BIO.003-08-Identifikasi khamir

21
BAB III
BAHAN DAN CARA KERJA
A. LOKASI DAN WAKTU PENELITIAN
Penelitian dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi dan Laboratorium
Genetika, Departemen Biologi, FMIPA-UI, Depok. Lama penelitian dari awal
pengambilan data hingga pembuatan skripsi sekitar dua belas bulan
(September 2006--September 2007). Skema kerja penelitian dapat dilihat
pada Lampiran 1.
B. BAHAN
1. Mikroorganisme
Mikroorganisme yang digunakan adalah 12 isolat khamir koleksi
University of Indonesia Culture Collection (UICC), Departemen Biologi FMIPA
UI. Empat isolat berasal dari perairan mangrove Cagar Alam Pulau Rambut,
yaitu: W1114, W1126, W127, dan W144, sedangkan delapan isolat lainnya
berasal dari perairan laut di sekitar Cagar Alam Pulau Rambut, yaitu: W314
(white), W322, W324, W325, W3324, W3329, W3338 (yellow) dan W3351.
2. Medium
Medium yang digunakan untuk pembuatan working culture adalah
Yeast Malt Agar (YMA). Medium yang digunakan untuk pemeliharaan stock
Identifikasi Khamir..., Anisa Retno Ediningsari, FMIPA UI, 2008
22
culture adalah Potato Dextrose Agar (PDA) yang mengandung NaCl 1,5%.
Medium padat yang digunakan untuk pengamatan fenotipik adalah Malt
Extract Agar (MEA) 5% dan Yeast Malt Agar (YMA), sedangkan medium cair
yang digunakan adalah Yeast Malt Broth (YMB) dan Malt Extract Broth (MEB)
5%. Pengamatan miselium dengan metode slide culture menggunakan
medium Corn Meal Agar (CMA).
3. Bahan kimia
Bahan kimia produk dari Difco adalah yeast extract, malt extract,
pepton, PDA, CMA dan Bacto agar. Bahan kimia produk dari Merck adalah
D-glukosa, etanol, dan isopropanol. Bahan kimia produk dari Promega
adalah agarosa, DNA ladder, etidium bromida, loading dye (6 X Load Dye
Blue/Orange), Go Taq Green Master Mix [Promega], pure taq ready-to-go
PCR beads [GE Healthcare], mineral oil , nuclease free water, (Tris-asetat
dan EDTA) TAE buffer 10 X, dan kit isolasi DNA (Wizard Genomic DNA
Purification Kit). Bahan kimia produk dari Sigma adalah proteinase, primer
ITS 5 (10 pmol/µl), primer ITS 4 (10 pmol/µl). Bahan kimia lainnya yang
digunakan adalah akuades, akuabides [IKA], alkohol teknis, zymolyase 20 T
[Seigaku America], spiritus teknis, tetrasiklin 500 mg/l [Phapros], dan minyak
imersi [Euromax Holland].
Identifikasi Khamir..., Anisa Retno Ediningsari, FMIPA UI, 2008
23
C. PERALATAN
Mikro pipet P10 dan P1000 [GILSON], mikro pipet P100 dan P200
[Eppendorf Research], alat sentrifugasi [Eppendorf 5415 C], cycle sequencer
[TaKaRa™ Gradient PCR], gel documentation system [BIO-RAD], PCR
thermal cycler [PERKIN ELMER 9600], inkubator [Heraeus], kamera digital
Sony DSC-W30, lemari es [Bauknecht], autoklaf [Hirayama HL-36 AE],
microwave [Hitachi], mikroskop [Euromex HOLLAND], mesin sequencer
[Applied Biosystem 3130XL], mesin sequencer [Applied Biosystem 3100],
spektrofotometer [OPTIMA SP-3000 Plus], alat elektroforesis [Advance],
timbangan digital [AND EW-300 G], sonikator [Sakura US-10 E], vortex
[Scientific Industries], jarum tanam bulat (ose) dan pembakar spiritus.
Peralatan habis pakai yang digunakan adalah tabung PCR [Axygen], tabung
Eppendorf 1,5 ml [Eppendorf], pipet tips 200--1.000 µl [BIO-RAD], lembar
parafilm, wrapping plastic [Klin Pak],dan sarung tangan [Sensi gloves]. Alat
lainnya adalah alat-alat gelas yang umumnya digunakan di laboratorium
mikrobiologi.
Identifikasi Khamir..., Anisa Retno Ediningsari, FMIPA UI, 2008
24
C. CARA KERJA
1. Pembuatan medium dan larutan
a. Malt Extract Agar (MEA) 5%
Medium Malt Extract Agar (MEA) 5% dibuat berdasarkan Yarrow
(1998: 87). Sebanyak 20 g agar dan 50 g malt extract dimasukkan ke dalam
labu Erlenmeyer dan ditambahi akuades hingga 1.000 ml. Larutan
dipanaskan dengan penangas air hingga mendidih dan semua bahan larut
sempurna. Medium disterilkan menggunakan autoklaf dengan suhu 115° C
dan tekanan 2 atm selama 15 menit. Medium yang sudah disterilkan
ditambahi dengan antibiotik tetrasiklin pada saat suhu medium ± 45° C
kemudian dituang ke cawan Petri masing-masing sebanyak 15--20 ml.
b. Malt Extract Broth (MEB) 5%
Medium Malt Extract Broth (MEB) 5% dibuat berdasarkan Yarrow
(1998: 87). Sebanyak 50 g malt extract dimasukkan ke dalam labu
Erlenmeyer kemudian ditambahi akuades hingga volume 1.000 ml. Larutan
dipanaskan dengan penangas air hingga mendidih dan semua bahan larut
sempurna. Medium yang sudah homogen kemudian dimasukkan ke
sejumlah tabung reaksi masing-masing sebanyak 5 ml. Medium disterilkan
menggunakan autoklaf dengan suhu 115° C dan tekanan 2 atm selama 15
menit.
Identifikasi Khamir..., Anisa Retno Ediningsari, FMIPA UI, 2008
25
c. Corn Meal Agar (CMA)
Pembuatan medium CMA sesuai petunjuk pada kemasan. Sebanyak
12,5 g bubuk CMA dan 3,8 g agar ditambahi akuades hingga volume
mencapai 1.000 ml. Campuran tersebut kemudian dipanaskan hingga
mendidih dan larut sempurna. Medium dimasukkan ke sejumlah tabung
reaksi masing-masing sebanyak 3 ml. Medium kemudian disterilkan
menggunakan autoklaf dengan suhu 121° C dan tekanan 2 atm selama 15
menit.
d. Potato Dextrose Agar (PDA) yang mengandung NaCl 1,5%
Pembuatan medium PDA sesuai petunjuk pada kemasan. Sebanyak
39 g bubuk Potato Dextrose Agar (PDA) dan 15 g NaCl ditambahi akuades
hingga mencapai volume 1.000 ml kemudian dipanaskan hingga mendidih
dan larut sempurna. Medium dimasukkan ke sejumlah tabung reaksi masingmasing sebanyak 5 ml. Medium disterilkan menggunakan autoklaf dengan
suhu 121° C dan tekanan 2 atm selama 20 menit. Medium yang sudah
disterilkan kemudian diletakkan pada bidang miring ± 45° untuk pembuatan
medium miring.
Identifikasi Khamir..., Anisa Retno Ediningsari, FMIPA UI, 2008
26
e. Yeast Malt Agar (YMA)
Medium Yeast Malt Agar (YMA) dibuat berdasarkan Yarrow (1998: 79).
Sebanyak 3 g yeast extract, 3 g malt extract, 5 g pepton, 10 g glukosa, dan
20 g agar dimasukkan ke dalam labu Erlenmeyer dan ditambahi akuades
hingga volume 1.000 ml. Campuran tersebut kemudian dipanaskan hingga
mendidih dan larut sempurna. Medium disterilkan menggunakan autoklaf
dengan suhu 121° C dan tekanan 2 atm selama 15 meni t. Medium yang
telah disterilkan ditambahi dengan antibiotik tetrasiklin pada saat suhu
medium ± 45° C kemudian dituang ke cawan Petri masing-masin g sebanyak
15--20 ml.
f. Yeast Malt Broth (YMB)
Pembuatan medium Yeast Malt Broth (YMB) berdasarkan Yarrow
(1998: 79). Sebanyak 3 g yeast extract, 3 g malt extract, 5 g pepton, 10 g
glukosa dimasukkan ke dalam labu Erlenmeyer dan ditambahi akuades
hingga volume 1.000 ml. Campuran tersebut kemudian dipanaskan hingga
mendidih dan larut sempurna. Medium kemudian dimasukkan ke sejumlah
tabung reaksi masing-masing sebanyak 5 ml. Medium kemudian disterilkan
menggunakan autoklaf dengan suhu 121° C dan tekanan 2 atm selama 15
menit.
Identifikasi Khamir..., Anisa Retno Ediningsari, FMIPA UI, 2008
27
2. Pemurnian isolat khamir, pembuatan stock culture dan working
culture
Pemurnian khamir dilakukan dengan metode gores berdasarkan
Yarrow (1998: 78). Medium yang digunakan adalah YMA dalam cawan petri.
Biakan khamir diambil menggunakan jarum tanam bulat (ose) kemudian
digoreskan di atas medium hingga membentuk empat kuadran garis.
Sebelum menggores satu kuadran, jarum ose dibakar terlebih dahulu dan
didinginkan sebelum menyentuh biakan. Biakan kemudian diinkubasi pada
suhu ruang selama 48 jam. Satu koloni tunggal yang tumbuh terpisah
kemudian digoreskan ke dalam dua tabung PDA yang mengandung 1,5%
NaCl dan disimpan pada suhu 4° C sebagai stock culture. Working culture
dibuat dengan cara subkultur pada médium PDA dari tabung stock culture.
3. Isolasi DNA
Isolasi DNA khamir dilakukan menggunakan Wizard Genomic DNA
Purification Kit (Lampiran 2).
4. Pembuatan gel agarosa 2%
Pembuatan gel agarosa 2% untuk deteksi fragmen DNA sebesar 200
pb--1 kb berdasarkan Sambrook & Russell (2001: 5.14). Sebanyak 2 g
bubuk agarosa ditambahi dengan akuades hingga volume 100 ml kemudian
dipanaskan hingga homogen. Larutan tersebut dituang ke dalam cetakan
Identifikasi Khamir..., Anisa Retno Ediningsari, FMIPA UI, 2008
28
(tray) yang sudah dipasangi sisir (comb) kemudian dibiarkan hingga
mengeras. Gel agarosa disimpan dalam larutan buffer TAE 1 X sebelum
digunakan untuk proses elektroforesis.
5. Pengukuran kualitas dan kuantitas DNA dengan spektrofotometer
Spektrofotometer dikalibrasi menggunakan 100 µl akuabides sebagai
larutan blanko. Sampel DNA sebanyak 10 µl diencerkan dalam 90 µl
akuabides kemudian dimasukkan ke dalam kuvet. Pengukuran dilakukan
terhadap absorbansi DNA pada panjang gelombang 260 nm dan absorbansi
protein pada panjang gelombang 280 nm. Kualitas atau tingkat kemurnian
DNA yang baik adalah 1,8--2,0 (1,8 ≤ A260/A280 ≤ 2,0). Konsentrasi DNA
kemudian dihitung menggunakan rumus berdasarkan Seidman & Moore
(2000: 419), yaitu:
Konsentrasi DNA (µg/µl) = OD260 x 50 µg/µl x faktor pengenceran
6. Amplifikasi daerah ITS dengan metode PCR
Proses PCR menggunakan Go Taq Green Master Mix [Promega]
dan pure taq ready-to-go PCR beads [GE Healthcare]. Setiap reaksi PCR
menggunakan Go Taq Green Master Mix [Promega] dengan volume total
reaksi 25 µl mengandung green go taq reaction buffer (pH 8,5), DNA
polimerase, 3 mM MgCl2, 400 µM dATP, dGTP, dTTP, dCTP, serta dye
kuning dan biru. Reaksi PCR berdasarkan Flanagan dkk. (2005: 13--16).
Identifikasi Khamir..., Anisa Retno Ediningsari, FMIPA UI, 2008
29
Volume total reaksi 25 µl terdiri atas 0,5 µl primer ITS 5 (5’-GGAAGTAAA
AGTCGTAAC AAGG-3’), 0,5 µl primer ITS 4 (5’-TCCTCCGCCTTATT
GATATGC-3’), 6 µl sampel DNA cetakan, 5,5 µl nuclease free water dan
12,5 µl Go Taq Green Master Mix [Promega]. Campuran tersebut
dimasukkan ke dalam tabung PCR 0,2 ml kemudian disentrifugasi 13.000
rpm selama 1 menit.
Setiap reaksi PCR menggunakan pure taq ready-to-go PCR beads
[GE Healthcare] dengan volume total 25 µl mengandung 2,5 unit pure taq
DNA polimerase, 10 mM Tris-HCL, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 200 µM dATP,
dGTP, dTTP, dCTP, dan buffer. Reaksi PCR berdasarkan GE Healthcare
[2005: 2]. Volume total 25 µl terdiri atas: 18 µl nuclease free water dan PCR
bead. Campuran tersebut dimasukkan ke dalam tabung PCR 0,2 ml
kemudian disentrifugasi 13.000 rpm selama 10 menit hingga PCR bead
terlarut sempurna.
Amplifikasi menggunakan PCR thermal cycler [PERKIN ELMER 9600].
Kondisi PCR diawali dengan denaturasi awal pada suhu 94° C selama 2
menit, kemudian dilanjutkan sebanyak 40 siklus yang masing-masing terdiri
atas tiga tahap yaitu: denaturasi pada suhu 94° C s elama 15 detik, pelekatan
(annealing) pada suhu 56° C selama 30 detik dan polimerisasi pada suhu
68° C selama 1 menit. Setelah 40 siklus tersebut, dilanjutkan dengan
polimerisasi akhir pada suhu 68° C selama 10 menit 40 detik. Produk PCR
kemudian dapat disimpan pada suhu 4° C.
Identifikasi Khamir..., Anisa Retno Ediningsari, FMIPA UI, 2008
30
7. Elektroforesis hasil amplifikasi daerah ITS
Hasil amplifikasi daerah ITS divisualisasikan dengan teknik
elektroforesis menggunakan gel agarosa 2%. Persiapan loading dilakukan
sebagai berikut. Sebanyak 1 µl loading dye dicampurkan dengan 5 µl sampel
DNA, kemudian campuran tersebut dihomogenkan dengan cara dihisap dan
dikeluarkan berulang kali menggunakan mikropipet. Campuran tersebut
kemudian dimasukkan ke dalam sumur (well) yang terdapat dalam gel.
Penentuan panjang fragmen daerah ITS dilakukan menggunakan DNA
marker ukuran 1 Kb (DNA ladder) sebanyak 1 µl yang dicampurkan dengan 1
µl loading dye yang dimasukkan pada sumur pertama.
Proses elektroforesis dilakukan menggunakan alat elektroforesis
[Advance] dengan buffer TAE 1X dan tegangan listrik 100 V. Proses
elektroforesis berlangsung selama 30 menit. Selanjutnya gel direndam
dalam larutan EtBr selama 20 menit kemudian dibilas menggunakan air. Gel
diamati menggunakan Gel Documentation System [BIO-RAD] yang
tersambung dengan komputer untuk melihat perpendaran pita-pita (band)
DNA hasil produk PCR, kemudian didokumentasikan menggunakan program
Gel Doc XR.
Identifikasi Khamir..., Anisa Retno Ediningsari, FMIPA UI, 2008
31
8. Cycle sequencing, purifikasi produk Cycle sequencing dan sequencing
Cycle sequencing dan sequencing dilakukan di Lembaga Biologi
Molekular Eijkman, Jakarta dan Laboratorium Bioteknologi BPPT Serpong.
Reaksi cycle sequencing dilakukan di Lembaga Biologi Molekular
Eijkman, Jakarta. Total volume sebanyak 15 µl terdiri atasi: 6 µl big dye
terminator ready reaction mix, 1 µl primer ITS5 (5 pmol/µl), 1 µl produk PCR,
dan 7 µl distilled water. Cycle sequencing dilakukan dengan kondisi sebagai
berikut: denaturasi awal pada suhu 96° C selama 2 menit. Reaksi kemudian
dilanjutkan sebanyak 25 siklus dengan kondisi sebagai berikut: denaturasi
pada suhu 96° C selama 10 detik, annealing pada suhu 50° C selama 5 detik,
dan polimerisasi pada suhu 60° C selama 4 menit.
Reaksi cycle sequencing dilakukan di laboratorium bioteknologi BPPT,
Serpong. Total volume sebanyak 10 µl terdiri atas: 1 µl big dye terminator, 1
µl primer ITS5 (5 pmol/µl), 1 µl produk PCR, buffer 2 µl dan 5 µl distilled
water. Cycle Sequencing dilakukan dengan kondisi sebagai berikut:
denaturasi awal pada suhu 96° C selama 1 menit, kem udian dilanjutkan
sebanyak 25 siklus dengan kondisi sebagai berikut: denaturasi pada suhu
96° C selama 10 detik, annealing pada suhu 50° C selama 5 detik, dan
polimerisasi pada suhu 60° C selama 1 menit 30 deti k.
Produk cycle sequencing, yang berasal dari Lembaga Biologi
Molekular Eijkman maupun di Laboratorium Bioteknologi BPPT Serpong,
kemudian dipurifikasi dengan metode presipitasi etanol untuk menghilangkan
Identifikasi Khamir..., Anisa Retno Ediningsari, FMIPA UI, 2008
32
sisa reagen yang dapat mengganggu pembacaan urutan nukleotida pada
proses selanjutnya. Proses purifikasi adalah sebagai berikut: produk PCR
ditambahi 10 µl ddH2O hingga volume mencapai 20 µl, kemudian ditambahi 2
µl 1,25 M EDTA, 2 µl 3 M NaOAc dan 50 µl EtOH absolut. Tabung ditutup
dengan lembar aluminium dan dihomogenkan dengan cara tabung dibolakbalik lalu didiamkan pada suhu kamar selama 15 menit. Campuran
kemudian disentrifugasi 3.000 rpm selama 10 menit pada suhu 20° C.
Supernatan dibuang, kemudian pelet dikeringkan dengan cara divakum
selama 20 menit. Selanjutnya campuran ditambahi ddH2O sebanyak 12 µl
dan dipanaskan pada suhu 42° C selama 10 menit. Pr oduk siap digunakan
untuk proses sequencing. Proses sequencing di Lembaga Biologi Molekular
Eijkman, Jakarta menggunakan mesin sequencer [Applied Biosystem
3130XL] sedangkan sequencing di laboratorium bioteknologi BPPT, Serpong
menggunakan mesin sequencer [Applied Biosystem 3100].
Identifikasi Khamir..., Anisa Retno Ediningsari, FMIPA UI, 2008
33
9. Deskripsi morfologi khamir
a. Pembuatan Slide culture
Pembuatan slide culture untuk pengamatan adanya miselium sejati
maupun miselium palsu dilakukan berdasarkan Yarrow (1998: 83). Miselium
sejati adalah struktur menyerupai tabung atau jalinan benang panjang dan
terbentuk dari spora sedangkan miselium palsu terbentuk dari sel anak yang
tidak terlepas dari sel induk pada saat pertunasan sel vegetatif (Yarrow 1998:
83). Gelas obyek steril diletakkan di dalam cawan petri. Medium CMA
kemudian dituangkan ke atas gelas obyek tersebut sehingga menghasilkan
lapisan tipis medium. Biakan khamir digoreskan menggunakan jarum ose di
sepanjang gelas obyek setelah medium mengering, kemudian ditutup dengan
kaca obyek steril. Dua buah kertas saring steril yang sudah dicelupkan ke
dalam akuades steril kemudian diletakkan di kedua sisi gelas obyek tersebut.
Biakan diinkubasi selama 7 hari pada suhu ruang dan kertas saring sesekali
diganti untuk menjaga kelembapan. Preparat yang berusia 7 hari kemudian
dikeluarkan dari cawan petri dan digunakan untuk pengamatan mikroskopik.
Pengamatan mikroskopik dilakukan menggunakan mikroskop dengan
perbesaran 10 X 100 dengan bantuan minyak imersi untuk mengamati ada
atau tidaknya pembentukan miselium sepanjang garis inokulasi, di bawah
maupun di sekitar kaca obyek.
Identifikasi Khamir..., Anisa Retno Ediningsari, FMIPA UI, 2008
34
b. Pengamatan makroskopik koloni pada medium padat
Pembuatan kultur untuk pengamatan makroskopik pada medium padat
dilakukan menggunakan medium YMA dan MEA 5%. Sel khamir
diinokulasikan dengan metode empat kuadran gores ke dalam medium
kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 48 jam kemudian diinkubasi
hingga satu bulan. Pengamatan makroskopik dilakukan pada koloni sel yang
berusia 48 jam dan satu bulan berdasarkan Yarrow (1998: 81--82).
Karakteristik morfologi makroskopik koloni khamir yang diamati pada medium
padat antara lain: tekstur, warna, penampakan permukaan, profil, dan tepi
koloni.
c. Pengamatan makroskopik koloni pada medium cair
Pembuatan kultur untuk pengamatan makroskopik pada medium cair
dilakukan menggunakan medium YMB dan MEB 5%. Sebanyak satu ose
biakan khamir diinokulasikan ke dalam medium cair kemudian diinkubasi
pada suhu ruang selama 48 jam kemudian diinkubasi hingga satu bulan.
Pengamatan makroskopik khamir dilakukan pada sel yang memiliki usia 48
jam dan satu bulan berdasarkan Kirsop dkk. (1984: 97). Karakter
makroskopik yang diamati pada medium cair adalah keberadaan cincin,
pelikel pada permukaan medium serta endapan pada dasar medium.
Identifikasi Khamir..., Anisa Retno Ediningsari, FMIPA UI, 2008
35
d. Pengamatan mikroskopik pada medium cair
Pembuatan kultur untuk pengamatan makroskopik pada medium cair
dilakukan menggunakan medium YMB dan MEB 5%. Sebanyak satu ose
biakan khamir diinokulasikan ke dalam medium cair kemudian diinkubasi
pada suhu ruang selama 48 jam. Pengamatan mikroskopik khamir dilakukan
berdasarkan Yarrow (1998: 81). Sebanyak satu ose biakan khamir diambil
dan diletakkan di atas gelas obyek kemudian ditutup dengan kaca obyek.
Preparat diamati menggunakan mikroskop dengan perbesaran 10 X 100
dengan bantuan minyak imersi. Karakteristik yang diamati antara lain bentuk
sel, keberadaan miselium palsu maupun miselium sejati dan tipe pertunasan.
Pengukuran panjang dan lebar sel juga dilakukan terhadap 20 sel khamir
menggunakan lensa mikrometer okuler.
10. Penyusunan dan analisis data
Penelitian bersifat non eksperimental. Data hasil pengukuran
kuantitas DNA mengggunakan spektrofotometer disajikan dalam bentuk tabel
(Tabel 1). Data yang diperoleh setelah sequencing berupa elektroferogram
(Lampiran 3--14) dan text file data sequence. Data sequence yang diperoleh
kemudian dapat dilakukan editing secara manual dengan program bioedit
berdasarkan hasil elektroferogram. Data sequence dalam format FASTA
kemudian dikirimkan ke situs http://www.ncbi.nlm.nih.gov untuk mencari
homologi terhadap database sequence daerah ITS khamir yang telah
Identifikasi Khamir..., Anisa Retno Ediningsari, FMIPA UI, 2008
36
diketahui, menggunakan program BLASTN. Identifikasi dilakukan
berdasarkan persentase homologi (% identities) yang tertinggi antara
sequence isolat yang dikirim dengan sequence spesies khamir yang terdekat
pada database GenBank.
Nilai % identities yang tinggi harus didukung oleh E value yang
rendah, serta nilai bit score dan total query coverage yang tinggi untuk dapat
menarik kesimpulan mengenai identitas query (BLAST Tutorial 2004: 1).
Hasil pencarian homologi sequence menggunakan program BLAST disajikan
dalam bentuk gambar (Gambar 5--16). Data pengamatan morfologi
makroskopik dan mikroskopik disajikan dalam bentuk tabel (Tabel 4--8) untuk
membantu menarik kesimpulan mengenai identitas isolat. Data pengamatan
morfologi juga digunakan sebagai tambahan informasi mengenai karakter
fenotip dari isolat-isolat tersebut. Data hasil identifikasi disajikan dalam
bentuk gambar dan tabel (Gambar 17--20 dan Tabel 2--3).
Identifikasi Khamir..., Anisa Retno Ediningsari, FMIPA UI, 2008