29 METODOLOGI Waktu dan Tempat Penelitian

29
METODOLOGI
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan mulai Bulan September 2011 sampai dengan Bulan
September 2012 di Laboratorium Kalbe Genomic, Stem cell and Cancer Institute
(SCI), PT Kalbe Farma, Tbk. Jakarta.
Bahan
Sel kultur yang digunakan sebagai kontrol adalah sel HCT-116 (Human
Colon Tumour), BT-549 (Human Breast Carcinoma), dan A-549 (Human Lung
Carcinoma), yang diperoleh dari koleksi sel kultur Laboratorium Kalbe Genomic,
SCI. DNA standar EGFR ekson 21 diperoleh dari IDT DNA (Iowa, USA) yang
telah memiliki sertifikat kemurnian dan ketepatan susunan basa yang teruji.
Sampel cairan pleura pasien kanker paru diperoleh dari Departemen Pulmonologi
dan Respirasi FKUI/SMF Paru Rumah Sakit Persahabatan Jakarta melalui
prosedur dan etika pengambilan sampel yang telah disetujui Komisi Etika
Penelitian Kesehatan Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia (Lampiran 1).
Sampel yang diperoleh dalam bentuk kertas saring. Koleksi sampel cairan pleura
dan pengeringan pada kertas saring dilakukan oleh dokter ahli dan secara selektif
dipilih dari pasien kanker paru, bukan dari penderita penyakit Tuberkulosis atau
infeksi lainnya.
Prosedur Kerja
1)
Pengembangan metode HRM dan RFLP untuk mengenali mutasi gen KRAS
dan EGFR pada DNA standar
Dalam tahapan ini dilakukan penentuan pola grafik standar DNA wild type
dan DNA mutan pada hasil analisis HRM dan pola pita hasil pemotongan enzim
pada analisis metode RFLP. DNA yang digunakan sebagai DNA cetakan
diperoleh dari DNA sel kultur standar yang diketahui memiliki mutasi gen KRAS
dan sekuen DNA yang memiliki mutasi gen EGFR.
Analisis PCR-HRM KRAS dan EGFR
Analisis HRM dilakukan menggunakan alat Real Time-PCR Rotor-Gene
6000TM (Corbett Research, Sydney, Australia). Analisis PCR-HRM KRAS
dilakukan sesuai dengan metode yang telah dilakukan Krypuy et al. (2006).
Reagen PCR terdiri atas: 1x PCR buffer, 2,5 mM MgCl2, 200 nM primer, 200 µM
dNTPs, 5µM SYTO9, 0,5 U Enzim Taq Polymerase dan air PCR grade hingga
volume 20 µL. Kondisi PCR yang digunakan adalah praPCR pada suhu 950 C
selama 15 menit, 40 siklus PCR dengan tahapan denaturasi pada suhu 950 C
selama 15 detik, annealing pada suhu 67,50C selama 15 detik, polimerisasi pada
suhu720C selama 15 detik dan satu siklus post-PCR pada suhu 950C selama 1
detik, dilanjutkan dengan melting DNA (HRM) pada suhu 72–950C dengan
kecepatan kenaikan temperatur sebesar 0,20C/detik.
30
Analisis PCR-HRM EGFR dilakukan menurut Hongdo et al. (2008).
Reagen PCR terdiri atas: 1x PCR buffer, 2,5 nM MgCl2, 200-400 nM primer, 200
µM dNTPs, 5µM SYTO9, 0,5 U enzim Taq Polymerase dan air PCR grade hingga
volume 20 µL. Kondisi PCR yang digunakan adalah pra-PCR pada suhu 950 C
selama 15 menit, 50 siklus PCR dengan tahapan denaturasi pada suhu 950 C
selama 10 detik, annealing pada suhu 650C selama 10 detik, dan polimerisasi pada
suhu 720C selama 30 detik, dan post-PCR pada suhu 970C selama 1 detik,
dilanjutkan dengan melting DNA pada suhu 70–950C dengan kecepatan kenaikan
temperatur sebesar 0,20C/detik.
Analisis RFLP KRAS kodon 12 dan 13
Produk PCR gen KRAS diperoleh melalui 2 kali proses PCR, first PCR dan
nested PCR. Mix PCR terdiri atas 500 nM primer, 1 x PCR buffer+MgCl2, 200
nM dNTP, 1,25 U enzim TaqPolymerase, H2O dan DNA cetakan. Kondisi PCR
yang digunakan adalah 1 siklus pra-PCR pada suhu 950C selama 5 menit, 18-20
siklus PCR dengan tahapan denaturasi pada suhu 950C selama 1 menit, annealing
pada suhu 50 - 550C selama 1 menit, dan polimerisasi pada suhu 720C selama 2
menit, dan satu siklus post-PCR pada suhu 720 C selama 2 menit. Untuk suhu
penempelan primer pada first PCR KRAS kodon 13 dilakukan pada suhu 630 C
selama 1 menit. Suhu annealing PCR KRAS 12 dan 13 dilakukan secara gradien
pada suhu 50 – 630C. First PCR dilakukan selama 18 – 20 siklus dan nested PCR
dilakukan selama 30 – 35 siklus.
Analisis RFLP produk PCR KRAS kodon 12 menggunakan produk PCR
sebanyak 15 µL yang dipotong dengan 20 U enzim BstNI. Analisis RFLP hasil
nested PCR KRAS kodon 13 menggunakan produk PCR sebanyak 15 µL yang
dipotong dengan 20 U enzim Bgl I. Hasil RFLP dimigrasikan dengan
elektroforesis pada gel agarosa dengan konsentrasi agarosa 2,5%. Elektroforesis
dilakukan selama 60 menit pada tegangan 100 volt. Gel diwarnai dengan 0,5
µg/mL EtBr dan dilihat pita yang terbentuk menggunkan transiluminator UV.
Analisis RFLP EGFR ekson 21
Produk PCR gen EGFR ekson 21 diperoleh melalui 2 kali proses PCR, first
PCR dan nested PCR menurut prosedur Kawada et al. (2008). Larutan mix PCR
terdiri atas 0,2 µM primer, 1 x PCR buffer+MgCl2, 0,2 µM dNTP, 0,5 U enzim
taq polymerase, H2O dan DNA cetakan. Kondisi PCR yang digunakan adalah 1
siklus pra-PCR pada suhu 950C selama 15 menit, 18-20 siklus PCR dengan
tahapan denaturasi pada suhu 950C selama 30 detik, annealing pada suhu 630 C
selama 30 detik, polimerisasi pada suhu 720C selama 1 menit, dan satu siklus
post-PCR pada suhu 720C selama 3 menit. First PCR dan nested PCR masingmasing dilakukan selama 30 – 40 siklus.
Analisis RFLP produk PCR EGFR ekson 21 kodon L858R menggunakan
produk PCR sebanyak 10 µL yang dipotong dengan 5 U enzim MscI. Analisis
RFLP produk PCR EGFR ekson 21 kodon L861Q menggunakan produk PCR
sebanyak 10 µL yang dipotong dengan 10 U enzim PvuII. Hasil RFLP
dimigrasikan dengan elektroforesis pada gel agarosa dengan konsentrasi agarosa
2,5%. Elektroforesis dilakukan selama 60 menit pada tegangan 100 volt. Gel
diwarnai dengan 0,5 µg/mL EtBr dan dilihat pita yang terbentuk menggunkan
transiluminator UV.
31
2)
Uji sensitivitas Metode HRM dan RFLP
Uji sensitivitas dilakukan untuk mengetahui jumlah minimum sel kanker
pada sampel sehingga analisis mutasi gen menghasilkan data yang akurat. Dalam
hal ini digunakan perbandingan komposisi DNA yang diisolasi dari sel kultur
yang sudah diketahui merupakan sel yang mengalami mutasi gen dengan DNA
dari sel yang tidak mengalami mutasi/wild type.
Uji sensitivitas metode HRM dan RFLP dalam analisis mutasi gen KRAS
dilakukan dengan mencampurkan DNA kultur sel HCT116 (kontrol mutan
heterozigot) dengan DNA kultur sel BT549 (kontrol wild type) dan DNA kultur
sel A549 (kontrol mutan homozigot) dengan DNA kultur sel BT (kontrol wild
type). DNA yang digunakan memiliki konsentrasi 25 ng/µL dengan perbandingan
konsentrasi DNA sel mutan dan DNA sel wild type sebesar 100%:0%, 50%:50%,
25%:75%, 12,5%:87,5%, 6,25%:93,75%, 3,125%:96,875%, dan 0%:100%.
Uji sensitivitas metode HRM dan RFLP dalam analisis muatsi gen EGFR
dilakukan dengan mencampurkan sekuen DNA yang memiliki mutasi titik L858R
pada ekson 21 dengan sekuen DNA yang tidak memiliki mutasi (kontrol wild
type). DNA yang digunakan memiliki konsentrasi 1 ng/µL dengan perbandingan
komposisi DNA mutan dan DNA wild type sebesar 100%:0%, 50%:50%,
25%:75%, 12,5%:87,5%, 6,25%:93,75%, 3,125%:96,875%, dan 0%:100%.
3)
Isolasi DNA dari Cairan Pleura pada Kertas Saring
Kertas saring yang mengandung cairan pleura kering dipotong dengan
ukuran 0,5 cm x 0,5 cm. Isolasi DNA dilakukan dengan menggunakan reagen
High Pure PCR Template Isolation Kit (Rosche). Prosedur isolasi DNA dilakukan
sesuai dengan protokol yang terdapat pada manual instruction kit, kemudian
disimpan pada suhu -200C sebelum digunakan. DNA yang telah diisolasi
ditentukan konsentrasinya menggunakan alat nanodrop.
4)
Analisis mutasi gen KRAS dan EGFR pada sampel kertas saring yang
mengandung cairan pleura
DNA hasil isolasi dari kertas saring sebanyak 1 µL kemudian dijadikan
sebagai DNA cetakan pada proses analisis menggunakan metode PCR-HRM dan
RFLP sesuai dengan prosedur yang telah dilakukan pada pada analisis DNA
standar.
5)
Analisis Data
Hasil analisa profil HRM dan RFLP gen KRAS dan EGFR sampel dibandingkan
dengan profil DNA standar wild type dan DNA standar mutan sehingga dapat
diketahui jenis profil gen sampel apakah termasuk wild type atau mutan.
Penentuan prevalensi mutasi gen EGFR dan KRAS dilihat berdasarkan presentasi
jumlah sampel yang menunjukkan profil mutan.