Marker-Set Untuk Uji Keturunan dan Identitas

Media Kedokteran Hewan
Vol. 23, No. 3, September 2007
Marker-Set Untuk Uji Keturunan dan Identitas Ternak pada Babi
dengan Analisa Mikrosatelit
Marker-Sets For Paternity And Identity Test in Pigs by Means
Microsatellite Analysis
Siti Darodjah Rasad
Laboratorium Reproduksi Ternak, Fakultas Peternakan UNPAD
Kampus Jatinangor, Bandung 40600. Tel. 022 -7798341, Fax. 022-7798212
e-mail : [email protected]
Abstract
The aim of this study was to establish an optimal marker set for a routine paternity and
identity test. In the present work a paternit y and identity test within three pig breeds (DE, DL and Pi)
was performed by means of microsatellite analysis. Genotyping of the animals was done after PCR
amplification of the alleles on an automated DNA sequencer (LI -COR, DNA Analyzer, GENE READIR
4200 (MWG BIOTECH). For the examination of the applicability of the microsatellite markers in
paternity test, the exclusion probabilities and Polymorphism Information Co ntents (PICs) were
calculated. Combined exclusion probability over 99 % has been achieved i n all breeds by using 8
microsatellites. Fifteen of the 25 loci were selected and a group of 5 loci were packed together in three
multiplex-PCRs as possible marker sets for a paternity and identity test in pig.
Key words: Pig, Paternity and Identity Test, Microsatellite analysis

Pendahuluan
Identifikasi kemurnian suatu jenis ternak serta
kepastian dalam uji keturunan ( progeny test) merupakan salah satu aspek yang perlu diperhatikan dalam
bidang peternakan. Uji keturuna n satu bangsa ternak
diharapkan dapat dilaksanakan secara berkala. Proses
ini diperlukan guna meningkatkan aspek genetik bagi
generasi selanjutnya. Sebagai contoh pada ternak
babi, kontrol pengujian keturunan serta kekerabatan
antar bangsa telah berhasil dilaksanakan melalui
sistem golongan darah (Groenen et al., 2003).
Pada metode ini, masih ditemukan adanya
kendala, antara lain diperlukannya sampel darah
segar yang dalam pengambilannya membe rikan
dampak stress pada ternak, yang dapat memberikan
efek tidak menguntungkan bagi ternak. Dalam
rangka mengurangi kendala tersebut di atas, dapat
diterapkan teknik lain yaitu dengan analisa DNA.
Uji keturunan dengan melihat pola DNA dari satu
bangsa ternak dapat memberikan tingkat ketepatan
yang tinggi (Exclusion Probability/EXP 99,9%) dan
dapat pula digunakan dalam rangka identifikasi
ternak.
169
Keuntungan analisa DNA dibandingkan dengan
sistem golongan darah adalah: Tingkat ketepatan
yang tinggi (EXP 99,9%), diperlukan sampel yang
sedikit (jaringan, sperma atau f olikel rambut),
memungkinkan semua ternak sebagai sampel tanpa
memperhatikan faktor umur, serta memungkinkan
sampel dari ternak yang telah mati. Analisa ini juga
memungkinkan untuk identifkasi produk hasil ternak
seperti daging (Hohenhörst et al.,1994; Lauk, 1999).
Salah satu analisa DNA untuk uji keturunan serta
kontrol identitas ternak adalah analisa Mikrosatelit.
Mikrosatelit adalah urutan DNA dalam genom
yang mempunyai sifat berulang ( Short Tandem
Repeat/STR) dengan tingkat variasi yang tinggi
(Polymorph), yang dengan bantuan PCR ( Polymerase
Chain Reaction) dapat diamplifikasi. Mikrosatelit terdiri dari 1–6 Nukleotid yang berulang, dengan urutan
pengulangan CA merupakan urutan DNA yang paling
sering ditemukan pada ternak menyusui (Tautz dan
Renz, 1984). Analisa Mikrosatelit ini untuk pertama
kali ditemukan oleh Hamada et al. (1982), Nordheim
dan Rich (1983). Selanjutnya Baumung et al. (2004)
menyatakan bahwa penggunaaan mikrosateli t
Rasad; Marker-Set Untuk Uji Keturunan dan Identitas Ternak pada Babi dengan …
merupakan metode standar untuk menduga
keragaman genetik (genetic diversity) pada ternak. Hal
ini diperkuat oleh hasil penelitian Arranz et al. (2001),
Diez-Tascon et al. (2000), Rendo et al. (2004), Alvarez
et al. (2004) yang telah melakukan analisa mikrosatelit
pada sekelompok kecil ternak kambing. Pada babi,
mikrosatelit sudah sering digunakan pada penelitian
biodiversitas baik pada bangsa komersial maupun
bangsa yang masih liar (Groenen et al., 2003).
Analisa Mikrosatelit kini telah secara r utin
digunakan dalam uji keturunan pada ternak s api,
anjing dan kuda (Alford et al., 1994; Marklund et al.,
1994; Binns et al., 1995; Glowatski-Mullis et al., 1995;
Hussein et al., 1996; Fredholm et al., 1993; Bowling et
al., 1997; Wimmers et al., 1998), sedangkan pada
ayam, analisa genotipik dengan analisa mikrosatelit
telah berhasil dilakukan dengan cara analisa pool
DNA (Groenen et al., 2003). Pada manusia, analisa
Mikrosatelit juga telah umum dilakukan untuk uji
keturunan (Father Test) dan dalam bidang krimi nalitas seperti kasus pe merkosaan atau pembunuhan
sebagai pengganti uji sidik jari. Hanotte dan Jianlin
(2005) dari International Livestock Research Institute
(ILRI) Nairobi menyatakan bahwa marker genetik
dapat membuktikan tentang berbagai
informasi
perbedaan-perbedaan tipe yang dapat digunakan
dalam proses konservasi te rnak. Autosal mikrosatelit
loci sudah umum digunakan untuk identifikasi
genetik secara individu dan untuk analisa kekeraba tan. Dengan sifat mikros atelit loci yang sangat
sensitif, maka analisa dapat juga digunakan untuk
pendugaan inbreeding pada ternak.
Metode Penelitian
Sebagai bahan penelitian telah digunakan 39 –48
ekor ternak Babi dari bangsa DE ( Deutsche edelschwein),
DL (Deutsche landrasse) dan Pi (Pietrain). Sampel
jaringan didapatkan dari Rumah Potong Hewan
(RPH) berupa satu potong jaringan yang berasal dari
telinga saat pemberian nomor ternak serta sedikit
sampel rambut. Sampel diambil dari beber apa peternakan babi di bawah koordinasi Koperasi di wilayah
Nord-West Jerman (Schweinezuchtverband Nord-West
Deutschland). Sebagai bahan analisa, dig unakan 25
Mikrosatelit marker, yang merupakan sa tu set marker
bantuan dari INRA–Toulous Perancis dalam rangka
menunjang proyek evaluasi bangsa babi Eropa.
Mikrosatelit marker tersebut di atas telah di analisa
pada genom ternak babi dan terbukti sangat Poly morph dan sangat jarang menunjukkan Null Allel.
Analisa laboratorium yang digunakan adalah
berupa isolasi DNA, Ampli fikasi Mikrosatelit enloci
dilakukan dengan bantuan Polymerase-Chain-Reaction
(PCR), Pemisahan hasil pr oduk PCR dilakukan
dengan menggunakan alat automatik sequence (LI-
COR, DNA Analyzer, GENE READIR 4200, MWG BIOTECH) pada suatu Polyacrylamidgel. Untuk penentuan panjang pasangan basa dari hasil gel Elektro phoresa (pita) dilakukan dengan menggunakan
Software One-Dscan (Scanalytics, A Division of CSPI,
USA).
Untuk analisa tingkat Polymorph serta melihat
perbedaan antar populasi dan individu dilakukan
penghitungan nilai PIC ( Polymorphic Information
Content), sedangkan untuk menguji apakah mikrosa telit tersebut dapat digunakan sebagai marke r dalam
uji keturunan dan identitas ternak dilakukan peng hitungan EXP (Exclusion Probability) dan kombinasi
EXP (cEXP) (Botstein et al., 1980).
Hasil dan Pembahasan
Sebanyak 25 Mikrosatelit marker berhasil di
analisa 133 ternak babi dengan menghasilkan 3054
Genotyp dengan jumlah allel yang dapat diidentifikasi
dari ke tiga bangsa babi tersebut adalah antara 3 –16
allel dengan rataan 6 allel per lokus dan bervariasi
antar bangsa 5,88 (Pi) dan 6,92 (DL) dan 6,44 (DE).
Pada lokus S0215 pada semua bang sa menunjukkan
jumlah Allel yang rendah. Untuk setiap bangsa yang
diteliti ditemukan allel spesifik yang sangat berperan
dalam identifikasi ternak. A danya keragaman allel
yang ditemukan pada setiap bangsa ternak yang
diteliti maka dapat mencerminkan ident itas dari
setiap bangsa tersebut.
Untuk nilai PIC (Polymorphism Information
Content) menunjukkan bahwa pada bangsa Pi 30 % (8
Mikrosatelit) memberikan nilai PIC lebih kecil dari
0,50. Pada ke dua bangsa lain (DE dan DL) hanya
sedikit yang menunjukkan nila i PIC di bawah 0,50
(DE 4 Loci dan DL 2 Loci). Nilai PIC tersebut erat
kaitannya dengan jumlah allel yang ditemukan dalam
setiap lokus, makin banyak allel yang ditemukan
dalam suatu lokus dalam satu populasi ternak, maka
semakin tinggi nilai PIC dan semakin informatif
lokus tersebut. Hal ini juga berlaku untuk nilai EXP.
Pada penelitian ini dihasilkan nilai EXP antara 26,4 %
dan 80,3 % (DE antara 29,6 % dan 74,7 %; DL antara
25,4 % dan 77,6 % dan Pi antara 15,1 % dan 72,9 %).
Untuk memilih 15 Mikrosatel it dari 25 Marker
yang ditest, yang dapat digunakan secara rutin untuk
uji keturunan dan identitas ternak yang sesuai
dengan ke tiga bangsa yang diteliti, setiap loci di
antara bangsa atau populasi dengan didasarkan atas
rataan nilai PIC dilakukan proses r anking. Makin
kecil jumlah rangking satu Mikrosatelit, makin
informatif Mikrosatelit tersebut untuk ke tiga bangsa
yang diteliti.
Selanjutnya berdasarkan kombinasi Mikrosatelit
yang paling informatif, dilakukan penghitungan
Exclusion Probability (EXP). Pada penelitian ini ternyata,
170
Media Kedokteran Hewan
Vol. 23, No. 3, September 2007
dengan kombinasi 7 Mikrosatelit t elah dicapai nilai
EXP 99,9%. Ini berarti dalam uji keturunan tersebut
99,9% keturunan (anak) benar -benar berasal dari
tetua yang telah diuji. Dalam hal ini 99,9% pola allel
dan urutan nukleotida yang ditemukan pada anak
berasal dari tetuanya.
Dari hasil penghitungan nilai PIC dan EXP
maka dilakukan test kombinasi marker se t yang
dapat digunakan secara r utin untuk uji keturunan
dan identitas ternak dalam hal ini ternak b abi, seperti
tertera pada Tabel 1.
Dari Tabel 1 telah ditunjukkan tiga macam
Mikrosatelit-set yang dapat digunakan secara rutin
dalam uji keturunan dan identitas ternak.
Mikrosatelit-set ini telah diuji kembali pada sampel
ternak yang terdiri dari sampel DNA yang berasal
dari satu bapak, induk dan anak. Sebagai contoh juga
telah ditest dengan menggunakan sampel DNA yang
bukan berasal dari bapak dan induk tertentu.
Penggunaan analisa mikroastelit di Indonesia
sudah mulai dilakukan, sebagai contoh seperti yang
tengah dilakukan oleh I Ketut Puja dari Fakultas
Kedokteran Hewan Universitas Udayana yang telah
mengusulkan rencana penelitiannya untuk penelitian
fundamental dan akan meneliti mengenai Profil
genetik lokus mikrosatelit, sebagai penciri khusus
kambing Gembrong di Karangasem Bali.
Pada penelitian ini data tentang Polimorfisme
genetik kambing Gembrong diukur dengan rataan
heterosigositas (H) yang dihitung untuk semua lokus.
Derajat deferensiasi genetik dihitung dengan
menggunakan penduga F ST (Hartl dan Clark,1997).
Aliran genetik dihitung memakai model pulau
(Avise,1994).
Hasil penelitian Winaya (2000) yang melakukan
penelitian pada 16 lokus DNA mikrosatelit pada sapi
Bali dan menemukan keragaman pada sebagian besar
lokus DNA mikrosatelit tersebut. Sementara itu,
lokus DNA Mikrosatelit HEL9 pada sapi Bali adalah
monomorfik, sedangkan pada bangsa sapi lain
(Madura, PO dan Brangus) adalah polimorfik
(Handiwirawan dan Subandriyo, 2004). Dengan
demikian analisa mikrosatelit telah banyak dilakukan
juga di Indonesia, hal tersebut disebabkan analisa
tersebut tidak dipengaruhi oleh bangsa ternak yang
akan diteliti demikian juga lokasi dimana sampel
diperoleh.
Kesimpulan
Dari hasil penelitian tersebut di atas dapat
ditarik kesimpulan sebagai berikut: 1) Analisa
Mikrosatelit dapat diterapkan untuk uji keturunan
dan identitas ternak; 2) Dari hasil penghitungan nilai
PIC dan EXP dapat ditentukan tiga macam
Mikrosatelit-Set yang dapat digunakan secara rutin
dalam rangka uji keturunan dan identitas ternak,
dalam hal ini pada ternak babi .
Daftar Pustaka
Alford RB, Hammond HA, Coto I, and Caskey CT.
1994. Rapid and
efficient resolution of
parentage by amplification of short tandem
repeats. Am J Hum Genet. 55: 190 -195.
Alvarez I, Royo LJ, Fernandez I, Gutierez JP, Gomez
E, and Goyache F. 2004. Genetic relationships
and admixture among sheep breeds from
Northern Spain assessed using microsatellites.
Journal of Animal Science. 82: 2246-2252.
Arranz JJ, Bayon Y, and Primotivo FS. 2001.
Differentiation among Spanish sheep breeds
using microsatellites. Genetics Selection Evoluti on. 33: 529-542.
Avise JC. 1994. Molecular Markers. Natural History
and Evolution. Chapman and Hall. Inc.New
York.
Tabel 1. Mikrosatelit-Set dengan Nilai cEXP
Set
Mikrosatelit
DE
DL
Cesp
Pi
All
1
SW936
SW857
S0115
CGA
S0068
0,987
0,995
0,978
0,997
2
SW240
S0101
S0355
SW122
SW911
0,969
0,970
0,985
0,996
3
S0026
SW951
S0225
S0227
S0178
0,905
0,965
0,895
0,979
> 0,99
> 0,99
> 0,99
> 0,99
Total
Keterangan : DE : Deutsche edelschwein; DL : Deutsche landrasse; Pi : Pietrain
171
Rasad; Marker-Set Untuk Uji Keturunan dan Identitas Ternak pada Babi dengan …
Baumung R, Siminier H, and Hoffmann I. 2004.
Genetic diversity studies in farm animals – a
survey. Journal of A nimal Breeding and
Genetics. 121: 361-373.
Hanotte O, and Jianlin H. 2005. Genetic characterization of livestock populations and its use in
conservation decision making. International Livestock Research Institute (ILRI) Nairobi . 131-136
Binns MM, Holmes NG, Holliman A, and Scott AM.
1995. The identification of polymorphic
microsatellite loci in the horse and heir use in
thoroughbred parentage testing. British Vet J.
151: 9-15.
Hartl DL, and Clark AG. 1997. Principles of
Population Genetics. 3 rd ed.Sinauer Associates.
Inc.Publishers. Sunderland. Massachusetts.
Botstein D, White RL, Skolnick M, and Davis RW.
1980. Construction of a genetic linkage map
using restriction fragment length polymor phism. Am J Hum Genet. 32: 314-331.
Bowling AT, Eggleston ML, Byrns G, Clark RS, and
de Leanis S, Wictum E. 1997. Validation of
microsatellite markers for routine horse
parentage testing. Anim Genet. 28: 247- 252.
Diez-Tascon C, Littlejohn RP, Almeida PA, and
Crawford AM. 2000. Genetic variation within
the Merino sheep breeds: analysis of closely
related populations using microsatellites.
Animal Genetics. 31: 243-251.
Fredholm M, Wintero AK, Christensen K, Kristensen
B, Nielsen PB, Davies W, and Archibald A. 1993.
Characterization of 24 porcine (dA-dC)n-(dTdG)n microsatellites: genotyping of unrelated
animals from four breeds and linkage studies.
Mamm Genome. 4: 187-192.
Glowatski-Mullis ML, Gaillard C, Wigger G, Fries R.
1995. Microsatellite based parentage control in
cattle. Anim Genet. 26: 7-12.
Groenen MAM, Joosten R, Boscher MY, Amigues Y,
Rattink A, Harlizius B, van der Poel JJ, and
Crooijmans R. 2003. The use of microsatellite
gynotyping for populatio n studies in the pig
with individual and pooled DNA samples.
Arch. Zootech. 52: 145-155.
Hamada H, Petrino MG, and Kakunaga T. 1982. A
novel repeated element with Z-DNA forming
potential is widely found in evolutionary divers
eukaryotik genomes. Proc Natl Acad Sci, USA.
79: 6465-6469.
Handiwirawan E, dan Subandriyo. 2004. Potensi dan
keragaman sumberdaya genetik sapi Bali.
Wartazoa. 14(3): 50-60.
Hohenhörst J, Fries R, Vögeli P, and Stranzinger G.
1994. Use microsatellites for parentage control
in pigs. Anim Genet. 25 (Suppl.2): 33.
Hussein AA, Schmoll F, Führer F, Brem G,
Schellander K. 1996. Evaluation microsatellite
loci for use in simmental cattle parentage
control. J Vet Med. 43: 1-8.
Lauk C. 1999. Abstammungsbegutachtung bei Lamas
und Alpakas. Lamas: 8-9.
Marklund S, Ellegren H, Erikson S, Sandberg K, and
Anderson K. 1994. Parentage testing and
linkage analysis in the horse using a set of
highly polymorphic micr osatellite. Anim Genet.
25: 19-23.
Nordheim A, and Rich A. 1983. The sequence (dCdA)n (dG-dT)n forms left-hundred Z-DNA in
negatively supercoiled plasmid.
Proc. Natl
Acad Sci. USA. 80: 1821-1825.
Rendo F, Iriondo M, Jugo BM, Mazon LI, Aguirre A,
Vicario A, and Estonba A. 2004. Tracking
diversity and differentiation in six sheep
breeds from north Iberian Penninsula through
DNA variation. Small Ruminant Research . 52:
196-202.
Tautz D, and Renz, M. 1984. Simple sequences are
ubiquitous repetitive components of eukaryotic
genomes. Nucl Acids Res. 12: 389-399.
Winaya A. 2000. Penggunaan penanda molecular
mikrosatelit untuk deteksi polimorfisme dan
analisa filogenetik genom sapi. Program
Pascasarjana. Program Studi Bioteknologi.
Institut Pertanian Bogor.
Wimmers K, Ponsuksili S, Schmoll F, Hardge T,
Hatzipanagiotou A, Weber J, Woostmann S,
Olek K, and Schellander K. 1998. Effizienz von
mikrosatellitenmarkern
des internationalen
standards zur abstammungsbegutachtung in
deutschen pferdepopulationen. Züchtungskunde. 70: 233-241.
172