METODE ANALISIS PROBIOTIK Lactobacillus sp. PADA FESES

METODE ANALISIS PROBIOTIK Lactobacillus sp. PADA FESES
BALITA DAN ANAK YANG MENDAPAT ASUPAN PREBIOTIK
INULIN
Monica Sinatra Orrouw*, Amarila Malik, Rani Sauriasari
Program Studi Sarjana Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Indonesia, Kampus UI Depok, Depok,
16424, Indonesia
*Penulis Korespondensi, E-mail : [email protected]
ABSTRAK
Inulin dikenal memiliki efek sebagai prebiotik yang dapat meningkatkan populasi bakteri
probiotik sehingga berperan bagi kesehatan inangnya. Beberapa bakteri probiotik yang telah
dikenal adalah Lactobacillus dan Bifidobacterium yang merupakan bakteri asam laktat
(BAL). Artikel ini membahas mengenai mengenai pengujian aktivitas prebiotik tipe inulin
dengan menganalisis pertumbuhan bakteri Lactobacillus pada balita dan anak yang
mengonsumsi prebiotik inulin. Analisis pertumbuhan Lactobacillus dapat dilakukan dengan
pengkulturan pada medium spesifik dan perhitungan koloni. Namun berdasarkan penelitianpenelitian yang dilaporkan pada tahun 1997 dan 2002, medium spesifik umumnya memiliki
selektifitas yang kurang baik sehingga dibutuhkan metode analisis secara kualitatif untuk
memastikan identitas bakteri yang berhasil tumbuh. Keberadaan Lactobacillus dapat
dianalisis menggunakan teknik-teknik molekular, yaitu metode FISH, DGGE, dan PCR.
Kesimpulannya adalah bahwa dengan mengkombinasikan metode pengkulturan pada medium
selektif dan teknik molekuler akan diperoleh data yang lebih akurat.
Kata kunci
: inulin, Lactobacillus, prebiotik, probiotik, medium selektif
ABSTRACT
Inulin is known as prebiotic which is increasing the probiotic bacterial population.
Furthermore have a contribution to maintain the health of its host. The most well-known
probiotic bacterias are Lactobacillus and Bifidobacterium which belong to lactic acid
bacteria group. This article discusses about the activity testing of prebiotic inulin by
analyzing the growth of Lactobacillus bacteria in toddlers and children who consume
prebiotic inulin. The growth of Lactobacillus can be analyzed by culturing in selective
medium and by colonies counting. According to the studies reported in 1997 and 2002,
selective medium showed a low selectivity; it therefore requires a qualitative method to
confirm the identity of bacteria which able grows in the medium. The existence of
Lactobacillus can be analyzed using molecular techniques, i.e. FISH, DGGE, and PCR. As
conclusion, here we can combine the method of culture in selective medium and molecular
technique to obtain more reliable data.
Keywords
: inulin, Lactobacillus, prebiotic, probiotic, selective medium
Upaya pengembangan…, Monica Sinatra Orrouw, FF UI, 2013
Pendahuluan
Prebiotik adalah suatu senyawa yang sukar dicerna oleh sistem pencernaan yang dapat
memberikan manfaat fisiologis pada inang dengan cara menstimulasi aktivitas/pertumbuhan
bakteri baik dalam usus (Robenfroid, 2007). Bakteri baik ini dikenal sebagai bakteri probiotik
yang jika dikonsumsi, akan memberikan manfaat kesehatan bagi inangnya (DebMandal,
Mandal, & Pal, 2012). Lactobacillus, sebagai salah satu bakteri probiotik, memiliki beberapa
manfaat kesehatan diantaranya dapat membantu proses pencernaan laktosa, melindungi
saluran pencernaan dari patogen, antikarsinogenik bagi kanker usus, pengaturan sistem imun,
mencegah diare akut pada bayi, meningkatkan fungsi saluran pencernaan, meningkatkan
penyerapan mineral, meningkatkan metabolisme glukosa dan kolesterol, meningkatkan
sistem imun, dan membentuk efek antimikroba terhadap bakteri patogen (Vyas &
Ranganathan,
2012).
Untuk
mendapatkan
manfaat-manfaat
baik
bagi
kesehatan,
Lactobacillus dan bakteri probiotik lainnya harus ada dalam jumlah yang cukup dalam
saluran pencernaan. Regulasi populasi bakteri probiotik dalam saluran pencernaan dapat
dilakukan dengan mengonsumsi prebiotik.
Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Balmer dan Wharton (1989) serta
Harmsen dkk. (2000) diketahui bahwa terdapat perbedaan komposisi mikroba usus pada bayi
yang mengonsumsi ASI dan susu formula. Pada bayi yang mengonsumsi ASI, mikroba usus
didominasi oleh Bifidobacteria dan Lactobacillus yang dikenal berperan penting bagi
kesehatan inangnya. Mikroflora pada usus bayi tersebut berkembang cepat seiring dengan
gizi atau makanan yang dikonsumsi. Pada bayi yang mengonsumsi susu formula, ditemukan
Streptococcus, Enterobactericea, dan Bacteroides. Bakteri-bakteri tersebut merupakan
bakteri yang sering ditemukan pada orang dewasa. Sedangkan pada bayi yang mengonsumsi
ASI, saluran pencernaan didominasi oleh bakteri Bifidobacteria dan Lactobacillus yang
dikenal dapat mengaktifkan sistem imun pada bayi (Kim, Lee, & Meyer, 2007). Diketahui
pada bayi berusia kurang dari 6 bulan, jumlah bakteri Bifidobacteria lebih banyak
dibandingkan dengan Lactobacillus.
Hal ini disebabkan ASI mengandung sekitar 7% karbohidrat yang terdiri dari laktosa
(80%) dan oligosakarida (20%). Kandungan oligosakarida pada ASI dan kolostrum sebanyak
12-13 g/L dan 22-24 g/L (Urashima et al., 2012). Oligosakarida ini memiliki struktur molekul
yang kompleks dan terdiri dari berbagai jenis gula seperti galaktosa, glukosa, fruktosa, Nasetilglukosamin, dan asam sialat (Kim, Lee, & Meyer, 2007). Berdasarkan penelitian yang
dilakukan oleh Marcobal dkk. (2010), diketahui bahwa kandungan oligosakarida dalam ASI
Upaya pengembangan…, Monica Sinatra Orrouw, FF UI, 2013
dapat meningkatkan pertumbuhan Bifidobacteria dan Lactobacillus (Urashima et al., 2012).
Selain itu Arnon dkk. (1982) menyatakan bahwa bayi yang mengonsumsi susu formula
memiliki risiko kematian lebih tinggi dibandingkan dengan bakteri yang mengonsumsi ASI
(Kim, Lee, & Meyer, 2007). Berdasarkan hal tersebut, diketahui terdapat perbedaan antara
kandungan ASI dengan susu formula. Susu formula tidak mengandung oligosakarida yang
berperan sebagai prebiotik bagi bayi.
Dewasa ini probiotik dan prebiotik banyak digunakan dalam industri makanan
termasuk susu formula untuk bayi dan balita. Pemberian probiotik dan prebiotik ini
diharapkan memberikan efek yang sama dengan bayi yang mengonsumsi ASI yaitu
meningkatkan populasi bakteri baik dalam saluran pencernaan bayi dan balita, meningkatkan
fungsi pertahanan mukosa, mencegah infeksi patogen pada saluran pencernaan. Penggunaan
prebiotik dan probiotik pada balita bertujuan untuk mencegah alergi dan hipersensitivitas
terhadap makanan, infeksi saluran pernapasan atas, diare, dan infeksi diare akut (Mugambi et
al., 2012).
Mengingat pentingnya fungsi prebiotik maka perlu dilakukan penelitian terhadap efek
prebiotik bagi kesehatan. Hal ini dapat dilakukan dengan pemeriksaan bakteri probiotik yang
ada dalam usus. Analisis bakteri probiotik ini dapat dilakukan dengan beberapa metode
antara lain
penghitungan koloni melalui pengkulturan pada medium spesifik, metode
molekuler dengan Fluorescence In Situ Hybridisation (FISH), Denaturing Gradient Gel
Electrophoresis (DGGE), Polymerase Chain Reaction (PCR), dan PCR Sequencing Total
DNA (Gibson, 2004). Artikel ini membahas mengenai metode-metode yang dapat digunakan
dalam pemeriksaan aktivitas prebiotik inulin dengan keberadaan bakteri Lactobacillus
sebagai kontrolnya. Artikel lain yang bersamaan dengan topik ini menggunakan bakteri
probiotik Bifidobacterium sebagai topik utama (sedang diproses untuk publikasi).
Prebiotik Inulin
Prebiotik merupakan senyawa sejenis karbohidrat yang sukar dicerna dan dapat
menstimulasi pertumbuhan bakteri baik dalam usus. Senyawa tersebut mempunyai
karakteristik antara lain : tahan terhadap asam lambung, tidak terhidrolisis dan tidak
terabsorbsi dalam usus kecil, difermentasi secara selektif oleh mikroflora pencernaan
(Bifidobacteria dan Lactobacillus), dapat menstimulasi pertumbuhan bakteri probiotik
(Robenfroid, 2007). Prebiotik dibedakan menjadi dua, yaitu prebiotik tipe inulin dan
galaktooligosakarida (GOS) (Roberfroid, 2007). Prebiotik tipe inulin meliputi inulin dan
fruktooligosakarida atau FOS dan merupakan bagian dari kelompok fruktan (Kaur & Gupta,
Upaya pengembangan…, Monica Sinatra Orrouw, FF UI, 2013
2002). Fruktan adalah jenis karbohidrat yang memiliki satu atau lebih tautan fruktosilfruktosa yang terdiri dari ikatan glikosida. Fruktan memiliki tautan fruktosil-glukosa yang
identik dengan sukrosa (Kelly, 2008).
Inulin terdapat pada tumbuhan dikotil maupun monokotil dan biasanya terdapat pada
bagian akar atau rhizoma tumbuhan sebagai energi cadangan. Sumber inulin yang umum
digunakan antara lain : gandum, bawang merah, bawang putih, bawang perai, dan cikori
(Roberfroid, 2006).
Namun dalam perkembangan industri makanan dan obat-obatan,
digunakan tumbuhan yang berasal dari familia Compositae sebagai sumber inulin. Contoh
tumbuhan ini adalah cikori (Cichorium intybus) yang umum digunakan sebagai pengganti
kopi. Selain sebagai sumber inulin, tumbuhan cikori juga merupakan sumber dari
oligofruktosa (Kelly, 2008). Pada cikori, inulin disimpan sebagai karbohidrat pada bagian
akar dan memiliki kandungan sekitar 70-80% dari berat akar kering. (Kaur, 2002) Akar cikori
diekstraksi sehingga didapatkan campuran glukosa, fruktosa, sukrosa. dan beberapa jenis
oligosakarida. Ekstrak ini kemudian difraksinasi dan dipurifikasi hingga didapatkan inulin
(Roberfroid, 2006).
Inulin diklasifikasikan sebagai oligosakarida non-digestible karena memiliki
konfigurasi-β pada anomer C2 yang terdapat pada monomer fruktosanya sehingga tidak
mengalami hidrolisis oleh enzim pencernaan usus halus (α-glukosidase, maltase, isomaltase,
sukrase) yang spesifik terhadap ikatan α-glikosida (Roberfroid, 2006). Kemudian inulin
diteruskan hingga mencapai kolon untuk selanjutnya difermentasi oleh bakteri probiotik yang
menghasilkan enzim untuk menhidrolisis tautan β-(2à1) fruktosil-fruktosa. Fermentasi
inulin pada usus besar menghasilkan asam karboksilat rantai pendek (asetat, butirat, dan
propionat), laktat, dan gas (karbondioksida, hidrogen) sebagai hasil sampingan (Kelly, 2008).
Hasil fermentasi inilah yang berperan sebagai antimikroba bagi bakteri patogen. Asam laktat
berfungsi menekan aktivitas bakteri lain dengan menurunkan pH dan berperan sebagai
permeabilizer dari membran luar bakteri gram negatif (Lebeer, Vanderleyden, & De
Keersmaecker, 2008). Setiap segmen usus besar memiliki efek yang berbeda terhadap tiap
jenis inulin. Sebagai contoh, FOS dan oligofruktosa difermentasi terutama pada bagian
proksimal usus besar sedangkan inulin difermentasi pada bagian distal usus besar (Kelly,
2008).
Upaya pengembangan…, Monica Sinatra Orrouw, FF UI, 2013
[Sumber : Kelly, 2008]
Gambar 1. Skema metabolisme prebiotik tipe inulin dalam tubuh (telah diolah kembali)
Prebiotik inulin berperan sebagai makanan dari Lactobacillus sehingga peningkatan
prebiotik akan meningkatkan populasi Lactobacillus. Bakteri ini berperan dalam inhibisi
bakteri patogen, peningkatan fungsi lapisan epitel usus, dan regulasi sistem imun.
Lactobacillus dapat berkompetisi untuk mendapatkan nutrisi dengan bakteri lainnya. Selain
itu, Lactobacillus juga dapat berkompetisi dengan bakteri lain untuk memperebutkan reseptor
pada saluran pencernaan. Hal ini dapat dilihat pada penelitian yang dilakukan oleh Le
Bouguenec (2005). Dalam penelitian tersebut, bakteri patogen Escherichia coli
memanfaatkan reseptor oligosakarida pada saluran pencernaan. Lactobacillus menggunakan
reseptor yang sama sehingga terjadi kompetisi Lactobacillus dan bakteri patogen untuk
mengikat permukaan mukosa inang. Hal ini menyebabkan terhambatnya penyerangan lapisan
mukosa oleh bakteri patogen. Selain itu Lactobacillus juga mensekresi bakteriosin yang dapat
berperan sebagai antimikroba. Bakteriosin ini berupa protein yang stabil dalam keadaan
Upaya pengembangan…, Monica Sinatra Orrouw, FF UI, 2013
panas dan berukuran kecil dengan titik isoelektrik yang tinggi sehingga dapat menginduksi
permeabilisasi membran bakteri lain dan menyebabkan kebocoran pada bakteri target
(Lebeer, Vanderleyden, & De Keersmaecker, 2008). Selain itu proses fermentasi inulin oleh
bakteri probiotik menghasilkan asam laktat yang menyebabkan pengasaman kolon. Dengan
penurunan pH maka populasi bakteri tahan asam seperti Lactobacillus akan meningkat
sedangkan bakteri patogen yang tak tahan asam akan menurun (Lebeer, Vanderleyden, & De
Keersmaecker, 2008).
Pengujian Aktivitas Prebiotik Inulin
Salah satu efek prebiotik adalah meningkatkan populasi bakteri probiotik seperti
Lactobacillus dan Bifidobacteria (Roberfroid, 2007). Efek ini dapat diketahui dengan analisis
komponen dan pertumbuhan bakteri probiotik pada saluran pencernaan manusia. Pengujian
efek prebiotik dapat dilakukan secara in vitro maupun in vivo. Berdasarkan penelitian Wang
dan Gibson (1993), pengujian in vitro dilakukan dengan menumbuhkan Lactobacillus yang
tumbuh secara selektif dalam inulin. Penumbuhan tersebut dapat dilakukan pada kultur
murni, campuran, maupun kultur campuran yang telah difermentasi. Kemudian, kultur
tersebut diinokulasikan dalam sampel feses dan diamati peningkatan jumlah populasi bakteri
Lactobacillus setelah ditambahkan inulin pada medium. Namun metode ini sulit dilakukan
jika terdapat karbohidrat lain seperti pektin, polidekstrosa, atau starch. Metode in vitro
membutuhkan beberapa penyesuaian agar menyerupai kondisi aslinya yaitu saluran
pencernaan manusia.
Efek prebiotik inulin dapat diketahui dengan cara in vivo yaitu mengambil sampel
dari subyek (umumnya menggunakan feses) dan dianalisis secara mikrobiologi kuantitatif.
Analisis ini dilakukan dengan penumbuhan sampel dalam suatu medium kemudian diamati
pertumbuhan koloni bakteri. Jenis bakteri yang dapat digunakan dalam analisis ini antara lain
Bifidobacteria sp. dan Lactobacillus sp., serta bakteri lainnya seperti Clostridium,
Eubacterium, Bacteroides, dan Escherichia coli. Selain itu, efek prebiotik dapat pula
ditentukan dengan jumlah/kadar asam-asam organik, gas yang dihasilkan serta jumlah enzim
yang digunakan oleh bakteri. Namun variabel ini tidak termasuk dalam biomarker uji
prebiotik (Gibson et al, 2004). Metode in vivo dapat dilakukan dengan pemberian prebiotik
pada subyek. Kemudian dilakukan pemeriksaan pada feses subyek dengan pengkulturan pada
medium spesifik bakteri Lactobacillus. Pada metode ini dilakukan perbandingan jumlah
populasi bakteri Lactobacillus sebelum pemberian prebiotik dan setelah pemberian prebiotik
Upaya pengembangan…, Monica Sinatra Orrouw, FF UI, 2013
(Kim, Lee, & Meyer, 2007). Selain metode tersebut, dapat pula digunakan metode molekuler
dengan analisis FISH, DGGE, atau PCR (Gibson, 2004; Favier et al., 2001).
Analisis Menggunakan Medium Spesifik
Analisis ini dilakukan dengan penumbuhan sampel dalam suatu medium spesifik
kemudian diamati pertumbuhan koloni bakteri. Jenis bakteri yang dapat digunakan dalam
analisis ini antara lain Bifidobacteria sp. dan Lactobacillus sp., serta bakteri lainnya seperti
Clostridium, Eubacterium, Bacteroides, dan Escherichia coli (Gibson et al, 2004). Untuk
memisahkan Lactobacillus dari bakteri-bakteri lainnya dapat dilakukan isolasi menggunakan
medium spesifik yang memiliki selektivitas baik. Sampel feses yang diperoleh, dikultur pada
medium yang memiliki kondisi spesifik bagi pertumbuhan Lactobacillus. Dengan demikian
pertumbuhan bakteri-bakteri lainnya dapat dihambat dan diperoleh koloni-koloni
Lactobacillus. Umumnya isolasi Lactobacillus dilakukan dengan medium yang kaya nutrisi
dan suasana asam (4,5 – 5,5) seperti LAMVAB, MRS, dan LBS atau Rogosa agar
(Hartemink, Domenech, & Rombouts, 1997).
Koloni Lactobacillus pada suatu medium memiliki karakteristik sebagai berikut :
berbentuk koloni bulat dengan tepian seperti wol, berwarna putih susu atau krem, berukuran
2-5 mm, dan cembung. Bentuk koloni Lactobacillus plantarum pada medium LBS dapat
dilihat pada Gambar 2. Bentuk sel Lactobacillus umumnya berbentuk batang panjang hingga
hampir bulat atau berbentuk rantai pendek, berukuran 0,5-1,2 x 1,0-10,0 µm (Feliatra, Efendi,
& Suryadi, 2004).
[Sumber : http://85.238.144.18/analytics/Micro_Manual/TEDISdata/prods/4973-1_05413_0500-1.jpg]
Gambar 2. Koloni Lactobacillus plantarum pada medium selektif LBS atau Rogosa
Upaya pengembangan…, Monica Sinatra Orrouw, FF UI, 2013
Analisis pertumbuhan bakteri probiotik pada feses dengan medium spesifik LBS
pernah dilakukan oleh Kim Sook-He dkk. (2007) pada 14 bayi dengan usia rata-rata 12,4
minggu di Korea Selatan dengan dosis inulin sebesar 0,25 g/kg/hari. Pada penelitian tersebut,
ditemukan adanya peningkatan berat badan sebesar 509 gram pada bayi yang diberi inulin
dan sebesar 411 gram pada bayi yang tidak diberi inulin. Selain itu terjadi penurunan pH
feses bayi yang mengonsumsi inulin (dari 6,51 ± 0,49 menjadi 6,31 ±
0,34) namun
penurunan ini tidak signifikan secara statistik (p = 0,2206). Terjadi peningkatan frekuensi
buang air besar atau defekasi pada kelompok inulin dan diikuti dengan perubahan konsistensi
menjadi lebih lembut dan lunak (Kim, Lee, & Meyer, 2007).
Pemeriksaan komposisi bakteri probiotik dilakukan dengan pengkulturan pada
medium spesifik masing-masing bakteri Bifidobacteria, Lactobacillus, dan Bacterioides
(Kim, Lee, & Meyer, 2007). Namun pada artikel ini hanya akan dibahas mengenai bakteri
Lactobacillus. Pengkulturan dilakukan dengan medium spesifik Lactobacillus yaitu
Lactobacillus Selection atau agar Rogosa. Medium LBS dapat digunakan untuk mengisolasi
Lactobacillus dari sampel feses hewan maupun manusia (Nelson & George, 1995; Rogosa,
Mitchell, & Wiseman, 1951; Gilliland, Speck, & Morgan, 1975. LBS (Lactobacillus
Selection) merupakan medium agar yang digunakan dalam isolasi atau penghitungan koloni
bakteri Lactobacillus sp. (Rogosa, Mitchell, & Wiseman, 1951). Sebelumnya, agar yang
terbuat dari ekstrat tomat lebih umum digunakan untuk isolasi Lactobacillus, namun agar ini
kurang selektif dan terdapat banyak kontaminan. Pada tahun 1951, Rogosa berhasil
mengembangkan medium baru untuk isolasi Lactobacillus yang disebut agar LBS. Agar LBS
dapat digunakan untuk isolasi Lactobacillus yang diambil dari pencernaan makhluk hidup,
mulut, permukaan gigi, vagina, dan produk-produk makanan seperti daging. Agar LBS ini
mengandung : 10 gram tripton, 5 g ekstrak yeast, 6 g kalium dihidrogen fosfat, 2 g amonium
sitrat, 5 mL larutan garam, 20 g glukosa, 1 g tween 80, 25 g natrium asetat hidrat, 1,32 mL
asam asetat, 15 g agar, air suling hingga 1 L. pH keseluruhan dari medium ini adalah 5,4.
Larutan garam terdiri dari 11,5 g magnesium fosfat hepta-hidrat; 2,8 g mangan sulfat tetrahidrat; 0,68 g ferro sulfat hepta-hidrat dan air suling hingga 100 mL (Rogosa, Mitchell, &
Wiseman, 1951). Data komposisi bakteri probiotik pada feses sebelum dan setelah pemberian
inulin dapat dilihat pada Tabel 1. Pada data tersebut, populasi Lactobacillus meningkat secara
signifikan pada pemberian inulin (p = 0,020) (Kim, Lee, & Meyer, 2007).
Upaya pengembangan…, Monica Sinatra Orrouw, FF UI, 2013
Tabel 1. Jumlah bakteri pada feses. Data disajikan dalam satuan log koloni yang tumbuh per
gram feses dengan standar deviasi tertera dalam tanda kurung
Populasi Kelompok
Populasi Kelompok
Inulin
Kontrol
Lactobacillus
9,09 (0,377)
8,61 (0,741)
Bacteroides
9,51 (0,389)
9,40 (0,344)
Bifidobacterium
9,85 (0,523)
9,22 (0,741)
Total bakteri anaerob
10,58 (0,224)
10,27 (0,344)
Bakteri
Sumber : Kim, Lee, & Meyer, 2007 (telah diolah kembali)
Penelitian serupa pernah dilakukan oleh Boehm dkk. (2002) pada 15 bayi yang diberi
suplemen galaktooligosakarida dan fruktooligosakarida dengan perbandingan 9:1 selama 28
hari. Kelompok ini dibandingkan dengan kelompok kontrol yang mengonsumsi maltodekstrin
dan kelompok yang mengonsumsi ASI. Dilakukan analisis mikrobiologis dengan
pengkulturan pada medium Rogosa agar (LBS) di hari ke-1, 7, 14, dan 28. Populasi bakteri
Lactobacillus mengalami peningkatan signifikan pada semua kelompok subyek (Boehm et
al., 2002). Selain itu penelitian serupa dilakukan oleh Moro dkk. (2002) dengan kelompok
perlakuan yang mengonsumsi 0,4 g/dL atau 0,8 g/dL oligosakarida dan kelompok plasebo
yang mengonsumsi maltodekstrin. Hasil penelitian ini menunjukan bahwa terjadi peningkatan
signifikan pada populasi Lactobacillus pada kelompok perlakuan dibandingkan dengan
plasebo (Moro et al., 2002).
Medium spesifik Lactobacillus umumnya menyediakan kondisi pertumbuhan yang
selektif untuk Lactobacillus dengan pH asam (pH ± 5,5) sehingga bakteri yang tidak tahan
asam akan sulit tumbuh. Namun hal ini tidak menutup kemungkinan bakteri tahan asam
seperti Bifidobacteria, Streptococcus, dan Enterococcus dapat tumbuh pada kondisi tersebut.
Sebagai contoh, medium LBS atau Rogosa memiliki tingkat kesalahan sebesar 96% dimana
sebagian besar koloni yang tumbuh bukan Lactobacillus (Hartemink, 1997). Selain itu,
penelitian yang dilakukan oleh Jackson dkk (2002) menunjukkan hasil serupa. Pada salah
satu subyeknya tidak ditemukan adanya Lactobacillus pada koloni-koloni yang tumbuh.
Pada penelitian Kim dkk. (2007), Boehm dkk (2002), dan Moro dkk. (2002) hanya
digunakan pengkulturan pada medium spesifik dan perhitungan koloni tanpa metode
konfirmasi baik secara molekuler maupun konvensional sehingga koloni-koloni bakteri yang
tumbuh tidak dapat dipastikan sebagai Lactobacillus. Seharusnya perlu dilakukan identifikasi
Upaya pengembangan…, Monica Sinatra Orrouw, FF UI, 2013
konvensional dengan pengamatan morfologi koloni, morfologi sel dengan bantuan
mikroskop, teknik pewarnaan Gram, motilitas, seleksi medium, seleksi nutrisi, tes biokimia,
penentuan komponen kimiawi, dan sebagainya (Perry & Stakey, 1997). Teknik pewarnaan
Gram merupakan metode yang paling mudah dan cepat. Teknik ini mengelompokkan bakteri
menjadi dua kelompok besar, yaitu bakteri gram positif dan gram negatif. Pengelompokan ini
berdasarkan komposisi atau struktur dinding sel bakteri dan permeabilitas membran sel
terhadap pelarut organik yang digunakan (Johnson, Thatcher, & Cox, 1995; Steinbach &
Shetty, 2001). Namun metode identifikasi bakteri secara konvensional seperti morfologi dan
reaksi biokimiawi tidak cukup selektif untuk membedakan galur bakteri karena sangat
dipengaruhi oleh faktor-faktor fisiologis dan operator sehingga perlu dilakukan identifikasi
pendahuluan atau konfirmasi dengan metode molekuler (Nester, 2001).
Analisis Menggunakan Metode Molekuler
Fluorescence In Situ Hybridisation (FISH)
Dewasa ini telah dikembangkan metode baru dalam pengujian efek prebiotik karena
metode pengkulturan dan penghitungan koloni bakteri sulit untuk dilakukan dan memiliki
faktor kesalahan yang tinggi (Gibson, 2004). Metode tersebut adalah metodologi
mikrobiologi berdasarkan molekul menggunakan fluorescence in situ hybridisation (FISH).
Teknik ini dilakukan dengan pemeriksaan terhadap oligonukleotida spesifik yang terdapat
pada molekul rRNA bakteri. Oligonukleotida ini sangat spesifik pada golongan atau spesies
bakteri tertentu sehingga dapat digunakan sebagai pengenal bagi spesies bakteri (Gibson,
2004). Penelitian yang pernah dilakukan oleh Harmsen dkk. (2000) menggunakan metode
pengkulturan pada medium selektif kemudian koloni yang tumbuh diidentifikasi dengan
metode FISH. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa medium spesifik memiliki selektivitas
kurang baik sehingga hasil yang diperoleh tidak sahih sehingga dibutuhkan metode
konfirmasi dengan FISH (Harmsen et al, 2000).
Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)
Prinsip DGGE adalah memisahkan fragmen-fragmen DNA berdasarkan perbedaan
ukuran produk hasil amplifikasi atau amplikon (Gibson, 2004). Pemisahan tersebut terjadi
akibat penurunan mobilitas molekul DNA utas ganda yang mengalami peleburan parsial pada
gel poliakrilamid yang mengandung senyawa kimia pendenaturasi. Identifikasi dilakukan
dengan mengekstraksi fragmen DNA dari gel untuk kemudian disekuensing dan dicocokan
dengan sekuens pada database. Selain itu identifikasi dapat pula dilakukan dengan
Upaya pengembangan…, Monica Sinatra Orrouw, FF UI, 2013
membandingkan motilitas DNA sampel dengan DNA kontrol (Gibson, 2004). Analisis
pertumbuhan bakteri probiotik pada feses bayi dengan metode molekuler pernah dilakukan
oleh Favier dkk. (2002). Namun penelitian ini tidak bertujuan untuk mengetahui efek
prebiotik dari inulin melainkan untuk mengetahui efektivitas metode PCR dan DGGE dalam
analisis komponen bakteri usus. Pada penelitian tersebut digunakan dua bayi sebagai subyek
dan analisis dilakukan dengan metode PCR dan DGGE. Hasil penelitian ini menunjukkan
keragaman mikroba dari sampel feses namun tidak dapat digunakan sebagai analisis
kuantitatif (Favier et al, 2002).
Polymerase Chain Reaction (PCR)
Metode ini merupakan metode identifikasi berdasarkan gen-gen yang mengkode
subunit 16S pada ribosom bakteri. Penggunaan sekuen gen 16S rRNA merupakan metode
paling umum untuk mempelajari genetik suatu organisme. Hal ini dikarenakan sekuen gen
tersebut terdapat pada hampir semua bakteri yang ada, ukuran gen 16S rRNA (1500 pb)
cukup besar untuk kepentingan informasi genetik, fungsi gen 16S rRNA sedikit berubah
dalam waktu tertentu sehingga informasi yang disajikan lebih akurat, dan merupakan unit
yang konstan dan sensitif karena terdapat dalam jumlah besar pada sel aktif (Janda & Abbott,
2007). Segmen gen ini diamplifikasi dan diurutkan kemudian dicocokan dengan sekuens
yang terdapat pada GenBank (Gibson, 2004). Teknik PCR menggunakan primer komplemen
sintetik untuk mengamplifikasi gen penyandi 16S rRNA. Amplifikasi ini dilakukan dengan
alat thermal cycler. DNA hasil amplifikasi kemudian disekuensing dengan bantuan sequencer
(Nester, 2001). Hasil perunutan basa DNA atau sekuensing ini kemudian dapat dicocokan
pada sekuens yang terdaftar pada GenBank dengan program BLAST sehingga dapat
diketahui spesies dari bakteri tersebut. Metode molekuler ini memiliki ketepatan yang tinggi
karena spesifik pada setiap spesies.
PCR Sequencing Total DNA
Metode ini dapat digunakan terhadap bakteri yang dapat dikultur maupun tidak.
Prinsipnya adalah membedakan bakteri berdasarkan keragaman 16S rRNA. Total DNA
bakteri dari sampel feses diekstraksi kemudian sebagian dari gen 16S rDNA tersebut
diamplifikasi dengan PCR menggunakan primer universal. Hasil amplifikasi dimurnikan
kemudian dilakukan pengklonaan pada E. coli. Selanjutnya, klon yang mengandung 16S
rDNA desekuensing dan diidentifikasi berdasarkan kecocokan dengan sekuens yang terdapat
GenBank (Gibson et al, 2004).
Upaya pengembangan…, Monica Sinatra Orrouw, FF UI, 2013
Tabel 2. Perbandingan Metode Analisis Aktivitas Prebiotik Inulin
Metode
Kelebihan
Kelemahan
Memiliki
faktor
kesalahan
operator yang tinggi, hanya
dapat digunakan pada bakteri
Pengkulturan pada
Murah
medium selektif
dan
mudah
untuk
yang
mudah
tunbuh
(dikultur), bergantung pada
dilakukan
selektifitas medium, dan hasil
metabolit
bakteri
dapat
mempengaruhi kultur
Hanya dapat digunakan untuk
Fluorescence in situ
hybridisation (FISH)
Dapat digunakan pada bakteri
yang tidak dapat/sulit dikultur.
Memiliki spesifitas tinggi
bakteri yang telah diketahui
spesiesnya,
waktu
membutuhkan
lebih
dibandingkan
lama
metode
pengkulturan
Memiliki
PCR
keakuratan
tinggi
Mahal
dan
membutuhkan
dan dapat digunakan pada
waktu
lebih
lama.
Dapat
bakteri
terjadi
bias
saat
proses
yang
tidak
dapat
dikultur
Tidak
PCR Sequencing Total
DNA
amplifikasi
membutuhkan
pengkulturan terlebih dahulu
Dapat terjadi bias pada proses
dan dapat digunakan untuk
PCR sehingga menurunkan
keragaman
tingkat keragaman
mikrobiologi
sampel
Metode kualitatif dan sulit
Denaturing Gradient Gel
Cepat dan dapat digunakan
Electrophoresis (DGGE)
pada
bakteri
yang
dikultur maupun tidak
dapat
digunakan
untuk
tujuan
kuantitatif, dapat terjadi bias
pada proses PCR sehingga
menurunkan
keragaman
Sumber : Gibson et al., 2004 (telah diolah kembali)
Upaya pengembangan…, Monica Sinatra Orrouw, FF UI, 2013
tingkat
Penutup
Efek prebiotik dari inulin dapat diketahui dengan melakukan analisis bakteri probiotik
secara kuantitatif dan kualitatif menggunakan bakteri Lactobacillus sebagai kontrol. Analisis
kuantitatif umumnya dilakukan dengan pengkulturan medium spesifik dan perhitungan
koloni. Namun cara ini memiliki tingkat kesalahan yang tinggi sehingga perlu dilengkapi
dengan metode kualitatif sebagai konfirmasi identitas bakteri yang berhasil tumbuh. Metode
kualitatif ini dapat dilakukan secara konvensional maupun molekuler. Metode molekuler
yang lazim digunakan antara lain PCR, DGGE, atau FISH, sebagaimana yang telah banyak
dilaporkan. Kombinasi kedua metode memberikan gambaran yang lebih akurat pada analisis
probiotik Lactobacillus pada sampel feses balita.
KEPUSTAKAAN
Roberfroid, M. (2007). Inulin-Type Fructans : Functional Food Ingredients. The Journal of
Nutrition, 137, 11, 2493.
DebMandal, M., Mandal, S., Pal, N.K. (2012). Detection of Intestinal Colonization of
Probiotic Lactobacillus rhamnosus by Stool Culture in Modified Selective Media.
Asian Pacific Journal of Tropical Disease, 205-210.
Vyas, U., Ranganathan, N. (2012). Probiotics, Prebiotics, and Synbiotics: Gut and Beyond.
Gastroenterology Research and Practice, 2012, 16.
Mugambi, M., Musekiwa, A., Lombard, M., Young, T., Blaauw, R. (2012). Synbiotics,
Probiotics or Prebiotics in Infant Formula for Full Term Infants : A Systematic
Review. Nutrition Journal, 11, 81.
Kim, S., Lee, D., Meyer, D. (2007). Supplementation of Infant Formula with Native Inulin
Has A Prebiotic Effect In Formula-fed Babies. Asia Pacifif Journal of Clinical
Nutrition, 16, 1, 172-177.
Lebeer, S., Vanderleyden, J., De Keersmaecker, S.C.J. (2008). Genes and Molecules of
Lactobacilli Supporting Probiotic Action. Microbiology and Molecular Biology
Reviews, 2008, 728-764.
Kaur, N., Gupta, A. (2002). Applications of Inulin and Oligofructose in Healh and Nutrition.
Journal of Bioscience, 27, 7, 703-714.
Kelly, G. (2008). Inulin Type Prebiotics : A Review – Part 1. Alternative Medicine Review,
13, 4.
Roberfroid, M. (2006). Introducing Inulin-Type Fructans. British Journal of Nutrition, 93, 1,
13-25.
Urashima, T., Asakuma, S., Leo, F., Fukuda, K., Messer, M., Oftedal, O.T. (2012). The
Predominance of Type I Oligosaccharides is A Feature Specific to Human Breast
Milk. American Society of Nutrition : Nutrition, 3, 473 – 482.
Gibson, G., Probert, H.M., Van Loo, J., Rastall, R.A., Roberfroid, M.B. (2004). Dietary
Modulation of The Human Colonic Microbiota : Updating The Concept Of
Prebiotics. Nutrition Research Review, 17. Pg. 259-275.
Nelson, G.M., George, S.E. (1995). Comparison of Media for Selection and Enumeration of
Mouse Fecal Flora Populations. Journal of Microbiological Methods, 293-300.
Upaya pengembangan…, Monica Sinatra Orrouw, FF UI, 2013
Rogosa, M., Mitchell, J., Wiseman, R. (1951). A Selective Medium for The Isolation and
Enumeration of Oral and Fecal Lactobacilli. Journal of Bacteriology, 62, 132.
Gilliland, S.E., Speck, M.L., Morgan, C.G. (1975). Detection of Lactobacillus acidophilus in
Feces of Humans,Pigs, and Chickens. American Society of Microbiology : Applied
Microbiology, 30,4, 541-545.
Hartemink, R., Domenech, V.R., Rombouts, F.M. (1997). LAMVAB : A New Selective
Medium for The Isolation of Lactobacilli from Faeces. Journal of Microbiological
Methods, 29, 77 – 84.
Jackson, M., Bird, A., McOrist, A. (2002). Comparison of two selective media for the
detection and enumeration of Lactobacilli in human faeces. Journal of
Microbiological Methods, 51, 313-321.
Perry, J.J., Stakey, J.T. (1997). Microbiology Dynamic and Diversity. USA: Sauders College
Publishing. 479-486, 680-681, 864-867.
Johnson, M.J., Thatcher, E., Cox, M.E. (1995). Techniques for Controlling Variability in
Gram Staining of Obligat Anaerobes. Journal of Clinical Microbiology, 33, 3, 755758.
Steinbach, W., Shetty, A. (2001). Use of The Diagnostic Bacteriology Laboratory: A
Practical Review for The Clinician. Postgrad Medical Journal,77, 148–156.
Nester, E.W., Anderson, D.G., Robert Jr., C. (2001). Microbiology A Human Perspective.
New York : McGraw Hill Companies Inc. Hal : 235-241.
Janda, J.M., Abbott, S.L. (2007). 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Identification in
the Diagnostic Laboratory: Pluses, Perils, and Pitfalls. Journal of Clinical
Microbiology,45, 9, 2761-2764.
Favier,C.F., Vaughan, E.E., De Vos, W.M., Akkermans, A.D.L. (2001). Molecular
Monitoring of Succession of Bacterial Communities in Human Neonates. Applied
and Environmental Microbiology,68,1,219-226.
Moro, G., Minoli, I., Mosca, M., Fanaro, S., Jelinek, J., Stahl, B., Boehm, G. (2002). Dosagerelated bifidogenic effects of galacto and fructooligosaccharides in formula-fed term
infants. J Pediatr Gastroenterol Nutr, 34: 291-295.
Harmsen, H.J.M., Wildeboer-Veloo, A.C.M., Raangs, G.C., Wagendorp, A.A., Klein, N.,
Bindels, J.G., Welling, G.W. (2000). Analysis of intestinal flora development in
breast-fed and formula-fed infants by using molecular identification and detection
methods. J Pediatr Gastroenterol Nutr, 30: 61-67.
Feliatra, Efendi, I., Suryadi, E. (2004). Isolasi dan Identifikasi Bakteri Probiotik dari Ikan
Kerapu Macan (Ephinephelus fuscogatus) dalam Upaya Efisiensi Pakan Ikan. Jurnal
Natur Indonesia, 6, 2, 75-80.
Upaya pengembangan…, Monica Sinatra Orrouw, FF UI, 2013