BAB 5. PREPARASI SAMPEL Dalam aspek analisis pangan dan hasil pertanian, sampel merupakan contoh yang diambil dari suatu bahan yang jumlahnya banyak yang dinamakan populasi yang akan digunakan untuk keperluan analisis. Sampel harus representatif, artinya mencerminkan sifat-sifat bahan asalnya. Ini berarti semua bagian baik secara fisik ataupun kimiawi yang terdapat atau dimiliki oleh bahan dasar sebanyak mungkin terdapat pula dalam sampel. Hal ini hanya dapat dicapai jika bahan dasar baik secara fisik maupun kimiawi bersifat homogen. Oleh karena itu harus ada suatu metoda atau teknik pengambilan sampel sehingga sampel benar-benar mencerminkan populasi. Bahan yang semula tidak homogen harus dibuat menjadi homogen. Pengertian ini berlaku untuk semua bahan dasar yang akan dianalisis dalam segala bentuk, keadaan, dan penanganan. Meskipun demikian penyiapan sampel dapat berbeda untuk bahan yang satu dengan bahan yang lain dalam keadaan yang lain serta untuk metode yang satu dengan metode yang lain. Beberapa perlakuan umum dalam penyiapan dan preparasi sampel adalah ekstraksi, filtrasi, homogenisasi, sentrifugasi, lisis, dialisis, inaktivasi enzim, dan modifikasi kimiawi. 5-1 PERLAKUAN UMUM PADA PENYIAPAN SAMPEL Ekstraksi Perlakuan ini dapat dikerjakan dengan berbagai cara, baik secara fisik maupun secara kimiawi. Secara fisik dapat dilakukan dengan pengepresan (pengempaan), penggilingan, pengendapan fisik (kristalisasi), pengendapan kimiawi (penggumpalan), dan distilasi. Secara kimiawi dilakukan dengan cara pelarutan dengan pelarut. Metode distilasi merupakan ekstraksi dan pemisahan atas dasar perbedaan titik uapnya. Distilasi dapat dilakukan dengan cara sederhana, misalnya distilasi air, distilasi uap, distilasi uap dan air, dapat pula dilakuan dengan teknik fraksinasi (distilasi fraksinasi), atau distilasi vakum. Cara ekstraksi lainnya yang relatif merupakan teknologi barn adalah penggunaan teknik superkritik (super critical extraction). Filtrasi Adalah cara untuk memisahkan dua komponeit yang berbeda sifatnya atau ukurannya melalui sebuah membran permiabel yang poreus. Filtrasi dapat dilakukan dengan teknik penyaringan. Penyaringan lazim digunakan untuk memisahkan padatan dan cairan yang bercampur menjadi satu dan tidak lazim untuk memisahkan campuran dua macam cairan yang berbeda berat jenisnya. Dalam praktek penyaringan Universitas Gadjah Mada dikerjakan dengan menggunakan bahan penyaring yang berupa membran. Sebagai membran dapat digunakan kain saring, kapas, glasswool, kertas selulosa, membran silika, membran millipore, poliester atau nilon, dan sebagainya. Bahan-bahan lain yang dapat digunakan untuk menyaring adalah polietilen, polipropilen, fluorokarbon, bahkan benang halus logam baja tahan karat juga dapat digunakan sebagai bahan pembuat membran penyaring. Partikel-partikel yang halus atau molekul-molekul harus disaring dengan membran yang mempunyai pori-pori lebih kecil, yang bahan-bahannya juga dapat berupa selulosa, selulosa ester, polikarbonat, nion, atau politetra fluoroetilen. Yang terpenting sebagai bahan penyaring adalah harus yang bersifat inert artinya tidak bereaksi dengan bahan yang disaring. Selain itu bahan penyaring harus tahan panas, tidak terpengaruh oleh asam atau basa dan tidak mempengaruhi pH bahan yang disaring. Membran-membran tersebut poreus, tergantung pada garis tengah lubang pori-porinya maka hanya partikel-partikel padatan yang lebih kecil atau sama dengan garis tengah pori-pori tersebut dapat melaluinya. Atas dasar inilah penyaringan selalu akan menghasilkan filtrat yang masih mengandung partikel-partikel padatan yang dapat berupa butiran kasar, halus, atau berupa molekul-molekul. Kain sating merupakan membran penyaring yang masth dapat meloloskan partikelpartikel padatan kasar, kertas sating masih memungkinkan lolosnya partikel halus, dan membran siika masth meloloskan partikel yang ukurannya lebih kecil lagi bahkan beberapa jenis membran silika tidak lagi meloloskan sel-sel bakteri, sedangkan membran milliphore kebanyakan hanya meloloskan molekul-molekul yang larut saja. Berdasarkan porositasnya, bahan penyaring dapat dgolongkan dalam beberapa tipe yaitu tipe halus, kasar, medium, dan molekuler. Tipe penyaring kasar merupakan penyaring yang pori-porinya paling besar di banding dengan tipe-tipe penyaring lainnya. Tipe penyaring molekuler adalah penyaring dengan diameter pori-pori yang hanya dapat dilalui oleh molekul-molekul bahan. Tipe penyaring dan bahan kertas saring adalah sebagai berikut: Beberapa tipe kertas saring dan spesifikasinya Universitas Gadjah Mada Penyaringan dapat berlangsung lancar jika digunakan alat penolong yang disebut dengan corong. Alat ini pada umumnya berbentuk kerucut terbalik dengan ujungnya berlubang yang disambung dengan pipa. Membran penyaring dapat diletakkan di dalamnya. Beberapa corong tidak berbentuk kerucut melainkan berupa tabung silindris tegak yang di bagian dasarnya diletakkan membran penyaring dan terdapat lubang pengeluaran seperti misalnya pada alat penyaring Buchner, penyaring Hirch, sinterglass, atau penyaring ultra. Corong Penyaring Corong Buchner Sintergiass Penyaring ultra Gambar 2-3 Beberapa tipe alat penyaring Alat-alat penyaring tersebut mempunyai kegunaan yang berbeda. Sebagai contohnya cairan yang dingin lebih baik disaring dengan menggunakan corong Buchner, sedangkan cairan yang korosif (asam atau basa) disaring dengan menggunakan sintergiass atau corong penyaring dengan membran penyaring glasswool. Corong Hirch umumnya digunakan untuk menyaring cairan yang jumlahnya sedikit, sementara penyaring ultra digunakan sebagai penyaring molekuler. Homogenisasi Jika sampel mempunyai sifat-sifat yang terdistribusi tidak merata, maka pekerjaan ini bertujuan supaya sifat-sifat tersebut dapat terdistribusi merata sehingga homogen. Homogenisasi juga mempunyai beberapa tujuan lainnya, yaitu antara lain untuk menyesuaikan ukuran atau kondisi sampel sehingga memudahkan teijadinya proses kimiawi (misalnya reaksi, interaksi, dll.), proses fisikawi (misalnya difusi panas, dli.). Homogensisasi dapat dilakukan dengan menggunakan alat homogenizer, chopper, warring blender, menggunakan metode penggilingan (penepungan), vortexing, penggojogan, dan lain sebagainya. Universitas Gadjah Mada Sentrifugasi Tujuan utama sentrifugasi adaiah memisahkan partikel-partikel padatan dari cairan yang bercampur menjadi terpisah satu dengan yang lainnya. Jadi pada hakekatnya seperti filtrasi, tetapi pemisahan dengan sentrifugasi didasarkan pada perbedaan berat jenis partikel. Dalam hal ini gaya sentrifugasi sangat berpengaruh paa hasil. Makin tinggi gaya sentrifugasi makin teijadi pemisahan dengan baik. Pada umumnya gaya sentrifugasi diekspresikan dalam satuan “rotation per minute” (rpm). Satuan ini tidak menunjukkan keseragaman gaya pusingan yang terjadi untuk satu alat dengan alat yang lain yang berbeda demensinya meskipun kecepatan berputarnya sama. Untuk mengatasi hal ini, gaya sentrifugasi dapat dinyatakan dengan “relative centrifugal force” (rcf) yang besarnya adalah Besarnya g (gravitasi) rata-rata adalah 980g/cm2, tetapi untuk daerah yang satu dengan yang lain terdapat sedikit perbedaan besarnya. Lisis Biasanya dikerjakan untuk merusak atau memecah dinding sel tanaman, hewan, atau mikrobia. Pekerjaan ini dapat dilakukan secara fisik misalnya dengan penggilingan, penggerusan, atau dengan sonikasi. Seringkali dinding sel terlalu keras atau lentur, terutama sel-sel mikrobia, sehingga dengan perlakuan fisik tidak dapat terjadi lisis dengan sempurna. Untuk mengatasi hal tersebut dapat dilakukan dengan cara kimiawi, misalnya dengan menggunakan asam pekat seperti asam sulfat, asam klorida, asam asetat, dan lain sebagainya. Dialisis Perlakuan ini merupakan teknik pemisahan dengan menggunakan membran semipermiabel. Dialisis dapat berfungsi sebagai penyaring molekuler oleh karena yang dapat melalui membran umumnya adalah melekul-molekul yang ukurannya relatif kecil. Dialisis bekerja atas dasar peristiwa osmosis. Partikel-partikel (molekul) yang kecil akan dapat melalui membran sampai terjadi keseimbangan. Keseimbangan tercapai jika konsentrasi partikel dalam larutan pada sisi-sisi yang bersebelahan dengan membran sudah mencapai rasio yang seimbang dengan volume masing-masing larutan, yaitu C1:C2 = V1/(V1+V2) di mana C adalah konsentrasi dan V adalah volume larutan. Misalnya tabung dialisis dengan volume 10 ml diisi dengan larutan 0,1 M NaC1 Universitas Gadjah Mada dimasukkan ke dalam wadah yang berisi 100 ml larutan 0,1 M MgCl2, maka konsentrasi NaCl di dalam tabung dialisis setelah terjadi keseimbangan adalah (1/101) x 0,1 M = 0,00099 M NaCl dan konsentrasi MgCl2 di luar tabung dialisis setelah terjadi keseimbangan adalah (100/101) x 0,1M = 0,099M MgCl2. Di dalam praktek dianalisis digunakan untuk menghilangkan kontaminan molekul-molekul yang tidak dikehendaki. Inaktivasi Enzim Terdapatnya enzim sering kali dapat mengganggu hasil oleh karena enzim yang masih aktif dapat mengadakan perubahan-perubahan kimiawi. Misalnya pada elektroforesis, enzim protease dapat menguraikan protein atau peptida-peptida selama proses elektroforesis berlangsung. Enzim amilase dapat menguraikan gel tepung yang digunakan sebagai media elektroforesis karbohidrat. Oleh karena itu inaktivasi enzim perlu dilakukan supaya kejadian-kejadian tersebut tidak muncul. Inaktivasi enzim dapat dilakukan dengan cara fisik, misalnya dengan pemanasan, atau secara kimiawi dengan menggunakan denaturan (misalnya urea, guanidin hidrokiorida, merkaptoetanol, sodium dodesil sulfat, asam trikioro asetat, dan lain sebagainya), mengubah kondisi pH lingkungannya, menambahkan garam (NaC1), dan sebagainya. Modifikasi kimiawi dan enzimatik Perlakuan ini bertujuan untuk mengubah struktur kimiawi sampel untuk suatu tujuan tertentu yang memudahkan analisis. Modifikasi kimiawi dapat dilakukan dengan cara melakuk derivatisasi misalnya metilasi pada asam lemak, dan penambahan agensia derivat seperti opa (ortoftalaldehida), ninhidrin, fluoroscamine, fenilisotiosianat, dansil kiorida, dabsil klorida, diaminoazobenzenisotiosianat, atau fluoronilmetilkioroformat untuk derivatisasi asam amino. Derivatisasi bertujuan untuk meningkatkan sifat larut suatu komponen, menaikkan atau menurunkan titik uap, mengionisasi komponen atau molekul, atau menyesuaikan sifat polaritas suatu senyawa organik. Cara modifikasi kimiawi lainnya adalah denaturasi. Hal ini dilakukan khusus untuk protein dengan beberapa tujuan. Yang pertama adalah memutus ikatanikatan tertentu yang bersifat nonkovalen sehingga struktur protein menjadi membuka. Tujuan yang kedua adalah memutuskan ikatan S-S yang bersifat kovalen yang terdapat pada protein terutama protein quaterner. Denaturasi juga bertujuan untuk menginaktifkan enzim atau peptida bioaktif lainnya. Hidrolisis kimiawi juga merupakan modifikasi kimiawi. Hidrolisis kimiawi dapat berlangsung jika ada air. Perlakuan panas pada hidrolisis ditujukan untuk mempercepat berlangsungnya proses. Modifikasi enzimatik urnumnya bertujuan memecah makromolekul menjadi fraksi-fraksi kecil atau penyusunnya. Hal ini dapat dilakukan dengan cara hidrolisis enzimatik misalnya protein Universitas Gadjah Mada dipecah menjadi peptida dan asam-asam amino dengan menggunakan protease seperti pepsin, tripsin, kimotripsin, dli., lemak dipecah oleh lipase menjadi gliserol dan asam-asam lemak, dan karbohidrat dipecah menjadi penyusun-penyusunnya oleh amilase atau selulase, atau oieh karbohidrase yang lain. 5-2 PENYIAPAN SAMPEL UNTUK ANALISIS ASAM LEMAK Analisis asam lemak paling populer dilakukan dengan rnenggunakan instrumen kromatografi gas meskipun dengan HPLC atau dengan teknik kromatografi lainnya dapat juga dilakukan. Untuk dapat melakukan analisis asam lemak diperlukan beberapa tahapan, yaitu ekstraksi lemak, pencegahan kontaminan, pencegahan terjadinya emulsi, menghilangkan komponen nonlipida, dan derivatisasi. Ekstraksi lemak Untuk memperoleh lemak dan sampel dapat dilakukan dengan metode pelarutan dengan menggunakan pelarut organik. Metode soxhiet extraction, metode Mojonier, Blich and Dyer, atau modifikasi dan caracara tersebut dapat digunakan. Pencegahan kontaminan Kontaminan umumnya berasal dan luar seperti penggunaan reagensia yang tidak murni, penggunaan peralatan yang tidak bersih dan tidak sesuai (misalnya tutup gabus, karet, atau plastik), dan lingkungan (misalnya adanya asap, gas, dll.), serta perilaku petugas yang tidak teliti (misalnya memasukkan jari ke dalam tabung/wadah). Oleh karena itu hal-hal tersebut perlu dihindani supaya dapat memperkecil kontaminasi. Pencegahan emulsi Emulsi terjadi umumnya oleh karena perlakuan pengadukan. Untuk mencegah terjadinya emulsi dapat dilakukan dengan sentnifugasi pada 600-700 x g, kemudian dipisahkan emulsi yang terpisah. Menghilanghkan komponen nonlipida Pada waktu ekstraksi lemak, berbagai komponen nonlipida mungkin dapat terikut serta. Untuk menghilanglcan komponen nonlipida, sampel lemak dapat dicuci dengan sedikit air atau lebih baik jika digunakan larutan garam ringan. Pencucian dilakukan dengan menggunakan corong pemisah. Fase air dibuang sedangkan fase lemaknya dikumpulkan dan dielusikan ke dalam kolom selulosa. Ukuran kolom adalah 2,5 cm x (20-30) cm. Sebelumnya kolom dicuci dengan metanol-air (1:1) sebanyak 7 x volume kolom dengan kecepatan 3ml/menit, kemudian dicuci dengan kloroformmetanol (1:1) sebanyak 3 x volume kolom, dan dicuci dengan kloroform-metanol (9:1) Universitas Gadjah Mada sebanyak 4 x volume kolom, barn seteiah itu digunakan untuk mengelusi sampel. Eluat yang keluar digunakan untuk analisis. Jika analisis asam lemak dilakukan dengan kromatografi gas, maka minyak yang terdapat dalam eluat dipisahkan dengan menguapakan pelarut organiknya. Minyak yang diperoleh kemudian diturunkan (derivatisasi) dengan cara metilasi. Tujuan metilasi adalah menaikkan titik uap asam lemak sehingga memudahkan untuk memisahkan asam lemak berdasarkan perbedaan titip uapnya. Metilasi dapat dikerjakan dengan menggunakan boron trifluorida, asam sulfat, sam kiorida, asetil klorida, yang dicampur dengan metanol. Metilasi dapat dikerjakan pada kondisi asam ataupun basis. 5-3 PENYIAPAN SAMPEL UNTUK ANALISIS ASAM AMINO DENGAN HPLC Asam amino yang akan dianalisis harus dalam keadaan murni dan bebas. Hal ini dapat diperoleh melalui beberapa tahapan, yaitu menghilangkan lipida yang terdapat dalam sampel, menghilangkan asam nukleat (jika sampel merupakan bahan biologik), menghilangkan karbohidrat, ekstraksi protein, menghilangkan garam (desalting), hidrolisis protein menjadi asam amino bebas, dan derivatisasi. Menghilangkan komponen lipida Hal ini dapat dikerjkan dengan mengekstraksi lipida dengan aseton, kemudian diulangi dengan benzena-etanol absolut panas, dengan etanol panas, dan terakhir dengan ether, masing-masing dilakukan dua kali dengan volume masing-masing 10 x berat sampel. Residu pelarut organik pada sarnpel dthilangkan dengan penguapan. Menghilangakn asam nukleat Jika sampel merupakan bahan biologik, maka asam nukleat dapat dihilangkan dengan hidrolisis sampel yang telah dihilangkan lemaknya dengan larutan 10% NaC1 pada suhu 85°C selama 6 jam. Residu NaCl dihilangkan dengan pencucian menggunakan air kemudian dengan aseton panas. Menghilangkan karbohidrat Sampel yang telah dihilangkan lipida dan asam nukleatnya harus dihilangkan karbohidratnya. Untuk itu dapat dilakukan dengan beberapa cara: 1. Dengan hidrolisis enzimatik menggunakan enzim amilolitik. Dalam praktek dilakukan sebagai berikut. Sampel digiling lembut kemudian disuspensikan dalam air hangat dan diatur pHnya pada nilai pH 4,5 dengan menggunakan larutan asam asetat. Kemudian diencerkan dua kali dan dinetralkan (pH 7,0) dengan larutan NaOH. Setelah diatur kondisinya pada suhu 37°C kemudian ditambahkan enzim. Hidrolisis berlangsung selama kurang lebih semalam. Setelah selesai hidrolisis, Universitas Gadjah Mada protein dipisahkan dengan sentrifugasi dan diendapakan dengan aseton, benzenaetanol panas, etanol, lalu dengan eter. 2. Ekstraksi dengan larutan asam hidroklorida. Ekstraksi dilakukan dengan larutan 21% HC1. Di dalam ekstrak terdapat protein terlarut, karbohidrat (tepung) diendapkan dengan menambahkan etanol. Larutan yang mengandung protein larut dipisahkan. 3. Ekstraksi dengan asarn trikiorasetat. Cara ini kebalikan dengan butir (2). Dalam ekstrak terdapat karbohidrat yang terlarut sementara protein terendapkan yang dapat dipisahkan dengan penyaringan. 4. Ekstraksi protein dengan asam format. Ekstraksi dikerjakan dengan menambahkan larutan 90% asam format pada sampel. Protein akan terdapat dalam asam format dalam keadaan larut. Selanjutnya setelah dipisahkan proteinnya dapat diendapkan dengan menambahkan etanol untuk mengendapakan residu karbohidrat yang terikut. Desalting Tujuannya adalah untuk menghilangkan garam mineral yang mungkin terdapat dalam sampel. Desalting dapat dilakukan dengan melalukan sampel ke dalam kolom penukar ion misalnya dengan menggunakan resin (Doulite C-3, Amberlite IR- 120, dll.). sebelum digunakan kolom dicuci dulu dengan air sampai semua ion (anion dan kation) menjadi hilang. Hidrolisis Bertujuan untuk membebaskan asam-asam amino dan ikatan peptida pada protein. Hidrolisis dapat menggunakan asam sulfat pekat, asam klorida pekat, atau asam format. Meskipun demikian penggunaan asam klorida untuk menghidrolisis protein menjadi asam-asam amino lebih banyak dikedakan. Dalam hal ini sampel dicampur dengan larutan 6N HCl sebanyak 2,5-5000 x berat sampel selama 18-24 jam dalam keadaan vakum atau di bawah kondisi gas inert (misalnya gas nitrogen) dan suhu 100-110oC. Keiebihan asam kiorida diuapkan dengan penguapan vakum (misalnya menggunakan rotary evaporator vakum). Derivatisasi Setelah memperoleh asam amino bebas, kemudian dilakukan derivatisasi untuk memudahkan pelarutan asam amnio dan memanipulasi polaritasnya. Reagen yang dapat digunakan untuk derivatisasi asam amino antara lain ortoftalaidehida (OPA), ninhidrin, fluoroscamine, fenilisotiosianat, dansil kiorida, dabsil klorida, diaminoazobenzenisotiosianat, dan fluorometil kloromeformat. Universitas Gadjah Mada 5-4 LATIHAN PEMAHAMAN MATERI 1. Apakah yang dinamakan sampel? Sebutkan syarat-syarat yang harus dipenuhi sampel! 2. Mengapa satuan rpm kurang sesuai untuk mengekspresikan gaya sentrifugal? 3. Uraikan cara menyiapkan sampel untuk analisis asam lemak dengan kromatografi gas! Apa saja tujuan derivatisasi umumnya? Universitas Gadjah Mada