapangan pandang. Pembacaan hasil
ini dilakukan oleh 1 orang pembaca. Perubahan gambaran histopatologi yang
dilihat adalah sebagai berikut :
1) Ukuran panjang vili usus halus
2) Lebar atas vili usus halus
3.5. Instrumen Penelitian
1. Kandang tikus dan makanan tikus
2. Makanan tikus
3. Timbangan tikus
4. Infusan
5. Kain fannel
6. Tabung gelas 500 cc
7. Alat pemotong Jaringan
8. Kaca objek
9. Deck glass
10. Mikroskop cahaya
11. Pencetak blok jaringan
12. Infusaair daun Kelor (Moringa oleifera) 400 mg/kgBB/hari
19
13. Tikus dewasa (Rattus norvegicus) galur Sprague-Dawley, sehat dan tidak
cacat, berumur 1 bulan dan memiliki berat badan 40-60 gram.
14. Bahan-bahan penatalaksanaan jaringan dan pembuatan sediaan histologi
berupa zat pewarna Hematoksislin Eosin, parafin, cloral hydrat 3,5%, dan
aquades.
3.6. Tahap Penelitian
3.6.1. Koleksi Daun Kelor (Moringa oleifera)
Proses pembuatan simplisia pada prinsipnya meliputi tahap tahap
pencucian, pengecilan ukuran dan pengeringan.
1. Daun kelor dicuci dan dibersihkan untuk mencegah kotoran yg melekat.
2. Kemudian daun kelor dilakukan pemotongan kecil-kecil untuk
membantu proses pengeringan.
3. Potongan kecil-kecil dikeringkan di bawah sinar matahari dan ditutupi
dengan kain hitam untuk mencegah kerusakan kandungan kimia
tanaman yang di sebabkan oleh sinar UV dari matahari.
4. Setelah itu, simpliasi di serbukan dengan blender untuk memperbesar
luas permukaan partikel agar kontak antar bahan dan larutan lebih besar.
3.6.2. Pembuatan Simplisia Herbal Daun Kelor (Moringa oleifera)
Proses pembuatan infusa daun kelor dilakukan dengan metode infundasi.
Keuntungan dari proses ini agar bahan aktif di dalam sel cepat larut karena sel akan
mengalami lisis sehingga bahan aktif di dalamnya keluar. Cara pembuatan infusa
daun kelor adalah:
1. Simplisia daun kelor yang telah di serbukan sesuai metode yang di atas,
kemudian di timbang dengan berat tertentu dan di campur air dalam
panci sesuai konsenterasi yang diinginkan.
2. Setelah itu dipanaskan dengan pemanas air selama 15 menit, dihitung
mulai suhu dalam panci 90oC sambil sesekali diaduk.
3. Infusa disaring selagi panas dengan kain fannel.
20
4. Untuk mencukupi kekeurangan air, ditambahkan air mendidih melalui
ampasnya sehingga diperoleh infusa yang dikehendaki.
3.6.3. Pembuatan Infusa Air Daun Kelor (Moringa oleifera)
Proses pembuatan infusa daun kelor dilakukan dengan metode infundasi.
Keuntungan dari proses ini agar bahan aktif di dalam sel cepat larut karena sel akan
mengalami lisis sehingga bahan aktif di dalamnya keluar. Cara pembuatan infusa
daun kelor adalah:
1. Serbuk daun kelor yang telah di timbang dengan berat tertentu di
campur air dalam panci sesuai konsenterasi yang diinginkan.
2. Kemudian dipanaskan dengan pemanas air selam 15 menit, dihitung
mulai suhu dalam panci 90oC sambil sesekali diaduk.
3. Infusa disaring selagi panas dengan kain fannel.
4. Untuk mencukupi kekeurangan air, ditambahkan air mendidih melalui
ampasnya sehingga diperoleh infusa yang dikehendaki.
3.6.4. Persiapan Hewan Coba
Hewan coba berjumlah 10 ekor tikus (Rattus norvegicus) betina berumur 1
bulan galur Sprague-Dawley yang dipilih secara random dan dibagi ke dalam
kelompok kontrol dan kelompok perlakuan dengan jumlah yang sama pada masingmasing kelompok, yaitu 5 ekor tikus per kelompok.
Pemeliharaan hewan coba dilakukan di dalam kandang dengan ukuran
40x20x20 cm3. Suhu dalam kandang diatur sesuai dengan suhu kamar.
Pencahayaan dalam kandang diatur dengan siklus terang gelap selama masingmasing 12 jam. Siklus gelap dimulai pukul 14.00 WIB dan untuk siklus terang
dimulai pada pukul 07.00 WIB. Pemberian makan tikus berupa pelet BR-2
dilakukan setiap pagi pada pukul 08.00 WIB dan pemberian infusa kelor sebanyak
50cc. Sedangkan air minum diberikan secara ad libitum setelah air infusa habis
(pada saat pemberian makan). Jika infusa pada pagi hari saat waktu pemberian
makan belum habis maka sisa dicatat volumenya dalam cc yang masih tersisa. Pada
waktu pemberian infusa jika masih ada sisa maka ditimbang dalam gram dan
dicatat.
21
3.6.5. Pemberian Infusa Daun Kelor (Moringa oleifera)
Pemberian infusan dilakukan pada kelompok perlakuan dengan dosis
400mg/kgBB/hari secara oral sebagai pengganti air minum pada pukul 15.00
sampai esok pagi pukul 07.00 sebanyak 50 cc dan dilakukan pengecekan. Jika
didapatkan sisa dihitung volumenya dan dicatat. Pemberian minum infusa
dilakukan setiap hari selama 60 hari.
0,08g/0,2 KgBB
0,018g/0,045KgBB
0.018 g
 0,00036 𝑔/𝑚𝑙
50𝑚𝑙
0,00036 𝑔
= 0,036 𝑔
100 𝑚𝑙
Buat infusa
0,036 𝑔
× 50 𝑚𝑙 = 0,1845𝑚𝑙
10𝑚𝑙
0,185𝑚𝑙 × 7𝑒𝑘𝑜𝑟 𝑡𝑖𝑘𝑢𝑠 = 1,3 𝑚𝑙 𝑑𝑎𝑢𝑛 𝑘𝑒𝑙𝑜𝑟 → 𝑑𝑎𝑙𝑎𝑚 350 𝑚𝑙 𝑎𝑖𝑟
3.6.6. Pengambilan Jaringan Usus Halus
Sampel diambil dari tikus putih pada hari ke-60 dengan cara pengambilan
jaringan usus halus tikus dengan teknik perfusi transkardial. Sebelumnya tikus
dibius menggunakan inhalasi eter. Perfusi dilakukan dengan menggunakan 0,2%
paraformaldehid dalam phosphate buffer (PB) 0,1 M, pH 7,4 pada suhu 370C,
dengan kecepatan antara 15-20 mL/menit sebagai pre-rinse, dilanjutkan dengan
larutan fiksatif 2% paraformaldehid dalam PB 0,1 M, pH 7,4 dengan suhu 40C
selama 20 menit dengan kecepatan yang sama.
Perfusi transkardial dilakukan dengan membuka rongga dada dengan
melakukan insisi linea mediana pada dinding abdomen, dilanjutkan insisi sepanjang
linea axilaris sampai dinding thoraks terbuka dan jantung terlihat. Ventrikel kiri
jantung diinsisi kemudian kanula dimasukkan hingga mencapai aorta ascenden.
Kanula difiksasi dengan penjepit ateri. Dilakukan insisi atrium kanan untuk
mengeluarkan darah. Cairan perfusi PBS dialirkan melalui kanula. Agar usus
halusmendapatkan perfusi sepenuhnya maka dilakukan jepitan pada aorta
22
descendens. Perfusi PBS dilanjutkan sampai darah yang keluar melalui atrium
kanan tampak jernih dan arteri mamaria interna disekitar sternum tampak putih
karena terisi cairan jernih. Kemudian dimasukkan cairan fiksatif selama  20 menit.
Fiksasi yang baik dapat diamati melalui tanda-tanda dimana ekstremitas superior
tampak kaku, arteri mamaria interna tampak jernih dan terjadi perubahan warna
pada bola mata yang sebelumnya tampak merah menjadi putih.
Setelah perfusi transkardial sempurna maka dilakukan dekapitasi, kemudian
pengambilan jaringan usus halus tikus. Jaringan usus halus tersebut diambil secara
hari-hati dan difiksasi dengan larutan 2% paraformaldehid dalam PB 0,1 M, pH 7,4
pada suhu 40C selama 24 jam.
3.6.7. Proses Blok Parafin dan Sayatan Preparat
Pembuatan preparat histologi dilakukan dengan cara organ usus halus
difiksasi dengan menggunakan larutan Netral Buffer Formalin 10% kemudian
dipotong dan dimasukan ke dalam tempat specimen yang terbuat dari plastik.
Selanjutnya dilakukan dehidrasi dengan alkohol konsentrasi bertingkat 70%, 80%,
90% alkohol absolute I, absolute II masing-masing 2 jam. Lalu dilakukan
penjernihan (clearing) dengan xylol kemudian dicetak menggunakan paraffin
sehingga sedian tercetak didalam blok-blok paraffin dan disimpan dalam lemari es.
Blok-blok paraffin tersebut kemudian dipotong tipis setebal 4-5 µm menggunakan
mikrotom. Hasil potongan diapungkan dalam air hangat bersuhu 60 °C untuk
meregangkan agar jaringan tidak berlipat. Sedian kemudian diangkat dan
diletakkan dalam gelas objek untuk dilakukan dalam gelas objek untuk dilakukan
kemudian diberi pewarnaan hematoksilin eosin untuk selanjutnya diperiksa di
bawah mikroskop.
3.7. Cara Pengumpulan Data
Efek pemberian infusa kelor (Moringa oleifera), pengamatan preparatnya
dilakukan oleh 1 orang pembaca untuk masing-masing preparat dengan
menggunakan mikroskop cahaya Olympus CX 21 dilakukan di Laboratorium
Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas Islam Indonesia.
23
3.8. Analisis Data
Data yang diperoleh berupa angka pengukuran panjang dan lebar vili usus
halus yang di hitung oleh peneliti untuk membandingkan hasil pengukuran antara
kelompok kontrol dengan kelompok perlakuan menggunakan analisa statistik
independent t-test.
3.9. Etika Penelitian
Penelitian ini dilakukan di laboratorium Terpadu Fakultas Kedokteran
Universitas Islam Indonesia dan telah mendapatkan persetujuan Komite Etik
Fakultas Kedokteran Universitas Islam Indonesia. Nomor :
29/Ka.Kom.Et/70/KE/I/2016
24
3.10. Skema perjalanan penelitian sebagai berikut :
10ekor tikus dibagi kedalam 2
kelompok, masing-masing 5
tikus.
Diberikan infusan Daun kelor
dengan dosis 400 mg/KgBB
dengan cairan 50 cc daun kelor
Perlakuan – diberikan
infusan Daun kelor serta
pemberian pakan dengan
pakan pelet BR-2
Kontrol – diberikan air
biasa dan pemberian pakan
dengan pakan pelet BR-2
Perlakuan tiap kelompok
dilakukan sekali sehari sampai
hari ke-60
Hari ke-61 dilakukan eksisi
jaringan usus halus.
Hasil eksisi jaringan lalu dibuat
preparat dengan pewarnaan
hematoksilin eosin
Dilakukan pengamatan dan
penilaian preparat menggunakan
mikroskop cahaya
Hasil eksisi jaringan lalu dibuat
preparat dengan pewarnaan
hematoksilin eosin
Data dianalisis menggunakan uji independent T-test
Gambar 6. Skema penelitian