Pengaruh Kofaktor Logam Ca dan Mg Terhadap Aktivitas

Pengaruh Kofaktor Logam Ca dan Mg Terhadap Aktivitas
Hyalurodidase Streptococcus agalactie
Oleh:
Wendry Setiyadi Putranto
FAKULTAS PETERNAKAN
UNIVERSITAS PADJADJARAN
2006
Pengaruh Kofaktor Logam Ca dan Mg Terhadap Aktivitas
Hyalurodidase Streptococcus agalactie
Oleh :
Wendry Setiyadi Putranto, SPt.,MSi
Mengetahui:
Kepala Laboratorium
Teknologi Pengolahan Produk Peternakan
Fakultas Peternakan Universitas Padjadjaran
Dr. Ir.Kusmajadi Suradi,MS.
NIP. 130780570
2
I. PENDAHULUAN
1.1.
Latar Belakang
Hyaluronidase merupakan enzim ekstraselluler yang menghidrolisa asam
hyaluronat, yaitu semen jaringan yang merekatkan sel-sel hidup menjadi satu.
Hyaluronidase dihasilkan oleh kebanyakan streptokokus,dan merupakan faktor
virulensi bakteri tersebut untuk melakukan invasi. Streptokokus Grup B (SGB)
atau Streptococcus agalactie telah diketahui sebagai patogen penting pada
manusia, antara lain menyebabkan abortus, ketuban pecah sebelum waktu
(KPSW), bayi berat lahir rendah (BBLR),dan infeksi neonatal (pneumonia,
septikemia,dan meningitis.
Asam hyaluronat merupakan glycosaminoglycan yang penting untuk
merekatkan sel hidup menjadi satu. Asam tersebut tersusun atas 250 – 25.000
rantai
β (1-4) yang tersusun atas D – glucoronic dengan N- acetyl- D-
glukosamine. Karakter ionik dari asam hyaluronat adalah dapat mengikat kuat
beberapa kation seperti K+, Na+, dan Ca2+. Menggunakan X-ray dapat terlihat
struktur Ca2+ hyaluronat yang merupakan kumparan tunggal terdiri dari tiga
disakarida
tiap
satu
putarannya.
Asam
hyaluronat
dan
beberapa
glycosaminoglycan yang lain (chondroitin – 4- sulfate, chondroitin – 6 – sulfate,
drenatan sulfate, keratan sulfate, dan heparin) dapat dipotong oleh enzim
hyaluronidase pada rantai β (1-4).
Hyaluronidase merupakan enzim yang mampu menghidrolisa asam
hyaluronat
menghasilkan 2-acetamido-2-deoxy-3-0- (β - D – gluco – 4 –
3
enepyranosyluronic acid) –D – glucose. Enzim tersebut diaktifkan oleh beberapa
kofaktor logam, sehingga peneliti merasa tertarik untuk mengkaji pengaruh
kofaktor Kalsium dan Magnesim terhadap aktivitasnya.
1.2.
Tujuan Penelitian
Penelitian
ini
bertujuan
melakukan
pemurnian
dan
karakterisasi biokimia dari hyaluronidase yang dihasilkan oleh
mempelajari
Streptokokus
Grup B (SGB) yaitu tentang pengaruh kofaktor Kalsium dan Magnesium.
1.3.
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Bioteknologi Hewan dan
Biomedis PAU Bioteknologi IPB, Laboratorium Immunologi dan Produksi Bahan
Hayati, FKH IPB, dan Laboratorium Terpadu FKH IPB.
4
II. BAHAN DAN METODA
3.1.
Test Agar Hyaluronidase (Christ,1989)
Uji
ini
bertujuan
untuk
menentukan
isolat
yang
menghasilkan
hyaluronidase. Media tumbuh adalah terdiri dari 100 ml BHI ditambahkan 1 g
Nobel Agar, kemudian disteril dengan autoklaf. Selanjutnya ditambahkan 50 mg
asam hyaluronat dalam 25 ml akuades dan 1,25 g BSA, dituangkan dalam cawan.
Inkubasi selama 24 jam, 37 oC. Selanjutnya SGB diinokulasikan dalam media
tersebut dan diinkubasi selama 24 jam suhu 37 oC. Empat isolat SGB yang
digunakan
merupakan koleksi dari Ibu dr.Zainatul Hayati,M.Kes.,Sp.MK.,
kemudian dilakukan penggenangan dengan asetat 2 M sebanyak 5 ml dan terlihat
zona bening disekitar koloni SGB (zona bening mengindikasikan isolat SGB
tersebut mengekskresikan hyaluronidase).
3.2.
Isolasi Hyaluronidase pada Supernatan
Setelah diperoleh isolat SGB yang menghasilkan hyaluronidase maka
bakteri ditumbuhkan pada 50 ml THB , diinkubasi pada suhu 37 oC, selama
kurang lebih 5 jam (nilai absorbansi 0,8 pada λ 650 nm).
Selanjutnya
diinokulasikan kembali dalam 500 ml THB (mengandung 0,2% asam hyaluronat),
dan diinkubasi semalam pada suhu 37 oC. Untuk mengamati pertumbuhan
Streptokokus Grup B, dilakukan pengamatan dengan melihat nilai optical density
(λ 650 nm) selama masa inkubasi. Dilakukan pengujian pula terhadap aktivitas
hyaluronidase dan kadar protein (Bradford 1976), sehingga berdasarkan data
tersebut dapat kita tentukan waktu produksi hyaluronidase dari SGB, sebagai
patokan untuk produksi selanjutnya.
Hyaluronidase diperoleh dengan memisahkan enzim dengan sel bakteri
SGB tersebut menggunakan sentrifugasi 4000 rpm, selama 15 menit , suhu 4 oC.
Supernatan merupakan enzim kasar hyaluronidase.
Selanjutnya dilakukan
pengujian aktivitas hyaluronidase dan penentuan kadar protein enzim (Bradford,
1976).
3.3.
Pengendapan dengan Amonium Sulfat
Pengendapan protein dengan amonium sulfat dilakukan dengan metoda
Scope (1982). Sebanyak 10 ml supernatan enzim ditambahkan amonium sulfat
dengan berbagai kadar berdasarkan kejenuhan (40%, 45%, 55%, 65%, 75%, 85%)
untuk mendapatkan kadar amonium sulfat yang optimum. Penambahan amonium
sulfat dilakukan sedikit demi sedikit dengan magnetic stirer pada suhu dingin.
Setelah semua amonium sulfat larut, didiamkan semalam pada suhu 4 oC.
Endapan yang terbentuk dipisahkan dari supernatan dengan sentrifius 4000 rpm,
15 menit, 4 oC. Endapan ditambahkan bufer pospat pH 6,4 satu kali volume.
Selanjutnya dilakukan pengujian aktivitas hyaluronidase dan kadar proteinnya.
Pengandapan amonium sulfat yang menghasilkan aktivitas tertinggi pada endapan
dan aktivitas yang rendah pada supernatan digunakan sebagai patokan untuk
pengendapan selanjutnya.
6
3.4.
Pengukuran Konsentrasi Protein (Bradford, 1976)
Konsentrasi protein diukur dengan menggunakan standar protein Bovine
Serum Albumin (BSA) dengan konsentrasi 0,1 hingga 1 mg/ml. Setiap 100 µl
konsentrasi BSA ditempatkan pada tabung reaksi dan ditambahkan 5 ml pereaksi
Bradford dan diinkubasi selama 5 menit, suhu 37
o
C, kemudian diukur
absorbansinya pada λ 595 nm. Sehingga didapat kurva standar yang merupakan
persamaan garis regresi ( y = ax + b, dengan nilai r mendekati satu ) antara nilai
absorbansi sebagai ordinat dan konsentrasi protein BSA sebagai absis.
Dengan metoda yang sama untuk sampel hyaluronidase, yaitu sebanyak
100 µl hyaluronidase ditambahkan 5 ml pereaksi Bradford dan diinkubasi 37 oC, 5
menit, dan dilihat nilai absorbansinya pada λ 595 nm.
Selanjutnya
untuk
mendapatkan kadar protein hyaluronidase tersebut, dengan memasukkan nilai
absorbansi tersebut ke dalam persamaan daris yang telah dibuat.
3.5.
Pengukuran Aktivitas Hyaluronidase (Bergmeyer, 1987)
Aktivitas hyaluronidase diukur berdasarkan jumlah 2-acetamido-2-deoxy-
3-0- (β - D – gluco – 4 – enepyranosyluronic acid) – D – glucose dari asam
hyaluronat.
Bahan yang diperlukan:
1. Bufer phospat (67 mmol/liter, pH 6,4), pembuatannya dengan melarutkan
66 ml Na2HPO4 2H2O (11,876 g/liter) dengan KH2PO4 (9,078g/liter)
dalam volume 250 ml.
7
2. Sodium Chloride (0,15 mol/liter) dengan melarutkan 0,877 g NaCl dengan
100 ml air.
3. Perhloric acid (20%w/v) dengan melarutkan 13 ml HclO4 (70% w/v)
dengan 75 ml air.
4. Hyaluronate lyase standar ( 1 mg protein/ml; 100 U/litter) 7 mg enzim
dalam 7 ml larutan NaCl.
5. Asam hyaluronate 200 mg dalam 1000 ml bufer posat.
Tabel.1.
Larutan
Prosedur pengujian aktivitas hyaluronidase (Bergmeyer,1987)
Sampel
Standar
Konsentrasi
Buffer phospat
1ml
1,5 ml
37 mmol/liter
Asam hyaluronat
0,5 ml
0,5 ml
27,8 mg/liter
Larutan NaCL
0,5 ml
1 ml
45,8 mmol/liter
0,1 ml
3 U/liter
Inkubasi pada 70 oC, selama 10 menit
Hyaluronidase
0,1 ml
Inkubasi pada 37 oC, selama 6 jam
Perkhlorit acid
0,5 ml
0,5 ml
Sentrifugasi 5000 g, selama 20 menit, selanjutnya dilihat absorbansinya pada λ
232 nm. Absorbansi sampel (A1) dan absorbansi standar (A2)
Aktivitas (U/ml) = A1 / A2 x 0,003 U/ml
3.6.
Pengaruh Kation Ca 2+ dan Mg2+
Pengaruh kation Ca2+(CaCl2) dan Mg2+(MgCl2) masing-masing 1 dan 5
mM dalam campuran raksi, selanjutnya diukur pada pH dan suhu optimum.
8
III. HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1.
Pengaruh Kofaktor Logam Ca dan Mg
Merupakan salah satu sifat khas dari enzim yaitu membutuhkan tambahan
komponen kimia untuk aktivitasnya. Senyawa tersebut disebut kofaktor
(merupakan senyawa anorganik) atau koenzim
organik).
(merupakan suatu molekul
Dalam penelitian ini digunakan dua kofaktor logam (Ca2+ dan
Mg2+).Ion kalsium terletak dipermukaan enzim dan memiliki fungsi untuk
mempertahankan kestabilan panas enzim (Dahiquist,et al. 1976). Berdasarkan
data yang diperoleh menunjukkan bahwa hyaluronidase diaktifkan oleh kofaktor
Aktivitas hyaluronidase (U/ml)
Ca2+ dan Mg2+.
0.14
0.1162
0.12
0.1
0.08
0.1002
0.0782
0.06
0.04
0.02
0.0075
0.008
0.012
0
0
1
5
Konsentrasi Ca (m M)
Aktivitas hyaluronidase pada supernatan (U/ml)
Aktivitas hyaluronidase hasil pengendapan amoinum sulfat 45% (U/ml)
Gambar 1. Pengaruh kofaktor Ca2+ terhadap aktivitas hyaluronidase
Aktivitas hyaluronidase (U/ml)
0.14
0.122
0.12
0.1
0.086
0.0782
0.08
0.06
0.04
0.02
0.009
0.0075
0.013
0
0
1
5
Konsentrasi Mg (m M)
Aktivitas hyaluronidase pada supernatan (U/ml)
Aktivitas hyaluronidase hasil pengendapan amoinum sulfat 45%
(U/ml)
Gambar.2. Pengaruh kofaktor Mg2+ terhadap aktivitas hyaluronidase
10
IV. KESIMPULAN
Hyaluronidase dari Streptokokus Grup B (SGB)
merupakan enzim
ekstraseluler diaktifkan oleh kofaktor logam (Ca2+ dan Mg2+). Berdasarkan hasil
karakterisasi dapat memberikan informasi untuk penelitian lebih jauh dalam
bidang kesehatan.
DAFTAR PUSTAKA
Bradford,MM.1976. A rapid and sensitive method for quantitation of microgram
quantitaties of protein in utilizing the principle of protein-dye
binding.Anal.Biochem.72:248-254.
Bergmeyer,H.U.1987.Method of Enzymatic Analysis. VCH.Vol.IV:45-49.
Christ.D.1989,Untersuchungen an Streptococcus uberis unter besonder
Berucksichtigung mutmaBlicher pathogenitatsfatoren. Aus der professur fur
Bakteriologie und immunologie der Justus-Universitat GiBen.33-34.
Dahlquist FW,Long JW, Bigbec WL.1976. Role of Calcium in The Thermal
Stability of Thermolysin.Biochemistry 15:1103-1111.
Hynes.W.L.,Dixon.A.R, Walton S.R. Aridgides.L.J .2000.The Extracellular
hyaluronidase gene (hyl A) of Streptococcus pyogenes. FEMS Microbiology
Letter 184.109-112.
Scopes RK.1987. Protein Purification Principles and Practice. Edisi ke-2. New
York: SpringerVerlag.
13