AKTIVITAS KOMPONEN ANTIBAKTERI

3 METODOLOGI
3.1 Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada Februari hingga Agustus 2011. Tempat
pelaksanaan penelitian adalah Laboratorium Bioteknologi Hasil Perairan dan
Laboratorium Mikrobiologi Hasil Perairan, Departemen Teknologi Hasil Perairan;
Laboratorium Molekular Bioteknologi, Departemen Budidaya Perairan, Fakultas
Perikanan dan Ilmu Kelautan; Unit Pelayanan Mikrobiologi Terpadu bagian
Mikrobiologi Medik, Departemen Ilmu Penyakit Hewan dan Kesehatan
Masyarakat Veteriner, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor.
3.2 Bahan dan Alat Penelitian
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian meliputi mikroalga
Porphyridium cruentum, air laut, media Becker (NaCl, MgSO4, MgCl2, CaCl2,
KNO3, KH2PO4, NaHCO3, Tris HCl, FeCl3 dan EDTA tanpa trace element),
media pupuk (NPK, TSP, vitamin, FeCl3 dan EDTA), etanol, diklorometan,
akuades, NaOH 0,5 N; HCl 8 N; NA (Nutrient Agar) dan NB (Nutrient broth),
MHA (Mueller Hinton Agar), antibiotik kloramfenikol, dan biakan bakteri
(Staphylococcus
aureus,
Staphylococcus
epidermidis,
Bacillus
subtilis,
Bacillus cereus, Escherichia coli). Mikroalga P. cruentum yang digunakan
diperoleh dari koleksi mikroalga Laboratorium Bioteknologi Teknologi Hasil
Perairan, Institut Pertanian Bogor.
Alat-alat yang digunakan, yaitu lampu UV, toples kaca, aerator, selang
plastik,
lemari
pendingin,
mikroskop, hemositometer, pipet
volumetrik,
mikropipet, refraktometer, magnetic stirer, rotary evaporator, sentrifuse, freeze
dryer, spektrofotometer, water bath shaker, jangka sorong, dan inkubator.
3.3 Metode Penelitian
Penelitian ini meliputi tiga tahap yaitu: 1) kultivasi dan pemanenan
P. cruentum dalam modifikasi media Becker dan media pupuk, 2) ekstraksi
komponen antibakteri P. cruentum, dan 3) uji aktivitas antibakteri P. cruentum
terhadap bakteri Gram-positif S. aureus, S. epidermidis, B. subtilis, B. cereus, dan
11
bakteri Gram-negatif yakni E. coli. Diagram alir pelaksanaan penelitian disajikan
pada Gambar 2.
Porphyridium cruentum
Kultivasi P. cruentum
Modifikasi Media Pupuk **
Modifikasi Media Becker *
Penentuan umur panen
Pemanenan
Sentrifugasi *
Biomassa
basah
Pengeringan menggunakan freeze dryer *
Biomassa
kering
Ekstraksi komponen antibakteri
Pengujian antibakteri pada bakteri uji
Gambar 2
Keterangan :
Diagram alir pelaksaan penelitian aktivitas antibakteri dari
Porphyridium cruentum (Kusmiyati dan Agustini 2007).
*
= Modifikasi penelitian Kusmiyati dan Agustini (2007)
** = Modifikasi penelitian Larastri (2006)
= Mulai dan akhir proses
= Proses
12
3.3.1 Kultivasi Porphyridium cruentum
P. cruentum dikultivasi menggunakan dua media berbeda, yaitu modifikasi
media Becker dan media pupuk. Media kultivasi dalam modifikasi media Becker
(Becker 1994), yaitu natrium klorida (27 g/L), magnesium sulfat heptahidrat
(6,6 g/L), magnesium klorida heksahidrat (5,6 g/L), kalsium klorida dihidrat
(1,5 g/L), kalium nitrat (1 g/L), kalium dihidrogen fosfat (0,07 g/L), natrium
bikarbonat (0,04 g/L), tris hidroklorida (20 mL/L), campuran larutan besi (III)
klorida dan etilen diamin tetra asetat (EDTA) dengan modifikasi tanpa
penambahan trace element. Media pupuk modifikasi Larastri (2006) yaitu NPK
(3 mL/L), TSP (1 mL/L), vitamin (1 mL/L), dan campuran larutan besi (III)
klorida dan etilen diamin tetra asetat (EDTA) (1 mL/L).
3.3.2 Perhitungan jumlah sel (Hadioetomo 1993)
Pertumbuhan P. cruentum diamati dengan mengambil sampel setiap hari
menggunakan
mikropipet,
kemudian
dimasukkan
ke
dalam
chamber
hemositometer dan dihitung jumlah sel secara langsung menggunakan mikroskop.
Hasil perhitungan nilainya dikonversikan ke dalam nilai logaritmik dan dibuat
kurva pertumbuhan dengan jumlah sel (logaritmik) sebagai sumbu y dan waktu
(hari) sebagai sumbu x. Proses perhitungan jumlah sel ini dengan metode hitung
langsung sebagai berikut :
1) Permukaan hitung hemositometer dan kaca penutup dibersihkan dari sisa
kotoran.
2) Tutup kaca hemositometer diletakkan pada permukaan hemositometer.
Suspensi biakan P. cruentum hasil pengambilan sampel dikocok, kemudian
diambil dengan mikropipet sebanyak 20 µL. Suspensi tersebut diteteskan pada
tempat menaruh sampel yang terdapat pada hemositometer hingga suspensi
P. cruentum menyebar pada ruang hitung.
3) Hemositometer diletakkan di atas pentas mikroskop. Jumlah sel yang terdapat
dalam 80 kotak kecil yang terletak dalam bagian tengah yang berukuran
0,2 mm-2 (5 x 16 x 0,0025 mm2) dihitung dengan mikroskop pada pembesaran
400 kali. Perhitungan jumlah sel dilakukan sebanyak 3 kali ulangan.
13
Formulasi yang dipakai dalam menghitung kepadatan sel adalah sebagai
berikut :
Keterangan :
N
= kepadatan sel (sel/mL)
N1
= jumlah sel dalam 80 kotak kecil ke-1
N2
= jumlah sel dalam 80 kotak kecil ke-2
1 mm = panjang hemositometer dalam 80 kotak
0,2 mm = lebar hemositometer dalam 80 kotak
0,1 mm = tinggi hemositometer dalam 80 kotak
Hasil perhitungan diplotkan pada grafik hingga diperoleh kurva pertumbuhan
dengan umur kultur (hari) sebagai sumbu x dan log kepadatan sel (sel/mL)
sebagai sumbu y.
3.3.3 Pemanenan biomassa (Kusmiyati dan Agustini 2007)
Pemanenan dilakukan pada fase awal stasioner dilihat dari masing-masing
kurva pertumbuhan. Pemanenan P. cruentum dilakukan dengan pengendapan
selama 10 hari di dalam lemari pendingin dengan suhu chilling 4 oC kemudian
disentrifugasi pada kecepatan 10000 rpm. Biomassa basah yang diperoleh
kemudian dikeringkan menggunakan freeze dryer selama 6 jam. Hasil dari proses
pengeringan ini diperoleh biomassa kering P. cruentum.
3.3.4
Ekstraksi senyawa antibakteri (Kusmiyati dan Agustini 2007, dan
Naviner et al. 1999)
Sejumlah 5 g biomassa mikroalga disuspensikan dalam 30 ml etanol 96%,
kemudian diaduk selama 30 menit dan disentrifugasi dengan kecepatan 4000 rpm
selama 15 menit. Pekerjaan tersebut diulangi 5 kali. Filtrat hasil sentrifugasi
dikumpulkan dan diuapkan menggunakan rotary evaporator pada suhu 37 ºC.
Residu ditambah 10 mL akuades dan 10 mL diklorometan. Lapisan akuades
ditambah 10 mL diklorometan dan dikocok. Pekerjaan ini dilakukan tiga kali.
Lapisan diklorometan dikumpulkan, kemudian dikeringkan dengan rotary
evaporator pada suhu 37 ºC (ekstrak A).
Ekstrak A dilarutkan dalam 53 mL diklorometan dan 21 mL NaOH 0,5 N
kemudian dikocok. Lapisan NaOH dipisahkan dan lapisan diklorometan ditambah
dengan 21 mL NaOH 0,5 N kemudian dikocok. Pekerjaan ini dilakukan lima kali.
14
Lapisan NaOH dinetralkan dengan HCl 8N. Larutan netral ini kemudian
ditambahkan dengan 20 mL diklorometan dan dikocok. Lapisan diklorometan
dipisahkan dan lapisan NaOH ditambah dengan 20 mL diklorometan lagi dan
dikocok. Pekerjaan ini dilakukan enam kali. Lapisan diklorometan yang telah
dipisahkan tadi, kemudian kumpulkan dan dikeringkan menggunakan rotary
evaporator pada suhu 37 ºC (ekstrak B). Ekstrak B inilah yang akan diuji aktivitas
antibakteri pada berbagai jenis bakteri patogen.
3.3.5 Analisis aktivitas antibakteri
Pengujian aktivitas antibakteri dari P. cruentum melalui beberapa tahap,
yaitu persiapan bakteri melalui peremajaan bakteri, pewarnaan Gram, dan
kultivasi bakteri uji. Kondisi kultur bakteri yang telah disiapkan sebagai bakteri
uji kemudian dilakukan pengujian aktivitas antibakteri menggunakan teknik difusi
sumur agar (agar well diffusion).
 Peremajaan bakteri uji
Media yang digunakan adalah NA (Nutrient Agar) dengan komposisi:
Ektrak daging 1%, pepton 1%, dan agar 1,5%. Media dilarutkan dalam akuades
dan dipanaskan hingga larut sempurna, lalu dimasukkan ke dalam tabung reaksi
sebanyak 4 mL dan disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 ºC, tekanan 1 atm
selama 15 menit. Setelah steril, tabung dimiringkan dan didiamkan hingga
memadat. Sejumlah 1 ose stok bakteri (S. aureus, S. epidermidis, B. subtilis,
B. cereus, dan E. coli) diinokulasi ke dalam media regenerasi kemudian
diinkubasi pada suhu 37 ºC selama 24 jam.
 Pewarnaan Gram (Hadioetomo 1993)
Pewarnaan Gram dilakukan untuk memastikan bentuk dan golongan
bakteri Gram-positif atau Gram-negatif sesuai dengan kriteria masing-masing
bakteri uji yang telah diketahui. Pewarnaan Gram dilakukan dengan pembuatan
olesan bakteri menggunakan air steril pada kaca preparat, kemudian 1 ose biakan
bakteri dioles hingga homogen lalu difiksasi menggunakan panas api bunsen.
Olesan bakteri kemudian ditambah kristal violet dan didiamkan 1 menit,
kemudian dibilas dengan akuades. Olesan bakteri ditambahkan lugol dan
didiamkan selama 2 menit lalu bilas akuades. Olesan tadi dibilas dengan ditetesi
alkohol lalu dibilas lagi dengan akuades. Safranin ditambahkan pada olesan
15
bakteri tadi lalu didiamkan selama 30 detik, kemudian bilas dengan akuades dan
keringkan. Hasil pewarnaan Gram kemudian diamati di bawah mikroskop.
 Kultivasi bakteri uji (Setyaningsih 2010)
Bakteri (S. aureus, S. epidermidis, B. subtilis, B. cereus, dan E. coli) yang
segar diinokulasikan sebanyak 1 ose ke dalam media NB, diinkubasi pada suhu
37 °C dalam water-bath shaker selama 18-24 jam. Kultur bakteri diukur
kekeruhannya secara turbidimetri dengan menggunakan spektrofotometer UVVIS pada panjang gelombang 600 nm hingga mencapai OD lebih dari 0,5.
 Pengujian aktivitas senyawa antibakteri P. cruentum terhadap bakteri uji
(Holo et al. 1991)
Pengujian dilakukan dengan menggunakan teknik difusi sumur agar (agar
well diffusion). Sampel antibakteri merupakan senyawa aktif hasil proses ekstraksi
bertingkat dari kultur mikroalga P. cruentum. Proses pengujian menggunakan
teknik difusi sumur agar (agar well diffusion) adalah sebagai berikut: bakteri
(S. aureus, S. epidermidis, B. subtilis, B. cereus, E. coli) yang telah disiapkan,
masing-masing dimasukkan ke dalam media MHA steril.
Media MHA yang mengandung bakteri uji dihomogenisasi menggunakan
vortex kemudian dituang pada cawan petri steril secara aseptis. Lapisan MHA
yang telah memadat kemudian dilubangi sebanyak 8 lubang, yakni untuk kontrol
positif, kontrol negatif, dan 3 konsentrasi ekstrak yang dilakukan secara duplo.
Konsentrasi ekstrak mikroalga P. cruentum dimasukkan ke dalam lubang
sebanyak
400 μg, 600 μg, dan 800 μg. Perlakuan kontrol positif yaitu
menggunakan antibiotika kloramfenikol dengan konsentrasi 10 μg. Kontrol
negatif menggunakan diklorometan yang merupakan pelarut dari ekstrak tersebut.
Cawan petri diinkubasi pada suhu 37 °C selama 24 jam, selanjutnya dilakukan
pengukuran zona hambatan yang terbentuk di sekeliling lubang menggunakan
jangka sorong.