Universitas Gadjah Mada BAB 5. PREPARASI

BAB 5. PREPARASI SAMPEL
Dalam aspek analisis pangan dan hasil pertanian, sampel merupakan contoh
yang diambil dari suatu bahan yang jumlahnya banyak yang dinamakan populasi yang
akan digunakan untuk keperluan analisis. Sampel harus representatif, artinya
mencerminkan sifat-sifat bahan asalnya. Ini berarti semua bagian baik secara fisik
ataupun kimiawi yang terdapat atau dimiliki oleh bahan dasar sebanyak mungkin
terdapat pula dalam sampel. Hal ini hanya dapat dicapai jika bahan dasar baik secara
fisik maupun kimiawi bersifat homogen. Oleh karena itu harus ada suatu metoda atau
teknik pengambilan sampel sehingga sampel benar-benar mencerminkan populasi.
Bahan yang semula tidak homogen harus dibuat menjadi homogen. Pengertian ini
berlaku untuk semua bahan dasar yang akan dianalisis dalam segala bentuk, keadaan,
dan penanganan. Meskipun demikian penyiapan sampel dapat berbeda untuk bahan
yang satu dengan bahan yang lain dalam keadaan yang lain serta untuk metode yang
satu dengan metode yang lain. Beberapa perlakuan umum dalam penyiapan dan
preparasi sampel adalah ekstraksi, filtrasi, homogenisasi, sentrifugasi, lisis, dialisis,
inaktivasi enzim, dan modifikasi kimiawi.
5-1 PERLAKUAN UMUM PADA PENYIAPAN SAMPEL
Ekstraksi
Perlakuan ini dapat dikerjakan dengan berbagai cara, baik secara fisik maupun
secara kimiawi. Secara fisik dapat dilakukan dengan pengepresan (pengempaan),
penggilingan, pengendapan fisik (kristalisasi), pengendapan kimiawi (penggumpalan),
dan distilasi. Secara kimiawi dilakukan dengan cara pelarutan dengan pelarut. Metode
distilasi merupakan ekstraksi dan pemisahan atas dasar perbedaan titik uapnya.
Distilasi dapat dilakukan dengan cara sederhana, misalnya distilasi air, distilasi uap,
distilasi uap dan air, dapat pula dilakuan dengan teknik fraksinasi (distilasi fraksinasi),
atau distilasi vakum. Cara ekstraksi lainnya yang relatif merupakan teknologi barn
adalah penggunaan teknik superkritik (super critical extraction).
Filtrasi
Adalah cara untuk memisahkan dua komponeit yang berbeda sifatnya atau
ukurannya melalui sebuah membran permiabel yang poreus. Filtrasi dapat dilakukan
dengan teknik penyaringan. Penyaringan lazim digunakan untuk memisahkan padatan
dan cairan yang bercampur menjadi satu dan tidak lazim untuk memisahkan campuran
dua macam cairan yang berbeda berat jenisnya. Dalam praktek penyaringan
Universitas Gadjah Mada
dikerjakan dengan menggunakan bahan penyaring yang berupa membran. Sebagai
membran dapat digunakan kain saring, kapas, glasswool, kertas selulosa, membran
silika, membran millipore, poliester atau nilon, dan sebagainya. Bahan-bahan lain yang
dapat digunakan untuk menyaring adalah polietilen, polipropilen, fluorokarbon, bahkan
benang halus logam baja tahan karat juga dapat digunakan sebagai bahan pembuat
membran penyaring. Partikel-partikel yang halus atau molekul-molekul harus disaring
dengan membran yang mempunyai pori-pori lebih kecil, yang bahan-bahannya juga
dapat berupa selulosa, selulosa ester, polikarbonat, nion, atau politetra fluoroetilen.
Yang terpenting sebagai bahan penyaring adalah harus yang bersifat inert artinya tidak
bereaksi dengan bahan yang disaring. Selain itu bahan penyaring harus tahan panas,
tidak terpengaruh oleh asam atau basa dan tidak mempengaruhi pH bahan yang
disaring. Membran-membran tersebut poreus, tergantung pada garis tengah lubang
pori-porinya maka hanya partikel-partikel padatan yang lebih kecil atau sama dengan
garis tengah pori-pori tersebut dapat melaluinya. Atas dasar inilah penyaringan selalu
akan menghasilkan filtrat yang masih mengandung partikel-partikel padatan yang
dapat berupa butiran kasar, halus, atau berupa molekul-molekul. Kain sating
merupakan membran penyaring yang masth dapat meloloskan partikelpartikel padatan
kasar, kertas sating masih memungkinkan lolosnya partikel halus, dan membran siika
masth meloloskan partikel yang ukurannya lebih kecil lagi bahkan beberapa jenis
membran silika tidak lagi meloloskan sel-sel bakteri, sedangkan membran milliphore
kebanyakan hanya meloloskan molekul-molekul yang larut saja.
Berdasarkan porositasnya, bahan penyaring dapat dgolongkan dalam beberapa
tipe yaitu tipe halus, kasar, medium, dan molekuler. Tipe penyaring kasar merupakan
penyaring yang pori-porinya paling besar di banding dengan tipe-tipe penyaring
lainnya. Tipe penyaring molekuler adalah penyaring dengan diameter pori-pori yang
hanya dapat dilalui oleh molekul-molekul bahan. Tipe penyaring dan bahan kertas
saring adalah sebagai berikut:
Beberapa tipe kertas saring dan spesifikasinya
Universitas Gadjah Mada
Penyaringan dapat berlangsung lancar jika digunakan alat penolong yang
disebut dengan corong. Alat ini pada umumnya berbentuk kerucut terbalik dengan
ujungnya berlubang yang disambung dengan pipa. Membran penyaring dapat
diletakkan di dalamnya. Beberapa corong tidak berbentuk kerucut melainkan berupa
tabung silindris tegak yang di bagian dasarnya diletakkan membran penyaring dan
terdapat lubang pengeluaran seperti misalnya pada alat penyaring Buchner, penyaring
Hirch, sinterglass, atau penyaring ultra.
Corong Penyaring
Corong Buchner
Sintergiass
Penyaring ultra
Gambar 2-3
Beberapa tipe alat penyaring
Alat-alat penyaring tersebut mempunyai kegunaan yang berbeda. Sebagai
contohnya cairan yang dingin lebih baik disaring dengan menggunakan corong
Buchner, sedangkan cairan yang korosif (asam atau basa) disaring dengan
menggunakan sintergiass atau corong penyaring dengan membran penyaring
glasswool. Corong Hirch umumnya digunakan untuk menyaring cairan yang jumlahnya
sedikit, sementara penyaring ultra digunakan sebagai penyaring molekuler.
Homogenisasi
Jika sampel mempunyai sifat-sifat yang terdistribusi tidak merata, maka
pekerjaan ini bertujuan supaya sifat-sifat tersebut dapat terdistribusi merata sehingga
homogen. Homogenisasi juga mempunyai beberapa tujuan lainnya, yaitu antara lain
untuk menyesuaikan ukuran atau kondisi sampel sehingga memudahkan teijadinya
proses kimiawi (misalnya reaksi, interaksi, dll.), proses fisikawi (misalnya difusi panas,
dli.). Homogensisasi dapat dilakukan dengan menggunakan alat homogenizer,
chopper,
warring
blender, menggunakan metode penggilingan (penepungan),
vortexing, penggojogan, dan lain sebagainya.
Universitas Gadjah Mada
Sentrifugasi
Tujuan utama sentrifugasi adaiah memisahkan partikel-partikel padatan dari
cairan yang bercampur menjadi terpisah satu dengan yang lainnya. Jadi pada
hakekatnya seperti filtrasi, tetapi pemisahan dengan sentrifugasi didasarkan pada
perbedaan berat jenis partikel. Dalam hal ini gaya sentrifugasi sangat berpengaruh paa
hasil. Makin tinggi gaya sentrifugasi makin teijadi pemisahan dengan baik. Pada
umumnya gaya sentrifugasi diekspresikan dalam satuan “rotation per minute” (rpm).
Satuan ini tidak menunjukkan keseragaman gaya pusingan yang terjadi untuk satu alat
dengan alat yang lain yang berbeda demensinya meskipun kecepatan berputarnya
sama. Untuk mengatasi hal ini, gaya sentrifugasi dapat dinyatakan dengan “relative
centrifugal force” (rcf) yang besarnya adalah
Besarnya g (gravitasi) rata-rata adalah 980g/cm2, tetapi untuk daerah yang satu
dengan yang lain terdapat sedikit perbedaan besarnya.
Lisis
Biasanya dikerjakan untuk merusak atau memecah dinding sel tanaman,
hewan, atau mikrobia. Pekerjaan ini dapat dilakukan secara fisik misalnya dengan
penggilingan, penggerusan, atau dengan sonikasi. Seringkali dinding sel terlalu keras
atau lentur, terutama sel-sel mikrobia, sehingga dengan perlakuan fisik tidak dapat
terjadi lisis dengan sempurna. Untuk mengatasi hal tersebut dapat dilakukan dengan
cara kimiawi, misalnya dengan menggunakan asam pekat seperti asam sulfat, asam
klorida, asam asetat, dan lain sebagainya.
Dialisis
Perlakuan ini merupakan teknik pemisahan dengan menggunakan membran
semipermiabel. Dialisis dapat berfungsi sebagai penyaring molekuler oleh karena yang
dapat melalui membran umumnya adalah melekul-molekul yang ukurannya relatif kecil.
Dialisis bekerja atas dasar peristiwa osmosis. Partikel-partikel (molekul) yang kecil
akan dapat melalui membran sampai terjadi keseimbangan. Keseimbangan tercapai
jika konsentrasi partikel dalam larutan pada sisi-sisi yang bersebelahan dengan
membran sudah mencapai rasio yang seimbang dengan volume masing-masing
larutan, yaitu C1:C2 = V1/(V1+V2) di mana C adalah konsentrasi dan V adalah volume
larutan. Misalnya tabung dialisis dengan volume 10 ml diisi dengan larutan 0,1 M NaC1
Universitas Gadjah Mada
dimasukkan ke dalam wadah yang berisi 100 ml larutan 0,1 M MgCl2, maka
konsentrasi NaCl di dalam tabung dialisis setelah terjadi keseimbangan adalah (1/101)
x 0,1 M = 0,00099 M NaCl dan konsentrasi MgCl2 di luar tabung dialisis setelah terjadi
keseimbangan adalah (100/101) x 0,1M = 0,099M MgCl2. Di dalam praktek dianalisis
digunakan untuk menghilangkan kontaminan molekul-molekul yang tidak dikehendaki.
Inaktivasi Enzim
Terdapatnya enzim sering kali dapat mengganggu hasil oleh karena enzim
yang masih aktif dapat mengadakan perubahan-perubahan kimiawi. Misalnya pada
elektroforesis, enzim protease dapat menguraikan protein atau peptida-peptida selama
proses elektroforesis berlangsung. Enzim amilase dapat menguraikan gel tepung yang
digunakan sebagai media elektroforesis karbohidrat. Oleh karena itu inaktivasi enzim
perlu dilakukan supaya kejadian-kejadian tersebut tidak muncul. Inaktivasi enzim dapat
dilakukan dengan cara fisik, misalnya dengan pemanasan, atau secara kimiawi dengan
menggunakan denaturan (misalnya urea, guanidin hidrokiorida, merkaptoetanol,
sodium dodesil sulfat, asam trikioro asetat, dan lain sebagainya), mengubah kondisi pH
lingkungannya, menambahkan garam (NaC1), dan sebagainya.
Modifikasi kimiawi dan enzimatik
Perlakuan ini bertujuan untuk mengubah struktur kimiawi sampel untuk suatu
tujuan tertentu yang memudahkan analisis. Modifikasi kimiawi dapat dilakukan dengan
cara melakuk derivatisasi misalnya metilasi pada asam lemak, dan penambahan
agensia derivat seperti opa (ortoftalaldehida), ninhidrin, fluoroscamine, fenilisotiosianat,
dansil
kiorida,
dabsil
klorida,
diaminoazobenzenisotiosianat,
atau
fluoronilmetilkioroformat untuk derivatisasi asam amino. Derivatisasi bertujuan untuk
meningkatkan sifat larut suatu komponen, menaikkan atau menurunkan titik uap,
mengionisasi komponen atau molekul, atau menyesuaikan sifat polaritas suatu
senyawa organik. Cara modifikasi kimiawi lainnya adalah denaturasi. Hal ini dilakukan
khusus untuk protein dengan beberapa tujuan. Yang pertama adalah memutus ikatanikatan tertentu yang bersifat nonkovalen sehingga struktur protein menjadi membuka.
Tujuan yang kedua adalah memutuskan ikatan S-S yang bersifat kovalen yang
terdapat pada protein terutama protein quaterner. Denaturasi juga bertujuan untuk
menginaktifkan enzim atau peptida bioaktif lainnya. Hidrolisis kimiawi juga merupakan
modifikasi kimiawi. Hidrolisis kimiawi dapat berlangsung jika ada air. Perlakuan panas
pada hidrolisis ditujukan untuk mempercepat berlangsungnya proses. Modifikasi
enzimatik urnumnya bertujuan memecah makromolekul menjadi fraksi-fraksi kecil atau
penyusunnya. Hal ini dapat dilakukan dengan cara hidrolisis enzimatik misalnya protein
Universitas Gadjah Mada
dipecah menjadi peptida dan asam-asam amino dengan menggunakan protease
seperti pepsin, tripsin, kimotripsin, dli., lemak dipecah oleh lipase menjadi gliserol dan
asam-asam lemak, dan karbohidrat dipecah menjadi penyusun-penyusunnya oleh
amilase atau selulase, atau oieh karbohidrase yang lain.
5-2 PENYIAPAN SAMPEL UNTUK ANALISIS ASAM LEMAK
Analisis asam lemak paling populer dilakukan dengan rnenggunakan instrumen
kromatografi gas meskipun dengan HPLC atau dengan teknik kromatografi lainnya
dapat juga dilakukan. Untuk dapat melakukan analisis asam lemak diperlukan
beberapa tahapan, yaitu ekstraksi lemak, pencegahan kontaminan, pencegahan
terjadinya emulsi, menghilangkan komponen nonlipida, dan derivatisasi.
Ekstraksi lemak
Untuk memperoleh lemak dan sampel dapat dilakukan dengan metode
pelarutan dengan menggunakan pelarut organik. Metode soxhiet extraction, metode
Mojonier, Blich and Dyer, atau modifikasi dan caracara tersebut dapat digunakan.
Pencegahan kontaminan
Kontaminan umumnya berasal dan luar seperti penggunaan reagensia yang
tidak murni, penggunaan peralatan yang tidak bersih dan tidak sesuai (misalnya tutup
gabus, karet, atau plastik), dan lingkungan (misalnya adanya asap, gas, dll.), serta
perilaku petugas yang tidak teliti (misalnya memasukkan jari ke dalam tabung/wadah).
Oleh karena itu hal-hal tersebut perlu dihindani supaya dapat memperkecil
kontaminasi.
Pencegahan emulsi
Emulsi terjadi umumnya oleh karena perlakuan pengadukan. Untuk mencegah
terjadinya emulsi dapat dilakukan dengan sentnifugasi pada 600-700 x g, kemudian
dipisahkan emulsi yang terpisah.
Menghilanghkan komponen nonlipida
Pada waktu ekstraksi lemak, berbagai komponen nonlipida mungkin dapat
terikut serta. Untuk menghilanglcan komponen nonlipida, sampel lemak dapat dicuci
dengan sedikit air atau lebih baik jika digunakan larutan garam ringan. Pencucian
dilakukan dengan menggunakan corong pemisah. Fase air dibuang sedangkan fase
lemaknya dikumpulkan dan dielusikan ke dalam kolom selulosa. Ukuran kolom adalah
 2,5 cm x (20-30) cm. Sebelumnya kolom dicuci dengan metanol-air (1:1) sebanyak 7
x volume kolom dengan kecepatan 3ml/menit, kemudian dicuci dengan kloroformmetanol (1:1) sebanyak 3 x volume kolom, dan dicuci dengan kloroform-metanol (9:1)
Universitas Gadjah Mada
sebanyak 4 x volume kolom, barn seteiah itu digunakan untuk mengelusi sampel. Eluat
yang keluar digunakan untuk analisis. Jika analisis asam lemak dilakukan dengan
kromatografi gas, maka minyak yang terdapat dalam eluat dipisahkan dengan
menguapakan pelarut organiknya. Minyak yang diperoleh kemudian diturunkan
(derivatisasi) dengan cara metilasi. Tujuan metilasi adalah menaikkan titik uap asam
lemak sehingga memudahkan untuk memisahkan asam lemak berdasarkan perbedaan
titip uapnya. Metilasi dapat dikerjakan dengan menggunakan boron trifluorida, asam
sulfat, sam kiorida, asetil klorida, yang dicampur dengan metanol. Metilasi dapat
dikerjakan pada kondisi asam ataupun basis.
5-3 PENYIAPAN SAMPEL UNTUK ANALISIS ASAM AMINO DENGAN HPLC
Asam amino yang akan dianalisis harus dalam keadaan murni dan bebas. Hal
ini dapat diperoleh melalui beberapa tahapan, yaitu menghilangkan lipida yang
terdapat dalam sampel, menghilangkan asam nukleat (jika sampel merupakan bahan
biologik), menghilangkan karbohidrat, ekstraksi protein, menghilangkan garam
(desalting), hidrolisis protein menjadi asam amino bebas, dan derivatisasi.
Menghilangkan komponen lipida
Hal ini dapat dikerjkan dengan mengekstraksi lipida dengan aseton, kemudian
diulangi dengan benzena-etanol absolut panas, dengan etanol panas, dan terakhir
dengan ether, masing-masing dilakukan dua kali dengan volume masing-masing 10 x
berat sampel. Residu pelarut organik pada sarnpel dthilangkan dengan penguapan.
Menghilangakn asam nukleat
Jika sampel merupakan bahan biologik, maka asam nukleat dapat dihilangkan
dengan hidrolisis sampel yang telah dihilangkan lemaknya dengan larutan 10% NaC1
pada suhu 85°C selama 6 jam. Residu NaCl dihilangkan dengan pencucian
menggunakan air kemudian dengan aseton panas.
Menghilangkan karbohidrat
Sampel yang telah dihilangkan lipida dan asam nukleatnya harus dihilangkan
karbohidratnya. Untuk itu dapat dilakukan dengan beberapa cara:
1. Dengan hidrolisis enzimatik menggunakan enzim amilolitik. Dalam praktek
dilakukan sebagai berikut. Sampel digiling lembut kemudian disuspensikan dalam
air hangat dan diatur pHnya pada nilai pH 4,5 dengan menggunakan larutan asam
asetat. Kemudian diencerkan dua kali dan dinetralkan (pH 7,0) dengan larutan
NaOH. Setelah diatur kondisinya pada suhu 37°C kemudian ditambahkan enzim.
Hidrolisis berlangsung selama kurang lebih semalam. Setelah selesai hidrolisis,
Universitas Gadjah Mada
protein dipisahkan dengan sentrifugasi dan diendapakan dengan aseton, benzenaetanol panas, etanol, lalu dengan eter.
2. Ekstraksi dengan larutan asam hidroklorida. Ekstraksi dilakukan dengan larutan
21% HC1. Di dalam ekstrak terdapat protein terlarut, karbohidrat (tepung)
diendapkan dengan menambahkan etanol. Larutan yang mengandung protein larut
dipisahkan.
3. Ekstraksi dengan asarn trikiorasetat. Cara ini kebalikan dengan butir (2). Dalam
ekstrak terdapat karbohidrat yang terlarut sementara protein terendapkan yang
dapat dipisahkan dengan penyaringan.
4. Ekstraksi protein dengan asam format. Ekstraksi dikerjakan dengan menambahkan
larutan 90% asam format pada sampel. Protein akan terdapat dalam asam format
dalam keadaan larut. Selanjutnya setelah dipisahkan proteinnya dapat diendapkan
dengan menambahkan etanol untuk mengendapakan residu karbohidrat yang
terikut.
Desalting
Tujuannya adalah untuk menghilangkan garam mineral yang mungkin terdapat
dalam sampel. Desalting dapat dilakukan dengan melalukan sampel ke dalam kolom
penukar ion misalnya dengan menggunakan resin (Doulite C-3, Amberlite IR- 120, dll.).
sebelum digunakan kolom dicuci dulu dengan air sampai semua ion (anion dan kation)
menjadi hilang.
Hidrolisis
Bertujuan untuk membebaskan asam-asam amino dan ikatan peptida pada
protein. Hidrolisis dapat menggunakan asam sulfat pekat, asam klorida pekat, atau
asam format. Meskipun demikian penggunaan asam klorida untuk menghidrolisis
protein menjadi asam-asam amino lebih banyak dikedakan. Dalam hal ini sampel
dicampur dengan larutan 6N HCl sebanyak 2,5-5000 x berat sampel selama 18-24 jam
dalam keadaan vakum atau di bawah kondisi gas inert (misalnya gas nitrogen) dan
suhu 100-110oC. Keiebihan asam kiorida diuapkan dengan penguapan vakum
(misalnya menggunakan rotary evaporator vakum).
Derivatisasi
Setelah memperoleh asam amino bebas, kemudian dilakukan derivatisasi untuk
memudahkan pelarutan asam amnio dan memanipulasi polaritasnya. Reagen yang
dapat digunakan untuk derivatisasi asam amino antara lain ortoftalaidehida (OPA),
ninhidrin,
fluoroscamine,
fenilisotiosianat,
dansil
kiorida,
dabsil
klorida,
diaminoazobenzenisotiosianat, dan fluorometil kloromeformat.
Universitas Gadjah Mada
5-4 LATIHAN PEMAHAMAN MATERI
1. Apakah yang dinamakan sampel? Sebutkan syarat-syarat yang harus dipenuhi
sampel!
2. Mengapa satuan rpm kurang sesuai untuk mengekspresikan gaya sentrifugal?
3. Uraikan cara menyiapkan sampel untuk analisis asam lemak dengan kromatografi
gas! Apa saja tujuan derivatisasi umumnya?
Universitas Gadjah Mada