ISolasi, Identifikasi Dan Karakterisasi Molekular

METODE PENELITIAN
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan dari bulan Januari sampai dengan bulan Juni 2011,
bertempat di Laboratorium Mikrobiologi dan Imunologi, Pusat Studi Satwa
Primata, Lembaga Penelitian dan Pengabdian kepada Masyarakat, Institut
Pertanian Bogor (PSSP LPPM-IPB), Jalan Lodaya II/5, Bogor 16151.
Sampel Penelitian
Sampel yang dimanfaatkan dalam penelitian ini adalah plasma owa jawa
yang merupakan koleksi sampel Laboratorium Mikrobiologi dan Imunologi PSSP
LPPM-IPB, sebagai bagian dari pemeriksaan rutin kesehatan satwa dari beberapa
fasilitas konservasi eks-situ satwa primata. Semua sampel yang digunakan dalam
penelitian ini, berasal dari 9 ekor satwa owa jawa yang memiliki status positif
atas pemeriksaan terhadap antigen permukaan virus hepatitis B (HBsAg) melalui
uji ELISA (data sekunder).
Ekstraksi DNA
Pemurnian DNA virus dilakukan dari sampel plasma owa jawa
menggunakan kit QIAmp DNA Mini Blood Kit (Qiagen, USA) sesuai dengan
petunjuk dari pedoman penggunaan dari perusahaan. Sebanyak 200µl sampel
plasma ditambahkan ke dalam tabung mikro yang telah berisi 20µl (20mg/ml)
proteinase K. Larutan penyangga pelisis (lisis buffer) ditambahkan sebanyak
200µl ke dalam masing-masing tabung mikro. Untuk menghomogenkan campuran
tersebut dilakukan homogenisasi menggunakan vortex dan dilanjutkan dengan
inkubasi selama 10 menit pada suhu 560 C. Prosedur selanjutnya dilakukan
sentrifugasi, pencucian dan elusi sesuai dengan prosedur baku dari kit ekstraksi
DNA QiAmp DNA Miniblood Kit.
Amplifikasi DNA untuk Sekuens Daerah Pre-S1 VHB
Amplifikasi DNA dilakukan menggunakan metode polymerase chain
reaction
(PCR)
dengan
memanfaatkan
primer
yang
dirancang
untuk
mengamplifikasi daerah Pre-S1 yang merupakan daerah variabel dan karakteristik
untuk VHB yang berasal dari spesies yang berbeda. Set primer forward dan
reverse disintesa dari sekuens bagian paling conserved di daerah yang variabel di
antara berbagai strain VHB.
Sebanyak 50 µl reagen PCR yang terdiri dari, masing-masing 1µl primer
forward dan reverse (10 pmol/µl), 4 µl MgCl2 (25mM), 5 µl dNTPs (10 mM),
0,5µl Taq Gold Polymerase (5 U/µl), 5 µl PCR Buffer 10X (500mM KCl,
100mM Tris-HCl (pH 8,3), sampel DNA (10 ul) dan ddH2O (23,5 ul) dimasukkan
ke dalam tabung mikro 200µl dan dihomogenkan menggunakan vortex.
Merujuk kepada penelitian yang dilakukan oleh Warren et al. (1999) yang
telah berhasil mengamplifikasi VHB daerah Pre-S1 dari isolat orangutan,
digunakan pasangan primer yang sama untuk mengamplifikasi VHB daerah PreS1
dari
isolat
DNA
owajawa
yaitu
hepB-SF1
dengan
sekuens
5’-
TGYGGGTCACCWTATTCTTGGG-3’ dan hepB-SRout yang memiliki sekuens
5’-CACTGTTCCTGAACTGGAGC-3’. Pasangan primer tersebut memiliki target
produk kurang lebih 455 pasang basa.
Amplifikasi DNA dilakukan menggunakan mesin PCR (Perkin Elmer,
Model 9700), melalui beberapa tahapan. Pada tahap awal dilakukan pre-PCR
untuk mengaktifkan enzim polymerase pada suhu 940C selama 10 menit. Tahapan
selanjutnya adalah amplifikasi PCR yang terdiri atas denaturasi sampel pada suhu
940C selama 30 detik, annealing pada suhu 620C selama 30 detik, dan tahap
elongasi pada suhu 720C selama 1 menit. Tahapan ini dilakukan selama 30 kali
dengan siklus yang berulang. Tahap akhir adalah post-PCR dengan suhu 720C
selama 10 menit.
Produk PCR yang telah diamplifikasi tersebut dijalankan pada gel agarosa
2% yang mengandung ethidium bromida 1 µg/ml dalam bufer TAE menggunakan
elektroforesis horizontal. Penanda DNA 1 kb (Invitrogen, USA) dan produk PCR
yang telah ditambahkan pewarna (loading dye) dimasukkan ke dalam sumur gel.
Alat dokumentasi Gel Doc 2000 (BioRad, USA)
digunakan untuk
memvisualisasikan hasil elektroforesis. Sebagai kontrol positif PCR digunakan
DNA positif VHB gibbon (VHBGi), VHB manusia (VHBHu) dan VHB
orangutan (VHBOu).
Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)
Terhadap produk PCR yang memberikan hasil positif pada uji PCR
dilakukan digesti menggunakan enzim restriksi BSt2UI (1 U/µl) yang bekerja
pada sekuens spesifik yaitu CC(A/T)GG dari sekuens nukleotida sampel. Enzim
restriksi ini telah diketahui dapat memotong sekuens nukelotida dari VHBOu
namun tidak dapat memotong sekuens nukleotida dari VHBHu. Sebanyak 20µl
campuran reagensia yang terdiri dari 1µl enzim BSt2UI (1IU/ul), buffer pereaksi
10 x sebanyak 1,5µl, dan produk PCR sebanyak 3,5µl. Ditambahkan air destilasi
sampai volume mencapai 20µl. Kemudian dilakukan inkubasi pada suhu 600C
selama 1 jam.
Untuk memvisualisasikan hasil restriksi enzim, produk PCR yang telah
diinkubasi dengan enzim restriksi tersebut dijalankan melalui gel agarosa
menggunakan elektroforesis
horizontal dengan berkonsentrasi
2%
yang
ditambahkan ethidium bromida sebagai pewarna (staining), selama 1,5 jam, 100V.
Pembacaan hasil eletroforesis dilakukan melalui alat GelDoc.
Amplifikasi DNA untuk Sekuens Genom Lengkap VHB
Amplifikasi DNA untuk mendapatkan sekuens genom lengkap VHBGi
merujuk kepada Sa-Nguanmoo et al. (2008) yang menggunakan empat set primer
seperti tertera pada tabel 2 di bawah ini.
Tabel 2 Pasangan primer untuk amplifikasi genom lengkap VHBGi
Primer
Primer
Sekuens primer
Posisi nukleotida
set
1
2
3
4
Target
produk (pb)
PreS1F
5’-GGGTCACCATATTCTTGGGAAC-3’
2814 -2835
R5
5’-AGCCCAAAAGACCCACAATTC-3’
1015 - 995
F6
5’-ATATGGATGATGTGGTATTGGG-3’
737-758
X102
5’-ACCTTTAACCTAATCTCC-3’
1764 - 1748
X101
5’-TCTGTGCCTTCTCATCTG-3’
1552 - 1569
CORE2
5’-CCCACCTTATGAGTCCAAGG-3’
2476 - 2457
CORE1
5’-GAGTGTGGATTCGCACTCCTCC-3’
2268 - 2289
R1
5’-TGTAACACGAGCAGGGGTCCTA-3’
201 - 180
1840
1027
924
2109
Sebanyak 50 µl reagensia PCR yang terdiri dari, masing-masing satu pasang
primer forward dan reverse sebanyak 1µl (10 pmol/µl), 4 µl MgCl2 (25mM), 5 µl
dNTPs (10 mM), 1µl Taq Gold Polymerase (5 U/µl), 5 µl PCR Buffer 10X
(500mM KCl, 100mM Tris-HCl (pH 8,3), sampel DNA (10 ul) dan ddH2O
(23ul) dimasukkan ke dalam tabung mikro 200µl dan dihomogenkan
menggunakan vortex.
Amplifikasi DNA dilakukan menggunakan mesin PCR (Perkin Elmer,
Model 9700), melalui beberapa tahapan. Pada tahap awal dilakukan pre-PCR
untuk mengaktifkan enzim polymerase pada suhu 940C selama 10 menit. Tahapan
selanjutnya adalah amplifikasi PCR yang terdiri atas denaturasi sampel pada suhu
940C selama 30 detik, annealing pada suhu 550C selama 30 detik, dan tahap
elongasi pada suhu 720C selama 2 menit. Tahapan ini dilakukan selama 40 kali
dengan siklus yang berulang. Tahap akhir adalah post-PCR dengan suhu 720C
selama 10 menit.
Produk PCR yang telah diamplifikasi tersebut dijalankan pada gel agarosa
2% yang mengandung ethidium bromida 1 µg/ml dalam bufer TAE menggunakan
elektroforesis horizontal. Penanda DNA 1 kb dan produk PCR yang telah
ditambahkan pewarna (loading dye) dimasukkan ke dalam sumur gel. Alat
dokumentasi Gel Doc 2000 (BioRad, USA) digunakan untuk memvisualisasikan
hasil elektroforesis. Sebagai kontrol positif digunakan DNA positif VHB gibbon
(VHBGi), VHB manusia (VHBHu) dan VHB orangutan (VHBOU).
Pemurnian Produk PCR
Pemotongan gel produk PCR dilakukan dengan memotong gel yaitu tepat
pada bagian gel yang memiliki pita yang berpendar saat diradiasi sinar UV.
Potongan
gel hasil amplifikasi kemudian dilakukan pemurnian menggunakan
kit ekstraksi gel QiaQuick (Qiagen, USA). Untuk mendapatkan sekuens
nukleotida, hasil pemurnian produk PCR dilakukan di Macrogen Inc, Korea.
Sekuensing dilakukan baik terhadap produk PCR VHBGi regio Pre-S1 maupun
genom lengkap VHBGi.
Analisa Hasil Sekuensing
Pembacaan hasil sekuensing mengunakan perangkat lunak komputer
BioEdit. Pensejajaran urutan nukleotida dianalisa menggunakan program BLAST
2.0 (BLAST, 2011) dan ClustalW2 (Kumar et al. 2011). Pembuatan pohon
filogenetik menggunakan perangkat lunak komputer MEGA versi 5.0 (Kumar et
al. 2011). Sebagai pembanding dimasukkan urutan nukleotida virus Hepatitis B
asal spesies Gibbon lainnya di luar Indonesia, orangutan, manusia , woolly
monkey, simpanse dan gorilla dari data GeneBank.
Alur Penelitian
Seleksi owa jawa yang terdeteksi positif dari hasil uji serologi HBsAg akan
dilanjutkan dengan uji karakteristik diagnostik cepat melalui PCR dengan primer
daerah Pre-S21 VHB.
Isolat yang memberikan karakteristik spesifik dengan sediaan material DNA
yang memadai maka akan dilakukan karakteristik nukleotida penyusun virus
hepatitis B pada owa jawa secara utuh.
Kemungkinan terjadinya transmisi
VHB secara interspesies maupun
intraspesies pada owa jawa
Sampel darah owa jawa
penangkaran eksitu
owa jawa yang positif secara
uji serologi HBsAg
Rekonstruksi pohon
filogenetik dengan satwa
primata lain
Karakteristik diagnostik cepat
melalui PCR dengan primer
spesifik VHB daerah preS1dari sampel positif serologi
Rekonstruksi pohon
filogenetik dengan manusia
dan satwa primata lain
Karakteristik molekular secara
utuh VHB pada owa jawa