Karakterisasi -Amilase dari Bakteri Laut Vibrio sp

3 Metode Penelitian
3.1.
Alat
Penelitian dilakukan di Laboratorium KBK Protein dan Enzim dan Laboratorium Biokimia,
Program Studi Kimia ITB. Peralatan gelas yang digunakan terdiri atas labu erlenmeyer, tabung
reaksi, batang pengaduk, gelas kimia, gelas ukur, cawan petri, labu takar, dan pipet tetes.
Peralatan lain yang digunakan adalah botol semprot, kawat ose, tabung sentrifuga 15 mL dan 50
mL, tabung Eppendorf 1,5 mL, pipet mikro (Eppendorf) dengan ukuran 1-10 μL, 10-100 μL,
100-1000 μL, kuvet 1 mL, dan stopwatch.
Sebelum digunakan, alat- alat gelas dan bahan disterilkan dengan menggunakan autoclave
(Portable Steam Sterilizer H 7101, China). Pekerjaan yang memerlukan kondisi aseptik,
misalnya pembuatan media dan inokulasi, dilakukan di ruang laminar flow (Oliphant, Ltd,
Australia) atau dilakukan di dekat nyala api.
Biakan sel padat media diinkubasi menggunakan incubator temperatur 30 °C (Griffin). Biakan
sel padat media cair diinkubasi dengan menggunakan shaker incubator (Dubnoff GCA). Bahanbahan kimia ditimbang dengan menggunakan neraca analitik (E. mettler, Switzeerland). pH
larutan diukur dengan menggunakan pH meter (Orion 710 A). Homogenasi larutan dilakukan
menggunakan stirer (pengaduk magnetik) dan Vortex (Fisher Vortex Genie). Penentuan aktivitas
enzim dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer UV- Vis (BIORAD, SmartspecTM 3000)
dan heating block (Thermolyne).
Pemisahan sel dan enzim dari suspensi dilakukan dengan menggunakan sentrifuga (Beckman
ETM). Pemisahan pada suhu kamar dilakukan dengan menggunakan mikrosentrifuga (Beckman
Microfuge ETM).
21
3.2.
Bahan
3.2.1
Bakteri Laut Vibrio sp. B10.2.8
Bakteri yang digunakan pada penelitian ini adalah bakteri laut Vibrio sp. B10.2.8 yang diisolasi
dari glass slide yang diinkubasi pada kedalaman 3 meter dan berjarak 2 meter dari koloni karang
lunak (softcoral) Sinularia sp. di pulau Peucang, Ujung Kulon-Jawa Barat.
3.2.2
Zat Kimia
Ekstrak ragi (Difco), bakto pepton (Difco), dan air laut digunakan untuk membuat media
pertumbuhan bakteri laut pada media cair. Bakto agar (Difco) diperlukan sebagai tambahan
untuk membuat media padat.
Pati dapat larut (Merck) digunakan sebagai substrat pada uji aktivitas α-amilase secara kualitatif
dan kuantitatif terhadap pati yang sudah digelatinisasi. NaH2PO4 dan Na2HPO4 digunakan untuk
membuat bufer. Pada saat melakukan uji aktivitas enzim digunakan KI/I2 sebagai reagen
pewarna dan HCl 1 N untuk menghentikan reaksi enzimatis. Amonium sulfat (NH4)2SO4
digunakan ketika melakukan pemekatan enzim dengan metoda fraksinasi.
3.3.
Cara Kerja
3.3.1.
Pembuatan media marine broth padat
Media Marine Broth merupakan media pertumbuhan bakteri B10.2.8. Media marine broth padat
dibuat dengan mencampurkan bakto pepton 0,25% (b/v), ekstrak ragi 0,05%, baktoagar 2%
(b/v), dan air laut untuk melarutkan. Campuran kemudian disterilisasi menggunakan alat
autoclave selama 15 menit. Setelah itu, media dituangkan ke dalam cawan petri steril secara
aseptik di ruang laminar flow atau di dekat nyala api. Media dibiarkan beberapa saat hingga
memadat, kemudian disimpan pada 4 ˚C selama 12-24 jam. Media marine broth cair dibuat
dengan metode yang sama dengan pembuatan media marine broth padat, tetapi tanpa
penambahan bakto agar. Media marine broth padat untuk uji kualitatif memiliki komposisi yang
22
sama dengan marine broth padat untuk pertumbuhan, dengan penambahan pati dapat larut
sebanyak 1% (b/v).
3.3.2.
Peremajaan kultur bakteri Vibrio sp. B10.2.8 pada media marine broth
padat
Peremajaan bakteri laut B10.2.8 pada media marine broth padat dilakukan dengan
menggoreskan bakteri menggunakan kawat ose. Setelah itu, bakteri diinkubasi pada suhu 30 ˚C
selama 13 jam.
3.3.3.
Pembuatan kurva pertumbuhan Vibrio sp. B10.2.8 dan aktivitas α-amilase
selama pertumbuhan
Pertumbuhan bakteri diukur dengan mengukur densitas optik (Optical Density, OD) pada
panjang gelombang 600 nm. Sebanyak 1000 μL inokulum dimasukkan kedalam 100 mL media
MB dalam labu erlenmeyer 500 ml, kemudian dikocok dalam shaking incubator pada kecepatan
150 rpm dan temperatur 30 oC. Sampel diambil sebanyak 1 mL secara aseptik pada interval
waktu 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 15, 16, 18, 19, 22, dan 25 jam pertumbuhan bakteri dan diukur
OD600.
Sekresi α-amilase pada tiap waktu pertumbuhan Vibrio sp B10.2.8. dilakukan dengan
mensentrifuga kultur bakteri pada kecepatan 12500 x g selama 3 menit. Supernatan yang
diperoleh kemudian diuji aktivitas α-amilase-nya dengan metode Fuwa.
3.3.4.
Produksi α-amilase Vibrio sp. B10.2.8
Sebelum menginokulasi bakteri B10.2.8 dalam media produksi, harus dibuat terlebih dahulu
starter. Starter dibuat dengan mengambil koloni tunggal dari media padat marine broth dengan
jarum ose steril kemudian dinokulasi ke dalam 10 mL marine broth cair. Sel bakteri ini
diinkubasi dalam shaking incubator dengan kecepatan 150 rpm, pada suhu 30 °C selama 13 jam.
Setelah 13 jam, sebanyak 1% (v/v) sel bakteri diambil untuk kemudian diinokulasi ke dalam
media produksi. Media produksi yang digunakan adalah media marine broth yang mengandung
pati dapat larut 0,1% (b/v). Sel bakteri dalam media produksi kemudian diinkubasi dalam
shaking incubator pada suhu 30 °C dengan kecepatan 150 rpm selama 13 jam.
23
Setelah ditumbuhkan dalam media produksi selama 13 jam, dilakukan sentrifugasi dengan
kecepatan 6000 x g selama 15 menit. Setelah sentrifugasi akan didapatkan fraksi supernatan dan
debris sel. Fraksi supernatan inilah yang merupakan enzim α-amilase yang dihasilkan oleh
bakteri B10.2.8.
Kultur supernatan yang diperoleh kemudian ditambahkan dengan (NH4)2SO4 hingga 70% jenuh
(Lampiran G) dan didiamkan selama satu jam. Supernatan kemudian disentrifuga dengan
kecepatan 12000 x g selama 10 menit. Setelah itu, fraksi 70% supernatan ini didialisis dan
hasilnya disimpan dalam freezer – 20 °C.
3.3.5.
Pembuatan bufer fosfat 20 mM
Larutan Na2HPO4 1 M dibuat dengan melarutkan 1,41974 gram padatan Na2HPO4 dalam 100
mL aquades. Larutan NaH2PO4 1 M dibuat dengan melarutkan 1,19974 gram padatan NaH2PO4
dalam 100 mL aquades. Setelah itu, 12 mL larutan Na2HPO4 1 M dicampurkan dengan 88 mL
larutan NaH2PO4 1 M sehingga didapatkan larutan bufer fosfat pH 6 dengan konsentrasi 1 M.
Untuk membuat larutan bufer fosfat dengan konsentrasi 20 mM, maka dapat diambil sejumlah
volume larutan bufer fosfat 1 M kemudian diencerkan dengan aquabides. Pengaturan pH larutan
bufer fosfat dapat dilakukan dengan menambahkan NaOH atau H3PO4.
3.3.6.
Pembuatan stok larutan KI/I2
Pembuatan larutan KI/I2 dilakukan dengan cara mencampurkan KI 0,5% (b/v) dengan I2 0,15%
(b/v) dan dilarutkan menggunakan aquades. Untuk mempercepat proses pelarutan, campuran
diaduk menggunakan pengaduk magnetik. Larutan akhir kemudian disimpan dalam botol reagen
berwarna gelap.
3.3.7.
Pembuatan larutan pati 0,125% (b/v) untuk menentukan aktivitas αamilase terhadap pati tergelatinisasi
Larutan pati ini akan digunakan sebagai substrat pada saat uji aktivitas enzim secara kuantitatif.
Larutan pati ini harus dibuat fresh, yaitu sebelum analisis uji aktivitas dilakukan. Larutan pati
dibuat dengan cara melarutkan 0,0125 gram pati dalam 10 mL bufer fosfat 20 mM pH 6 dengan
pemanasan.
24
3.3.8.
Uji Aktivitas α-amilase Vibrio sp. B10.2.8
Uji aktivitas α-amilase dilakukan secara kualitatif dan kuantitatif. Uji aktivitas secara kualitatif
dilakukan terhadap bakteri B10.2.8 yang ditumbuhkan pada media marine broth padat yang
mengandung 1% (b/v) amilum. Pengujian dilakukan dengan cara menuangkan larutan KI/I2 ke
dalam cawan petri yang berisi kultur bakteri. Kemudian perubahan warna yang terjadi diamati
sebelum dan sesudah penambahan KI/I2. Aktivitas α-amilase ditandai dengan munculnya daerah
bening di sekitar koloni bakteri.
Penentuan aktivitas α-amilase secara kuantitatif dilakukan atas dasar kemampuan enzim αamilase dari bakteri untuk menghidrolisis ikatan α-1,4-glikosidik pada pati (Fuwa, 1954).
Definisi satu unit aktivitas enzim α-amilase adalah penurunan absorban pada panjang gelombang
600 nm sebesar 10% per mL enzim pada kondisi percobaan. Uji aktivitas dilakukan dengan cara
mencampurkan 0,1 mL substrat pati terlarut 0,125% (b/v) dengan 0,2 mL larutan enzim.
Kemudian campuran ini diinkubasi pada temperatur 50 °C selama 10 menit. Reaksi enzimatik
dihentikan dengan cara menambahkan 0,125 mL HCl 1N. Ke dalam campuran kemudian
ditambahkan 0,25 mL campuran KI/I2 0,15% (b/v). Setiap penambahan setiap reagen campuran
harus di-vortex agar campuran menjadi homogen. Setelah itu, ke dalam campuran ditambahkan 4
mL bufer fosfat 20 mM pH 6 dan campuran kemudian di-vortex lagi. Setelah itu, campuran
diukur serapannya pada panjang gelombang 600 nm. Sebagai kontrol, enzim digantikan dengan
enzim yang telah diinaktivasi. Sebagai blanko digunakan 0,125 mL HCl 1N, 0,25 mL KI/I2
0,15% (b/v), dan 4 mL bufer fosfat 20 mM pH 6. Unit aktivitas (UA) dari enzim ditentukan
berdasarkan persamaan berikut:
⎛ (A kontrol − A sampel )
⎞
⎜
⎟
A
kontrol ⎠
Unit aktivitas (U/ml) = ⎝
× faktor pengenceran enzim
10% × Venzim
.................. (3.1)
A600
: absorban pada panjang gelombang 600 nm
10%
: penurunan intensitas warna biru kompleks iodin- pati
V
: volume enzim yang digunakan
25
3.3.9.
Penentuan konsentrasi total protein
Kadar protein ditentukan dengan metode Bradford (Bradford et.al, 1976) menggunakan pewarna
coommasie briliant blue G-250. Sebanyak 800 μL larutan protein dicampurkan dengan 200 μL
reagen warna. Campuran reaksi dikocok kemudian didiamkan selama 5-10 menit pada suhu
ruang. Absorbans larutan diukur pada panjang gelombang 595 nm. Larutan standar protein yang
digunakan adalah larutan BSA (Bovine Serum Albumine) dengan konsentrasi 2-16 μg/mL.
3.3.10.
Pengaruh pH dan suhu terhadap aktivitas α-amilase Vibrio sp. B10.2.8
pH optimum aktivitas α-amilase ditentukan dengan melakukan reaksi hidrolisis pati pada rentang
pH 5,0–8,0 pada suhu 50 oC. Larutan pH dibuat dengan menggunakan 20 mM buffer fosfat.
Suhu optimum aktivitas α-amilase ditentukan dengan melakukan reaksi hidrolisis pati pada
rentang suhu 40-80 oC pada pH 6,0.
3.3.11.
SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamid Gel Electrophoresis)
Komposisi bahan pembuatan stacking gel dan separating gel untuk SDS-PAGE dapat dilihat
pada Tabel 3.1. Sebelum dielektroforesis, sampel enzim dicampurkan dengan 5 x sampel bufer
dengan perbandingan volume sampel dan sampel bufer adalah 1:4. Setelah itu, sebanyak 20 µL
sampel enzim dimasukkan dalam sumur gel untuk dielektroforesis. Proses elektroforesis
dilakukan pada tegangan 150 V dan arus 400 mA selama 60 menit. Proses elektroforesis
dihentikan bila warna biru tracking dye telah mencapai jarak kurang lebih 1 cm dari tepi bawah
gel.
Tabel 3.1 Komposisi Gel untuk SDS-PAGE (Komposisi untuk 2 gel)
Stacking gel
Separating gel
-
0,67 mL 30% akrilamida
-
3,3 mL 30% akrilamida
-
3,746 mL dH2O
-
3,996 mL dH2O
-
0,5 mL 1M Tris-HCl pH 6,8
-
2,5 mL 1,5 M Tris-HCl pH 8,8
-
100 μL 10% amonium persulfat
-
100 μL 10% amonium persulfat
-
4 μL TEMED
-
4 μL TEMED
26
3.3.12.
Zimografi
Zimografi dilakukan dengan merendam gel hasil elektroforesis SDS-PAGE yang telah
direnaturasi dalam larutan 1% pati dalam bufer fosfat 20 mM, pH 6,0 selama 30 menit pada
temperatur 50 ºC. Gel kemudian direndam dalam larutan KI/I2 selama 15 menit (Lo, 2002).
Adanya α-amilase ditandai dengan terbentukkan pita bening setelah dilakukan perendaman
dalam larutan KI/I2. Renaturasi protein pada gel hasil elektroforesis SDS-PAGE dilakukan
dengan menginkubasi gel dalam bufer fosfat 20 mM, pH 6 selama 1 jam.
3.3.13.
Analisis gula pereduksi yang dilepas α-amilase dalam mendegradasi pati
mentah
Analisis gula pereduksi dilakukan dengan menggunakan metode antron. Larutan antron dibuat
fresh sebelum pengujian dilakukan. Larutan anthron dibuat dengan melarutkan 0,4 gr serbuk
anthron dalam 200 mL asam sulfat pekat (larutan A). Larutan B dibuat dengan mencampurkan
60 mL aquabides dengan 15 mL etanol 95%. Ke dalam larutan B ditambahkan larutan A secara
perlahan sambil diaduk. Pencampuran kedua larutan dilakukan dalam penangas es.
Sebanyak 0,5 mL suspensi 5% (b/v) pati mentah dicampur dengan 0,5 mL larutan enzim dalam
sebuah tabung Eppendorf. Campuran diinkubasi pada temperatur 37 oC selama 4 jam, kemudian
disentrifuga dengan kecepatan 12.500 x g (microsentrifuge) selama 10 menit. Sebanyak 0,5 mL
supernatan ditambahkan dengan 5 mL larutan antron dan diinkubasi pada temperatur 100 oC
selama 10 menit. Serapan larutan diukur pada panjang gelombang 620 nm. Kurva standar
glukosa dengan rentang konsentrasi 25-150 mg/L digunakan untuk menghitung kadar glukosa
dalam sampel.
27