penapisan bakteri lipolitik asal fruktosfer kelapa

advertisement
PENAPISAN BAKTERI LIPOLITIK
ASAL FRUKTOSFER KELAPA SAWIT
ALLIA LAKSMI NURDINI
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2010
ABSTRAK
ALLIA LAKSMI NURDINI. Penapisan Bakteri Lipolitik asal Fruktosfer Kelapa Sawit.
Dibimbing oleh ANTONIUS SUWANTO dan ESTI PUSPITASARI.
Lipase (EC 3.1.1.3, gliserol ester hidrolase) didefinisikan sebagai karboksilesterase yang
mengkatalisis hidrolisis rantai panjang asilgliserol. Enzim lipase dapat dihasilkan oleh bakteri
lipolitik yang tumbuh dengan baik pada substrat mengandung minyak seperti buah kelapa sawit.
Tujuan penelitian ini ialah menapis bakteri lipolitik asal fruktosfer kelapa sawit, melakukan
karakterisasi pH, dan suhu lipase dari isolat terpilih. Sebanyak tujuh isolat bakteri lipolitik dengan
morfologi koloni berbeda berhasil ditapis secara kualitatif dari fruktosfer kelapa sawit
menggunakan media penapisan Rhodamin B. Bakteri diisolasi dari eksokarp dan mesokarp buah
kelapa sawit yang matang. Aktivitas lipolitik dari tiap isolat diukur dan diseleksi berdasarkan besar
aktivitasnya. Tiga isolat memiliki aktivitas terbaik dengan hasil sebagai berikut EP2.22 (0.912
U/mg), F2 (0.792 U/mg), dan F6 (0.650 U/mg). Isolat-isolat tersebut mempunyai aktivitas yang
tinggi pada rentang pH dan suhu yang bervariasi. Isolat EP2.22 memiliki pH optimum 7.5 dan
memiliki suhu optimum 40 oC atau 70 oC. Isolat F2 memiliki pH optimum 8.5 dan memiliki suhu
optimum 70 oC. Isolat F6 memiliki pH optimum 8.5 dan memiliki suhu optimum 30 oC atau 70 oC.
Dua puncak aktivitas yang tinggi disebabkan enzim yang dipakai merupakan enzim ekstrak kasar.
Analisis gen 16S rRNA mengidentifikasikan EP2.22, F2, dan F6 berkolerasi dekat dengan
Staphylococcus klosii, Enterobacter sp., dan Buttiauxella izardii.
ABSTRACT
ALLIA LAKSMI NURDINI. Screening of Lipolytic Bacteria from Oil Palm Fructosphere.
Supervised by ANTONIUS SUWANTO and ESTI PUSPITASARI.
Lipase (EC 3.1.1.3, glycerol ester hidrolase) is defined as carboxylesterase that catalyzes
the hydrolysis of long chain asilgliserol. Lipase produced by lipolytic bacteria that grow well in
substrates containing oils such as oil palm fruit. The purpose of this study was to screen lipolytic
bacteria from oil palm fructosphere and to characterize optimal pH and temperature of lipase
enzyme from selected isolates. Seven isolates of lipolytic bacteria with different morphology were
qualitatively screened from oil palm fructosphere using Rhodamin B media. Bacteria were isolated
from the exocarp and mesocarp of ripe oil palm fruits. Lipolytic activity each isolates were
measured and selected based on their activity. Three isolates possessed the best activity with result
as follows EP2.22 (0.912 U/mg), F2 (0.792 U/mg), and F6 (0.650 U/mg). These isolates showed
high activity at various range of pH and temperature. Isolate EP2.22 showed optimum pH at 7.5
and optimum temperature at either 40 oC or 70 oC. Isolate F2 showed optimum pH 8.5 and
optimum temperature 70 oC. Isolate F6 showed optimum pH 8.5 and optimum temperature at 30
o
C and 70 oC. Two peaks of high activity due to the use of crude enzyme extract. 16S rRNA gene
sequencing indicated that isolates EP2.22, F2, and F6 closely related to Staphylococcus klosii
Enterobacter sp., and Buttiauxella izardii.
PENAPISAN BAKTERI LIPOLITIK
ASAL FRUKTOSFER KELAPA SAWIT
ALLIA LAKSMI NURDINI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2010
Judul : Penapisan Bakteri Lipolitik asal Fruktosfer Kelapa Sawit
Nama : Allia Laksmi Nurdini
NIM : G34061578
Disetujui,
Pembimbing I
Pembimbing II
Prof. Dr. Ir. Antonius Suwanto, M.Sc.
NIP. 19581130 198503 1 003
Esti Puspitasari, M.Si.
NIK.6209009839
Diketahui,
Ketua Departemen Biologi
Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena, M.Si.
NIP. 19641002 198903 1 002
Tanggal Lulus :
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan ke kehadirat Allah SWT atas segala rahmat dan karuniaNya, sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah yang berjudul “Penapisan Bakteri
Lipolitik asal Kelapa Sawit”. Penelitian ini dilakukan mulai Februari 2010 sampai dengan Juni
2010”, di laboratorium Bioteknologi, PT Wilmar Benih Indonesia, Cikarang.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada berbagai pihak yang telah membantu selama
berlangsungnya penelitian ini. Ucapan terima kasih disampaikan kepada Bapak Prof. Dr. Ir.
Antonius Suwanto, M.Sc. selaku dosen pembimbing kesatu dan Ibu Esti Puspitasari, M.Si. selaku
pembimbing kedua, dan Griselda Herman Natadiputri, S.Si selaku pembimbing lapang atas segala
bimbingan, saran, dan masukan selama berlangsungnya kegiatan penelitian dan penyusunan karya
ilmiah ini. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Ibu Dra. Sri Listiyowati, M.Si.
selaku dosen penguji wakil komisi pendidikan yang memberikan masukan penulisan karya ilmiah.
Tak lupa juga penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Kak Budi, Kak Syamsul, Kak
Jesi, dan Pak Jo atas bantuan dan diskusinya, rekan-rekan penelitian (Rio, Dimas, dan Aida), serta
semua staf laboratorium Bioteknologi PT Wilmar Benih Indonesia, Cikarang. Terima kasih kepada
keluarga besar saya yang telah memberikan dukungannya baik moril maupun materil. Selain itu,
tak lupa pula penulis ucapkan terima kasih kepada keluarga besar OWA, teman-teman Biologi 43
(Risa, Dara, Nunuz, dan Mala), teman-teman Biologi 42, dan keluarga pondok kos ACC (Risti,
Abe, Amal, dan Gendis) yang telah memberikan dukungan, semangat, dan kebersamaannya.
Semoga skripsi ini bermanfaat bagi semua pembacanya.
Bogor, November 2010
Allia Laksmi Nurdini
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 6 Juni 1988 sebagai anak pertama dari dua
bersaudara dari pasangan Bapak Bambang Mulyanto dan Ibu Herlina. Penulis lulus SD pada tahun
2000, dan SLTP pada tahun 2003. Pada tahun 2006 penulis lulus dari SMAN 81 Jakarta dan pada
tahun yang sama diterima di Institut Pertanian Bogor (IPB) melalui jalur Seleksi Penerimaan
Mahasiswa Baru (SPMB).
Penulis melakukan Studi Lapang pada tahun 2008 mengenai Eksplorasi Rhizobakteria asal
Perakaran Legum dari Kawasan Taman Wisata Alam Situ Gunung-Sukabumi. Penulis melakukan
Praktik Lapang pada tahun 2009 mengenai Konservasi Ex-Situ Beruk (Macaca nemestrina) di
International Animal Rescue (IAR) Indonesia, Ciapus-Bogor.
Penulis pernah mendapat beasiswa Peningkatan Prestasi Akademik (PPA) yang diberikan
oleh Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi pada tahun ajaran 2008/2009 dan menjadi kandidat
penerima program beasiswa Indonesia English Language Program (IESLP) yang diadakan oleh
The Indonesian International Education Foundation (IIEF) pada tahun 2009.
Selama masa perkuliahan penulis aktif menjadi asisten praktikum mata kuliah
Perekembangan Hewan tahun pada tahun ajaran 2008/2009, Biologi Dasar pada tahun ajaran
2010/2011, Struktur Tumbuhan Berpembuluh pada tahun ajaran 2010/2011, dan Mikrobiologi
Dasar pada tahun ajaran 2010/2011. Penulis juga menjadi pengajar Biologi Dasar pada bimbingan
belajar B’Expert pada tahun 2008. Di bidang kemahasiswaan, penulis aktif sebagai anggota
Observasi Wahana Alam (OWA) Himabio periode 2007/2008 sebagai sekretaris, dan periode
2008/2009 sebagai anggota.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR GAMBAR .....................................................................................................................viii
DAFTAR LAMPIRAN ..................................................................................................................viii
PENDAHULUAN............................................................................................................................. 1
Latar Belakang ............................................................................................................................. 1
Waktu dan Tempat ....................................................................................................................... 2
BAHAN DAN METODE ................................................................................................................. 2
Bahan............................................................................................................................................ 2
Isolasi dan Penapisan bakteri lipolitik .......................................................................................... 2
Preparasi Enzim Ekstrak Kasar .................................................................................................... 2
Spesifikasi Enzim ......................................................................................................................... 2
Identifikasi Strain ......................................................................................................................... 3
HASIL ............................................................................................................................................... 3
Isolasi dan Penapisan Bakteri Lipolitik ........................................................................................ 3
Uji Aktivitas Enzim ...................................................................................................................... 4
Karakterisasi pH dan Suhu Optimum Enzim................................................................................ 5
Identifikasi Strain ......................................................................................................................... 5
SIMPULAN ...................................................................................................................................... 8
DAFTAR PUSTAKA ....................................................................................................................... 8
LAMPIRAN .................................................................................................................................... 10
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Reaksi enzimatik lipase dalam mengkatalisis hidrolisis dan sintesis substrat triasilgliserol...... 1
2 Struktur buah kelapa sawit........................................................................................................
2
3 Aktivitas lipase isolat bakteri lipolitik asal fruktosfer kelapa sawit
aadan S. epidermidis....................................................................................................................
4
4 Aktivitas spesifik lipase isolat bakteri lipolitik asal fruktosfer kelapa sawit
Aadan S.epidermidis....................................................................................................................
4
5 Pengaruh pH terhadap aktivitas lipase isolat EP2.22, F2, F6, dan S9......................................
5
6 Pengaruh suhu terhadap aktivitas lipase isolat EP2.22, F2, F6, dan S9...................................
5
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Hasil penapisan bakteri lipolitik pada fruktosfer kelapa sawit...............................................
11
2 Karakterisasi morfologi isolat dan pewarnaan Gram bakteri lipolitik asal fruktosfer kelapa
Asawit......................................................................................................................................
11
3 Bagan alir pembuatan reagen cupric-acetate pyridine..........................................................
11
4 Kurva standar asam palmitat..................................................................................................
12
5 Data standar asam palmitat.....................................................................................................
12
6 Kurva standar kadar protein....................................................................................................
13
7 Data standar kadar protein.....................................................................................................
13
8 Pengukuran aktivitas enzim, kadar protein, dan aktivitas spesifik enzim lipase ekstrak.......
aakasar bakteri lipolik asal frukosfer kelapa sawit dan S. epidermidis.....................................
14
9 Pengukuran suhu optimum enzim..........................................................................................
14
10 Pengukuran pH optimum enzim...........................................................................................
15
11 Protokol Qiaquick® PCR purification kit dengan menggunakan microcentrifuge..............
16
12 Protokol Big Dye® X-Terminator Purification Kit.............................................................
16
1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Enzim telah digunakan secara luas dan
terus berkembang dalam bidang industri. Hal
ini berkaitan dengan keuntungan dari
pengaplikasian enzim, antara lain: ongkos
produksi menjadi lebih rendah dalam jangka
panjang; bereaksi secara spesifik; dapat
bekerja dalam kondisi dengan tekanan dan
suhu yang lebih rendah dibandingkan dengan
cara fisik dan kimiawi;; dan ramah lingkungan.
Salah satu enzim yang mempunyai peranan
penting dalam industri ialah lipase.
Lipase (EC 3.1.1.3, gliserol ester hidro
hidrolase) didefinisikan sebagai
gai karboksilesterase
yang mengkatalisis
talisis hidrolisis rantai panjang
asilgliserol dengan trioleogliserol sebagai
substrat standar (Jaeger & Eggert 2002).
Lipase mengkatalisis
atalisis hidrolisis ikatan ester
pada antarmuka antara fase yang tidak larut
dalam air (substrat) dan fase akua pada enzim
tersebut larut.. Hidrolisis ini menghasilkan
digliserida, monogliserida, gliserol, dan asam
lemak. Pada kondisi keterbatasan air, lipase
dapat mengkatalisis reaksi balik yang disebut
esterifikasi. Reaksi ini mensintesis gliserida
dari asam lemak dan gliserol (Saxena et al.
1999). Skema reaksi
si tersebut dapat dilihat
pada Gambar 1.
Gambar 1 Reaksi enzimatik lipase dalam
mengkatalisis hidrolisis dan sintesis substrat
triasilgliserol (Jaeger et al
al. 1994).
Penggunaan enzim lipase
ipase dapat diterapkan
dalam industri kelapa sawit
sawit. Indonesia
merupakan salah satu negara penghasil
minyak kelapa sawit terbesar di dunia dan
bersama-sama
sama Malaysia menguasai 85%
minyak kelapa sawit di dunia (FAO 2010).
Oleh karena itu, pengolahan lebih lanjut
minyak kelapa sawit dapat meningkatkan nilai
jual produk dan potensinya sebagai sumber
devisa.
Oleokimia merupakan produk ol
olahan
kelapa sawit yang non edible. Produk ini
digunakan sebagai bahan pada berbagai
industri seperti sabun, detergen, makanan,
kosmetik, farmasi, plastik, dan kertas
(Rupilius & Ahmad 2006
2006). Produk oleokimia
dasar terdiri atas asam lemak, asam alkohol,
metil ester, dan gliserida yang merupakan
hasil dari pemecahan trigliserida. Pemakaian
lipase untuk memecah trigliserida dalam
industri oleokimia dapat menghemat energi
dan mencegah denaturasi akibat panas tinggi
selama proses hidrolisis, alkoholisis, dan
gliserolisis (Hasan et al.. 2006).
2006)
Selain untuk pengolahan produk non
edible kelapa sawit, lipase juga dapat
dapa
digunakan dalam pengolahan produk edible
atau pangan. Untuk menghindari resiko
penyakit yang disebabkan oleh produk pangan
yang mengandung asam lemak trans akibat
proses hidrogenasi maka industri minyak dan
lemak mulai menerapkan proses interinter
esterifikasii dengan menggunakan enzim
lipase. Produk tersebut berupa margarin,
shortening, pastry,, dan minyak untuk
menggoreng (Pandiangan 2008).
2008) Reaksi
esterifikasi lipase juga dapat mengkonversi
triasilgliserol kelapa sawit menjadi biodiesel.
Dalam bidang lingkungan,
lingkungan reaksi hidrolisis
lipase dapat mendegradasi limbah yang
mengandung lipid, minyak, dan hidrokarbon
(Hasan et al. 2006).
Lipase banyak tersedia di alam, enzim ini
dapat diproduksi oleh tumbuhan, hewan, dan
mikrob. Mikrob penghasil
asil lipase antara lain
bakteri Gram positif maupun Gram negatif,
negatif
aktinomiset, khamir, dan kapang (Sharma et
al. 2001). Produksi enzim yang berasal dari
mikroorganisme
me memiliki beberapa kelebihan
antara lain waktu generasi yang pendek dan
kebutuhan
butuhan nutrisi yang sederhana (Hasan et
al. 2006).
Tumbuhan menyediakan lingkungan yang
mendukung pertumbuhan mikrob
mikro terutama di
tempat yang lembap dan kaya
kay nutrisi seperti
buah. Daerah buah dan mikrob berinteraksi
disebut juga sebagai fruktosfer. Buah
merupakan perkembangan lebih lanjut dari
ovari bunga dan merupakan struktur penting
pada siklus hidup seksual tumbuhan
angiospermae.
Buah
melindungi
biji,
membantu dalam penyerbukan, dan dapat
menjadi faktor biji untuk berkecambah (Rost
et al. 2006).
Buah kelapa sawit (Elaeis
(
guineensis
Jacq.)) merupakan buah drupe, berwarna
merah atau jingga kemerahan ketika
ke
matang.
Dinding buahnya terdiri atas tiga bagian yaitu
kulit luar (exocarpium
exocarpium), kulit tengah
(mesocarpium), dan kulit dalam (endocarp(
ium). Buah ini memiliki eksokarp tipis dengan
mesokarp mengelilingi kernel atau biji, dan
memiliki parenkima yang mengandung tubuh
minyak (Bewley et al.. 2006, Tjitrosoepomo
2
1985). Minyak kelapa sawit dapat diekstrasi
dari mesokarp (crude palm oil) dan kernel
yang berada dalam endokarp (palm kernel
oil).
Gambar 2 Struktur buah kelapa sawit
(Poku 2002).
Bakteri lipolitik dapat ditemukan di
banyak tempat yang mengandung minyak.
Lingkungan yang mengandung minyak merupakan substrat yang baik terhadap bakteri
lipolitik untuk tumbuh (Rahman et al. 2007).
Hal ini membuat bakteri ini memiliki potensi
untuk mengolonisasi buah kelapa sawit.
Tujuan
Tujuan penelitian ini ialah menapis bakteri
lipolitik asal fruktosfer kelapa sawit dan
melakukan karakterisasi pH dan suhu lipase
dari isolat terpilih.
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan di laboratorium
Bioteknologi, PT Wilmar Benih Indonesia,
Cikarang. Penelitian ini berlangsung mulai
bulan Februari hingga Juni 2010.
BAHAN DAN METODE
Bahan
Bahan yang digunakan ialah buah kelapa
sawit berasal dari pohon berumur 5 tahun
yang berasal dari PT. Tania Selatan,
Palembang.
Isolasi dan Penapisan bakteri lipolitik
Bakteri fruktosfer diisolasi dari tiga bagian
buah yaitu: eksokarp; pengelupasan bagian
eksokarp dan mesokarp; dan mesokarp sisa
pengelupasan.
Sebanyak lima buah kelapa sawit yang
matang dicuci menggunakan air steril
sebanyak lima kali volume buah selama satu
menit. Kemudian bagian eksokarp diusap
dengan cotton bud steril yang telah dibasahi
larutan NaCl 0.85% sebanyak 100 µl. Cotton
bud tersebut dimasukkan ke dalam 5 ml
larutan NaCl 0.85% dan dihomogenisasi
menggunakan vortex.
Setelah diusap, eksokarp dan sedikit
mesokarpnya dikelupas, ditambah larutan
NaCl 0.85% dengan perbandingan 100:1, dan
dihancurkan dengan menggunakan mortar.
Ekstrak dari pengelupasan kemudian dimasukkan ke dalam tabung steril.
Mesokarp sisa pengelupasan ditambah
dengan larutan NaCl 0.85% dengan
perbandingan 100:1 dan dihancurkan menggunakan blender. Kemudian daging yang telah
dihancurkan tersebut diambil ekstraknya dan
dipisahkan ke dalam tabung steril.
Ekstrak buah dari tiap sampel disebar
sebanyak 10 µl, 50 µl, dan 100 µl pada media
agar Rhodamin B (Kouker & Jaeger 1987)
yang mengandung minyak zaitun Filippo
Berio® (Italia). Media diinkubasi selama 48
jam pada suhu 30 oC. Aktivitas lipolitik pada
media penapisan dapat dideteksi di bawah
sinar UV (λ =350 nm) sebagai zona berpendar
berwarna jingga di sekitar koloni. Koloni
bakteri lipolitik yang secara morfologi
berbeda dikoleksi dan digores pada media
yang sama serta dilakukan pewarnaan Gram
mengikuti Hadioetomo (1993).
Preparasi Enzim Ekstrak Kasar
Preparasi enzim ekstrak kasar menggunakan metode Handayani dan Sulistyo
(2005) dengan modifikasi. Sebanyak satu
koloni dari tiap isolat masing-masing
diperkaya pada 4 ml media kaldu Luria
Bertani, diagitasi selama 24 jam pada suhu 30
o
C dengan kecepatan 150 rpm. Kemudian
biakan dituang ke media produksi dan
diinkubasi selama 72 jam pada suhu 30 oC
dengan kecepatan 175 rpm menggunakan
inkubator bergoyang. Media produksi
merupakan media yang sama dengan media
penapisan ditambah minyak zaitun (25:1),
namun tanpa menggunakan Rhodamin B,
agar-agar, dan pengemulsi. Media produksi
yang dipakai untuk tiap isolat ialah sebanyak
50 ml. Biakan disentrifugasi dengan
kecepatan 12500 g pada suhu 4 oC selama 12
menit. Supernatan hasil sentrifugasi dari
biakan pada media produksi mengandung
enzim lipase ekstrak kasar. Sebanyak 1 mM
phenyl methyl sulfonyl fluoride ditambahkan
ke dalam supernatan sebagai penghambat
protease. Supernatan disimpan pada suhu 4 oC
dan akan dipakai untuk tahap selanjutnya.
Spesifikasi Enzim
Pengukuran aktivitas lipase dilakukan
dengan metode Kwon dan Rhee (1986)
dengan modifikasi pada suhu inkubasi.
Sebanyak 1.25 ml minyak zaitun, 1.25 ml
3
bufer fosfat pH 7, dan 20 µL CaCl2 0.02 M
dihomogenisasi
menggunakan
vortex.
Kemudian sebanyak 1 ml enzim lipase ekstrak
kasar dimasukkan ke campuran tersebut dan
diinkubasi dengan menggunakan inkubator
bergoyang pada suhu 40 oC dengan kecepatan
200 rpm selama 30 menit. Reaksi enzim
dihentikan dengan menambahkan 1 ml HCl 6
N. Campuran ditambah 5 ml isooktana
sebagai pelarut organik. Kemudian campuran
dihomogenisasi selama 30 detik menggunakan
vortex. Sebanyak 4 ml lapisan atas isooktana
dipindahkan ke tabung baru dan ditambah
reagen cupric acetate-pyridine dan dihomogenisasi selama 30 detik menggunakan vortex.
Sebanyak 1.5 ml lapisan atas dipindahkan ke
tabung baru dan disentrifus dengan kecepatan
10000 g selama 20 detik. Supernatan diukur
absorbansinya menggunakan spektrofotometer
pada
panjang
gelombang
715
nm,
menggunakan SmartSpec Plus Spectrophotometer (BioRad, Amerika Serikat). Nilai
absorbansi kemudian dikonversi ke dalam
satuan unit/ml menggunakan kurva standar
asam palmitat. Satu unit lipase didefinisikan
sebagai jumlah enzim yang membebaskan 1
µmol asam lemak per ml tiap menit pada
kondisi uji aktivitas yang dideskripsikan.
Kadar protein diukur dengan metode
Bradford (1976) menggunakan bovine serume
albumine sebagai kurva standar. Aktivitas
spesifik lipase dihitung dengan membagi
aktivitas lipase dengan kadar protein. Lipase
ekstrak kasar yang memiliki aktivitas yang
paling baik dipilih untuk karakterisasi enzim
dan identifikasi strain. Pada uji ini, lipase
ekstrak kasar Staphylococcus epidermidis
digunakan sebagai referensi. Bakteri
S.
epidermidis yang digunakan merupakan kultur
koleksi laboratorium Bioteknologi PT.
Wilmar Benih Indonesia, Cikarang.
Penentuan pH optimum dari aktivitas
lipase diuji pada kisaran pH yang berbeda
dari pH 5.0 sampai 9.0 dengan skala kenaikan
sebesar 0.5. Bufer yang digunakan ialah: 0.1
M bufer asetat (pH 5.0-6.0), 0.1 M bufer
fosfat (pH 7.0-8.0), dan 0.1 M bufer tris HCl
(pH 8.0-9.0). Aktivitas lipase diuji pada
kisaran suhu yang berbeda untuk menentukan
suhu optimum dari suhu 30 hingga 80 oC
dengan skala kenaikan sebesar 10 oC pada pH
optimum.
Identifikasi Strain
Identifikasi molekular strain bakteri
menggunakan metode sekuensing DNA
koloni tunggal pada gen 16S rRNA
(Frothingham et al. 1991). Templat DNA
berasal dari koloni tunggal yang diambil
dengan tusuk gigi steril dan dimasukan ke
dalam 100 µl dd H2O. Gen 16S rRNA
diamplifikasi menggunakan primer 63f (5’CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC - 3’)
dan 1387r (5’ - GGG CGG WGT GTA CAA
GGC - 3’) (Marchesi et al. 1998). Siklus PCR
menggunakan C1000TM Thermal Cycle (Bio
Rad) dengan kondisi: pre-denaturasi 94 oC, 7
menit; denaturasi 94 oC, 30 detik; annealing
56 oC, 30 detik; elongasi 1 menit 30 detik, 72
o
C; dan pasca elongasi 7 menit. Denaturasi,
annealing, dan elongasi berlangsung selama
30 siklus sedangkan pre-denaturasi dan pasca
elongasi berlangsung selama satu kali. Reaksi
PCR dilakukan dengan komposisi sebagai
berikut: 10 µl GoTaq Green Mastermix
(Promega, USA), 7 µl nuclease-free water, 1
µl primer 63f (10 pmol/ µl), 1 µl primer 1387r
(10 pmol/µl) dan 1 µl template. Hasil PCR
dipurifikasi
dengan
Qiaquick®
PCR
purification kit (Qiagen, Valencia, California).
Cycle sequencing menggunakan BigDye®
Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied
Biosystem, Foster city, California)
dan
diamplifikasi dengan Bio Rad C1000TM
Thermal Cycle dengan kondisi sebagai
berikut: pre-denaturasi 94 oC, 3 menit;
denaturasi 94 oC, 30 detik; annealing 56 oC ,
30 detik; elongasi 60 oC, 1 menit 15 detik; dan
pasca elongasi 60 oC, 5 detik. Denaturasi,
annealing dan elongasi berlangsung selama 25
siklus sedangkan pre-denaturasi dan pasca
elongasi berlangsung selama satu kali. Hasil
dari cycle sequensing dipurifikasi menggunakan Big Dye® X-Terminator Purification
Kit (Applied Biosystem, Foster city,
California) dan disekuensing dengan ABI
PRISMTM 3130 Genetic Analyzer (Applied
Biosystem, Foster City, California). Hasil dari
sekuensing dianalisis dengan BLAST-N
(Basic Local Alignment Search
Tool Nucleotida) dari situs NCBI (National Center
for Biotechnology Information) (http://www.
ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).
HASIL
Isolasi dan Penapisan Bakteri Lipolitik
Dari penelitian ini telah berhasil diisolasi
tujuh koloni bakteri lipolitik yang berbeda
morfologinya dari fruktosfer kelapa sawit.
Bakteri tersebut adalah EP2.22 dan FFB1
yang diisolasi dari eksokarp buah kelapa
sawit; serta EPN2, F1, F2, F4, dan F6 yang
diisolasi dari eksokarp dan mesokarp buah
kelapa sawit (Lampiran 1). Berdasarkan hasil
pewarnaan Gram, lima isolat (EP2.22, FFB1,
4
EPN2, F1, dan F4) merupakan Gram positif.
Sedangkan dua isolat lainnya merupakan
Gram negatif. Berdasarkan pengamatan
mikroskopis sel bakteri, lima isolat (FFB1,
EPN2, F2, F4, dan F6) memiliki bentuk
batang dan dua isolat berbentuk kokus.
Penampakan morfologi dari tiap koloni menunjukkan bentuk bundar dengan keragaman
pada warna, diameter, elevasi, dan tepian
(Lampiran 2).
isolat F2 (0.044 U/ml). Sedangkan lipase
isolat F1 (0.023 U/ml), F4 (0.017 U/ml),
FFB1 (0.011 U/ml), dan EPN2 (0.013 U/ml)
memiliki aktivitas yang rendah (Gambar 3).
Aktivitas spesifik S. epidermidis (0.452 U/mg)
lebih rendah dibandingkan dengan bakteri
fruktosfer dengan nilai aktivitas spesifik
tertinggi yaitu berturut-turut: isolat EP2.22
(0.912 U/mg), F2 (0.792 U/mg), dan F6
(0.659 U/mg). Lipase isolat lainnya yaitu F1
(0.374 U/mg) memiliki aktivitas spesifik yang
sedang, sedangkan lipase isolat F4 (0.054
U/mg), FFB1 (0.126 U/mg), dan EPN2 (0.063
U/mg) memiliki aktivitas spesifik yang rendah
(Gambar 4). Berdasarkan hasil nilai aktivitas
dan aktivitas spesifik, isolat EP2.22, F2, dan
F6 dipilih untuk tahap selanjutnya.
Aktivitas lipase (U/ml)
Uji Aktivitas Enzim
Bakteri referensi, S. epidermidis yang
ditandai oleh kode S9 mempunyai aktivitas
lipase terbesar (0.117 U/ml). Aktivitas lipase
terbesar dari isolat bakteri fruktosfer dimiliki
oleh EP2.22 (0.084 U/ml) dan F6 (0.100
U/ml). Aktivitas lipase sedang dimiliki oleh
0.140
0.117
0.120
0.100
0.100
0.084
0.080
0.060
0.044
0.040 0.023
0.017
0.011 0.013
0.020
0.000
Isolat
Gambar 3 Aktivitas lipase isolat bakteri lipolitik asal fruktosfer kelapa sawit dan S. epidermidis.
Aktivitas spesifik lipase
(U/mg)
1.000
0.912
0.792
0.800
0.659
0.600
0.400
0.200
0.452
0.374
0.054
0.126
0.063
0.000
Isolat
Gambar 4 Aktivitas spesifik lipase isolat bakteri lipolitik asal fruktosfer kelapa sawit
dan S. epidermidis.
5
Identifikasi Strain
Berdasarkan analisis gen 16S rRNA,
isolat
EP2.22
diidentifikasi
sebagai
Staphylococcus kloosii dengan kemiripan
sebesar 97% terhadap Staphylococcus
kloosii strain FR2_36con (No. akses
EU934080.1); isolat F2 diidentifikasi
sebagai Enterobacter sp. dengan kemiripan
sebesar 97% terhadap Enterobacter sp.
FMB-1 (No. akses DQ855282.1); dan isolat
F6 diidentifikasi sebagai Buttiauxella izardii
dengan kemiripan sebesar 98% terhadap
Buttiauxella izardii strain S3/2-161 (No.
akses NR_025331.1).
Karakterisasi pH dan Suhu Optimum
Enzim
Lipase isolat EP2.22, F2, F6, dan S9
memiliki aktivitas optimum berturut-turut
yaitu pada pH 7.5, 8.5, 8.5, dan 7 (Gambar
5). Suhu optimum lipase isolat F2 dan S9
berturut-turut ialah 70 oC dan 50 oC.
Pengukuran lipase isolat Ep2.22 memperlihatkan dua puncak aktivitas pada suhu 40
o
C (100%) dan 70 oC (85%). Lipase isolat F6
juga memperlihatkan dua puncak aktivitas
yaitu pada suhu 70 oC (100%) dan 30 oC
(90%) (Gambar 6). Puncak aktivitas ditandai
dengan lebih tingginya aktivitas relatif
dibandingkan aktivitas relatif disampingnya
pada diagram batang.
Aktivitas relatif (%)
120
100
80
EP2.22
60
F2
40
F6
20
S9
0
5 5.5 6 6.5 7 7.5 8 8.5 9
pH
Aktivitas relatif (%)
Gambar 5 Pengaruh pH terhadap aktivitas lipase isolat EP2.22, F2, F6, dan S9.
110
100
90
80
70
60
50
40
30
20
EP2.22
F2
F6
S9
30
40
50
60
70
80
Suhu (oC)
Gambar 6 Pengaruh suhu terhadap aktivitas lipase isolat EP2.22, F2, F6, dan S9.
6
PEMBAHASAN
Tujuh isolat bakteri lipolitik yang berbeda
morfologinya telah berhasil ditapis dari
fruktosfer kelapa sawit yang matang. Isolat
ditapis menggunakan media Rhodamin B
dengan
minyak zaitun sebagai sumber
minyak. Hidrolisis minyak zaitun oleh bakteri
lipolitik pada media penapisan menghasilkan
asam lemak bebas, monogliserida, dan
digliserida yang akan berikatan dengan
pewarna Rhodamin B. Hasil pengikatan ini
akan menghasilkan zona berpendar berwarna
jingga di sekitar koloni yang dapat dilihat
setelah media diradiasi dengan sinar UV.
Terdapat korelasi positif antara pendaran
jingga dan aktivitas lipolitiknya (Kouker &
Jaeger 1987; Hou & Johnston 1992). Oleh
karena itu, ketujuh isolat bakteri lipolitik
tersebut dipilih berdasarkan kuatnya pendaran
pada koloni.
Buah kelapa sawit yang digunakan pada
penelitian ini merupakan buah yang matang.
Menurut Poku (2002) buah kelapa sawit yang
matang memiliki kadar minyak yang tinggi
dan mesokarp yang lunak. Hal ini
mengakibatkan buah akan mudah terserang
enzim lipolitik. Enzim lipolitik yang
menyerang kelapa sawit berasal dari lipase
endogenous mesokarp dan lipase eksogenous
mikroorganisme (Ebongue et al. 2006).
Mikroorganisme yang telah dilaporkan meng
hasilkan lipase eksogenous pada buah kelapa
sawit antara lain cendawan Rhizopus oryzae,
Mucor hiemalis f. hiemalis, dan Mucor sp.
(Hiol et al. 1999; Hiol et al. 2000; Abbas et
al. 2002).
Hasil dari pengelupasan eksokarp dan
mesokarp di sekitar permukaan kelapa sawit
merupakan penghasil bakteri lipolitik dengan
ragam terbanyak dibandingkan permukaan
buah. Pada mesokarp kelapa sawit bagian
dalam, tidak ada bakteri lipolitik yang
diisolasi. Hal ini disebabkan karena kolonikoloni bakteri yang berasal dari mesokarp
kelapa sawit tersebut tidak menghasilkan
pendaran oranye dan juga pendaran yang kuat
pada media penapisan dan diindikasikan tidak
memiliki aktivitas lipolitik yang besar. Uji
biokimia pada isolat yang menghasilkan
pendaran kurang kuat dan juga tidak menunjukkan keberadaan aktivitas lipase.
Sehingga dapat dikatakan pada mesokarp
bagian dalam tidak terdapat aktivitas lipolitik
pada bakteri fruktosfer.
Sebelumnya Djafar et al. (2010) berhasil
mengisolasi bakteri penghasil lipase dari
daging buah kelapa sawit. Bakteri yang
berhasil diisolasi dan diidentifikasi ialah
Bacillus brevis dan B. laterosporus. Hasil
identifikasi bakteri pada penelitian ini berbeda
dengan penelitian Djafar et al. (2010). Hal ini
bisa disebabkan karena jenis, tingkat
kematangan, dan penanganan contoh buah
yang berbeda. Perbedaan waktu pengambilan
buah juga dapat berpengaruh terhadap
keragaman bakteri.
Pengambilan sampel
dilakukan pada bulan Februari (musim hujan).
Curah hujan akan mempengaruhi kelimpahan
serangga yang menjadi pembawa bakteri antar
tanaman, dan kandungan air pada buah juga
dapat menjadi faktor kelimpahan bakteri. Jadi
bakteri lipolitik yang terisolasi pada musim
hujan kemungkinan berbeda dengan bakteri
yang terisolasi pada musim kemarau.
Selain itu, metode yang digunakan untuk
identifikasi bakteri pada penelitian sebelumnya ialah dengan mengarakterisasi ciri-ciri
morfologi dan fisiologisnya, sedangkan
metode yang digunakan pada penelitian ini
ialah dengan menganalisis sekuen gen 16S
rRNA. Menurut McInerney et al. (2001)
penggunaan identifikasi molekular memberikan hasil yang lebih jelas untuk studi
klasifikasi prokariot.
Keberadaan mikroorganisme lipolitik telah
dilaporkan menaikkan kadar asam lemak
bebas pada buah kelapa sawit (Abbas et al.
2002). Buah kelapa sawit mempunyai potensi
sebagai habitat bakteri lipolitik. Hal ini diduga
karena minyak yang terkandung pada buah
tersebut dapat menginduksi lipase ekstraselular pada bakteri lipolitik. Menurut Sharma
et al. (2001) minyak merupakan penginduksi
yang baik untuk enzim lipase. Lipase
ekstraselular yang dilepas dari sel bakteri
lipolitik ke lingkungan dapat menghidrolisis
molekul triasilgliserol menjadi asam lemak
dan gliserol yang berguna untuk nutrisi
bakteri. Asam lemak dapat dimetabolime oleh
bakteri melalui siklus beta oksidasi menjadi
asetil Koenzim A, kemudian masuk ke siklus
tricarboxylic acid (TCA). Gliserol dapat
dimetabolisme menjadi dihidroksi aseton
fosfat yang kemudian masuk ke tahap
glikolisis (Pelczar & Chan 1986).
Sisi aktif enzim lipase diselubungi oleh
polipeptida heliks yang akan membuka jika
lipase berinteraksi dengan lipid. Hal ini
disebut juga interfacial activation. Selama
reaksi,
terjadi
pembentukan
senyawa
tetrahedral intermediate asil-enzim. Reaksi
hidrolisis ikatan ester dimediasi oleh air.
Molekul air akan berperan sebagai nukleofil
yang menyerang senyawa asil-enzim.
Sedangkan pada kondisi air yang terbatas,
7
gugs asil akan ditransfer ke nukleofil lain
seperti gliserol atau ester sehingga terjadi
pertukaran gugus asil (Jaeger et al. 1994;
Hariyadi 1995 di dalam Adiandri 2001).
Penapisan pada media Rhodamin B hanya
menunjukkan aktivitas lipase secara kualitatif.
Untuk mengetahui aktivitasnya secara
kuantitatif, maka dilakukan uji aktivitas lipase
secara biokimia. Aktivitas lipase diukur
berdasarkan metode kolorimetri (Kwon &
Rhee 1986). Asam lemak bebas hasil
hidrolisis lipase selama masa inkubasi akan
bereaksi dengan reagen cupric-acetate
pyridine membentuk sabun tembaga yang
akan diukur nilai absorbansinya. Nilai ini akan
disetarakan dengan kurva standar asam
palmitat. Penggunaan asam palmitat disebabkan komposisi asam lemak paling terbanyak
pada minyak sawit ialah palmitat diikuti oleat
(Pahan 2008).
Penambahan phenyl methyl sulfonyl
fluoride (PMSF) pada enzim ekstraselular
bertujuan menghambat protease yang akan
merusak enzim. Pereira-Meirelles et al. (1997)
melaporkan aktivitas maksimum lipase dapat
dicapai dengan menambahkan PMSF pada
media kuktur. PMSF merupakan inhibitor
protease serin dan lipase pada umumnya.
Penghambatan lipase oleh PMSF berkaitan
dengan sisi katalitik lipase yang sama dengan
sisi katalitik protease serin, yaitu serin,
histidin, dan asam aspartat (Jaeger et al.
1994). Namun, penambahan PMSF pada
lipase ekstraselular bakteri fruktosfer kelapa
sawit mengakibatkan kenaikan aktivitas enzim
lipase (data tidak ditampilkan). Hal ini
mungkin bisa diakibatkan residu serin tidak
berperan penting pada sisi aktif lipase isolat
bakteri fruktosfer kelapa sawit.
Uji aktivitas lipase ini menggunakan S.
epidermidis sebagai referensi. Produksi lipase
oleh S. epidermidis telah dilaporkan oleh
Farrell et al. (1993) dan Simons et al. (1998).
Esakkiraj et al. (2010) melaporkan enzim
lipase bakteri ini mempunyai aktivitas
optimum pada suhu 50 oC dan pH 7.0. Suhu
dan pH optimum tersebut sesuai dengan suhu
dan pH enzim lipase S. epidermidis yang
diukur pada penelitian ini.
Bakteri referensi, S. epidermidis memiliki
aktivitas lipase terbesar (0.117 U/ml)
kemudian diikuti oleh tiga isolat yaitu F6
(0.100 U/ml), EP2.22 (0.084 U/ml), dan F2
(0.044 U/ml). Aktivitas spesifik enzim
tertinggi dimiliki oleh isolat EP2.22 (0.912
U/mg), F2 (0.792 U/mg), dan F6 (0.659
U/mg) yang lebih tinggi dibandingkan bakteri
referensi (0.452 U/mg). Oleh karena itu,
ketiga isolat bakteri fruktosfer tersebut dipilih
untuk tahap selanjutnya yaitu penentuan pH
dan optimum enzim serta identifikasi strain
bakteri.
Kerja enzim ditentukan oleh beberapa
faktor, antara lain pH dan suhu. Reaksi enzim
dengan substrat akan terus meningkat seiring
dengan meningkatnya suhu hingga pada suhu
optimum. Setelah pada suhu optimum, enzim
akan mengalami penurunan aktivitas karena
terjadi denaturasi protein. Hal ini akan
membuat enzim menjadi rusak atau
kehilangan sifat alaminya (Bettelheim et al.
2007). Aktivitas enzim meningkat pada pH
optimum. pH optimum enzim dipengaruhi
oleh sekurangnya dua hal, yaitu gugus ion
pada sisi katalitik enzim dan muatan pada
struktur protein (Bisswanger 2008).
Aktivitas enzim meningkat pada pH
optimum disebabkan perubahan gugus ionik
enzim pada sisi aktif, sehingga konformasi sisi
aktif lebih efektif dalam mengikat dan
mengubah substrat menjadi produk. Enzim
merupakan molekul yang mengandung
sejumlah besar gugus asam dan basa. Muatan
pada gugus tersebut akan bervariasi
tergantung pada konstanta disosiasi asam
gugus tersebut terhadap pH lingkungan. Hal
ini akan berpengaruh pada muatan total enzim
dan gugus katalitik sehingga perubahan pH
akan mempegaruhi aktivitas, stabilitas
struktur, dan kelarutan enzim (Chaplin &
Bucke 1990).
Berdasarkan pH optimum, lipase isolat
EP2.22 dapat digolongkan sebagai lipase
netral, sedangkan lipase F2 dan F6 dapat
digolongkan sebagai lipase alkalin. Dua
puncak aktivitas yang tinggi lipase isolat
EP2.22 dan F6 pada penentuan suhu optimum
(Gambar 6) disebabkan enzim yang dipakai
merupakan enzim ekstrak kasar dan belum
dipurifikasi. Oleh karena itu, diduga kedua
isolat menghasilkan lebih dari satu jenis
enzim lipase dengan suhu optimum yang
berbeda. Lipase yang memiliki aktivitas tinggi
pada 70 oC merupakan lipase termofil, yaitu
pada lipase isolat EP2.22, F2, dan F6. Hal ini
unik karena ketiga lipase tersebut diekstrasi
dari bakteri mesofil yang berhabitat pada
fruktosfer kelapa sawit. Lipase termofil lain
yang berhasil diekstraksi dari bakteri mesofil
juga telah dilaporkan Sulong et al. (2006)
pada Bacillus sphaericus.
Analisis gen 16S rRNA mengidentifikasikan EP2.22, F2, dan F6 berkolerasi erat
dengan Staphylococcus klosii, Enterobacter
sp., F6 sebagai Buttiauxella izardii.
Buttiauxella izardiii merupakan salah satu
8
spesies dari genus baru pada famili
Enterobacteriaceae yang diisolasi dari
moluska (Muller et al. 1996). Bakteri ini
dikeetahui dapat mereduksi logam berat
(Sharma & Fulekar 2009). Kemampuan
mereduksi logam dan lipolitik membuatnya
berpotensi sebagai bioremediator lingkungan
tercemar.
Genus
Enterobacter
dan
Staphylococcus telah diketahui sebagai bakteri
lipolitik (Zhang & Guan 2009; Rosenstein &
Götz 2000). Sampai saat ini, belum ada
publikasi ilmiah yang melaporkan tentang
keberadaan Buttiauxella izardii sebagai
bakteri lipolitik, sehingga penelitian ini yang
pertama kali melaporkan adanya aktivitas
lipolitik pada Buttiauxella izardii.
SIMPULAN
Sebanyak tujuh isolat bakteri lipolitik
berhasil diisolasi dari fruktosfer kelapa sawit
berdasarkan zona pendaran jingga yang kuat
pada media penapisan. Isolat EP2.22, F2, dan
F6 merupakan isolat terpilih yang memiliki
aktivitas terbaik. Isolat-isolat tersebut
mempunyai aktivitas yang tinggi pada rentang
pH dan suhu yang bervariasi. Analisis gen
16S rRNA mengidentifikasikan EP2.22, F2,
dan
F6
berkolerasi
erat
dengan
Staphylococcus klosii, Enterobacter sp., dan
Buttiauxella izardii.
DAFTAR PUSTAKA
Abbbas H, Hiol A, Deyris V, Comeau L.
2002. Isolation and characterization of an
extracellular lipase from Mucor sp. strain
isolated from palm fruit. Enzyme Microb
Tech 31:968-975.
Adiandri. 2002. Eksplorasi dan isolasi kapang
penghasil enzim lipase dengan aktivitas
esterifikasi dari berbagai bahan pangan
[skripsi]. Bogor: Fakultas Teknologi
Pertanian, Institut Pertanian Bogor.
Bettelheim FA, Brown WH. Campbell MK.
2007. Introduction to General Organic
and Biochemistry 8th ed. USA: Thompson
Brooks/Cole.
Bisswanger H. 2008. Enzyme Kinetic:
Principles and Methods. Weinheim:
Wiley-VCH.
Bewley JD, Black M, Halmer P. 2006. The
Encyclopedia of Seeds: Science, Technology and Uses. UK: CAB International.
Bradford MM. 1976. A rapid and sensitive
method for the quantities of protein
utilizing the principle of protein dye
binding. Anal Biochem 71:248-254.
Chaplin MF, Bucke C. 1990. Enzyme Technology. Cambridge. Cambridge Univ. Pr.
Djafar F, Purwadari T, Sinurat AP. 2010.
Isolation of endophytic bacteria from palm
oil fruits and characterization of their
lipases. Microbiol Indones: 4:69-74.
Ebongue GFN, Dhouib R, Carriere F, Zollo
PHM, Arondel V. 2006. Assaying lipase
activity from oil palm fruit (Elaeis
guineensis Jacq.) mesocarp. Plant Physiol
Bioch 44:616-617.
Esakkiraj P, Rajkumarbharathi M, Palavesam
A, Immanuel G. 2010. Lipase production
by Staphylococcus epidermidis CMST-Pi
1 isolated from the gut of shrimp Penaeus
indicus. Ann of Microb 60:37-42.
[FAO] Food and Agriculture Organization.
2010. Top Production Palm Oil 2008.
[terhubung berkala]. http://faostat.fao.
org/site/339/default.aspx. [6 Jun 2010].
Farrell AM, Foster TJ, Holland KT. 1993.
Molecular analysis and expression of the
lipase of Staphylococcus epidermidis. J
Gen Microbiol 139:267–77.
Frothingham R, Allen RL, Wilson KH. 1991.
Rapid 16S ribosomal DNA sequencing
from a single colony without DNA
extraction or purification. Biotechniques
11:40-44.
Hadioetomo RS. 1993. Mikrobiologi Dasar
dalam Praktek. Jakarta: Gramedia.
Handayani R, Sulistyo J. 2005. Transesterifikasi ester asam lemak melalui pemanfaatan teknologi lipase. Biodiversitas 6:164167.
Hasan F, Shah AA, Hameed A. 2006.
Industrial application of microbial lipases
[review]. Enzyme Microb Technol 39:235251.
Hiol A, Jonzo MD, Druet D, Comeau LC.
1999. Production, purification and
characterization of an extracellular lipase
from Mucor hiemalis f. hiemalis. Enzyme
Microb Techn 25:80-7.
Hiol A, Jonzo MD, Rugani N, Druet D, Sarda
L, Comeau L. 2000. Purification and
characterization of an extracellular lipase
from a thermophilic Rhizopus oryzae
strain isolated from palm fruit. Enzyme
Microb Technol 26:421-30.
Hou CT, Johnston TM. 1992. Screening of
lipase activities with cultures from the
agricultural research service culture
collection. J Am Oil Chem Soc 69:10881097.
Jaeger KE, Eggert T. 2002. Lipases for
biotechnology [review]. Curr Opin
Biotech 14:390–397.
9
Jaeger KE, Djikstra BW, Reetz MT. 1994.
Bacterial biocatalysts: molecular biology,
three-dimensional structures, and biotechnological applications of lipase [review].
Annu Rev Microbiol 53:315-351.
Kouker G, Jaeger KE. 1987. Specific and
sensitive plate assay for bacterial lipases.
Appl Environ Microbiol 53:211-213.
Kwon YD, Rhee JS. 1986. A simple and rapid
calorimetric method for determination of
free fatty acid for lipase assay. J Am Oil
Chem Soc 63:89-92.
Marchesi JR et al. 1998. Design and
evaluation of useful bacterium specific
PCR primer that amplify genes coding for
bacterial 16S-rRNA. Appl Environ
Microbiol 64:795-799.
McInerney JO, Mullarkey M, Wernecke ME,
Powell R. 2001. Bacteria and archea:
molecular techniques reveal astonishing
diversity. Biodiversity 3:3-10.
Muller HF, Brenner DJ, Fanning GR, Grimont
PAD, Kampfer P. 1996. Emended
description of Buttiamella agrestis with
recognition of
six new species of
Buttiamella and two new species of
Kluyvera: Buttiamella ferragutiae sp. nov.,
Buttiamella gaviniae sp. nov., Buttiamella
brennerae sp. nov., Buttiamella izardii
sp. nov., Buttiamella noackiae sp. nov.,
Buttiamella warmboldiae sp. nov.,
Kluyvera cochleae sp. nov., and Kluyvera
georgiana sp. nov. Int J Syst Bacteriol
46:50-63.
Pereira-Meirelles FV, Rocha-Leão MH, Sant
Anna GL Jr. 1997. A stable lipase from
Candida lipolytica. Appl Biochem Biotech.
63:73-85.
Pahan I. 2008. Panduan Lengkap Kelapa
Sawit: Manajemen Agribisnis dari Hulu ke
Hilir. Jakarta: Penebar Swadaya.
Pandiangan
P.
2008.
Studi
proses
interesterifikasi enzimatik (EIE) campuran
minyak sawit dan minyak kelapa untuk
produksi bahan baku margarin bebas asam
lemak trans [tesis]. Bogor: Program
Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.
Pelczar MJ Jr, Chan ECS. 1986. Dasar-Dasar
Mikrobiologi. Volume ke-1. Hadioetomo
RS, Imas T, Tjitrosomo SS, Angka SL,
penerjemah; Jakarta: UI Pr. Terjemahan
dari Elements of Microbiology.
Poku K. 2002. Small-Scale Palm Oil
Processing in Africa. Rome: FAO.
Rahman RNZRA, Leow TC, Salleh AB, Basri
M. 2007. Geobacillus zalihae sp. nov., a
thermophilic lipolytic bacterium isolated
from palm oil mill effluent in Malaysia.
BMC Microbiol 7:77-86.
Rosenstein R, Götz F. 2000. Staphylococcal
lipases: Biochemical and molecular
charac-terization. Biochimie
82:10051014.
Rost TL, Barbour MG, Stocking CR, Murphy
TM. 2006. Plant Biology 2nd ed. USA:
Thompson Brooks/Cole.
Rupilius W, Ahmad S. 2006. The changing
world of oleochemicals. Palm Oil
Developments 44:15-28.
Saxena RK, Ghosh PK, Gupta R, Davidson
WS, Bradoo S, Gulati R. 1999. Microbial
Lipases: Potential biocatalysts for the
future industry [review]. Current Sci
77:101-115.
Sharma R, Chisti Y, Banerjee UC. 2001.
Production, purification, and applications
of lipases [review]. Biotechnol Adv
19:627-662.
Sharma J, Fulekar MH. 2009. Phylo-genetic
analysis of the potential micro-organism
for remediation of heavy metals from the
contaminated environment. IJBB 3:19-30.
Simons JW, van Kampen MD, Riel S, Gotz F,
Egmond MR, Verhey HM. 1998. Cloning,
purification and characterization of the
lipase from Staphylococcus epidermidis comparison of the substrate selectivity
with those of other microbial lipases. Eur J
Biochem 253:675-83.
Sulong MR, Abd. Rahman RN, Salleh AB,
Basri M. 2006. A novel organic solvent
tolerant lipase from Bacillus sphaericus
205y: Extracellular expression of a novel
OST-lipase gene. Protein Expres Purif
49:190-195.
Tjitrosoepomo G. 1985. Morfologi Tumbuhan.
Yogyakarta. Gajah Mada Univ Pr.
Zhang ZQ, Guan CY. 2009. Screening for
lipase-producing Enterobacter agglomerans for biodiesel catalyzation. J
Biotechnol 8:1273–1279.
10
LAMPIRAN
11
Lampiran 1 Hasil penapisan bakteri lipolitik pada fruktosfer kelapa sawit
Isolat
F1
F2
F4
F6
EP2.22
EPN2
FFB1
Asal
Eksokarp dan mesokarp
Eksokarp dan mesokarp
Eksokarp dan mesokarp
Eksokarp dan mesokarp
Eksokarp
Eksokarp dan mesokarp
Eksokarp
Lampiran 2 Karakterisasi morfologi isolat dan pewarnaan Gram bakteri lipolitik asal fruktosfer
kelapa sawit
Isolat
Makroskopis
Diameter
(cm)
Elevasi
Margin
Bentuk
Bentuk
sel
Pewarnaan
Gram
kuning
merah
muda
merah
muda
merah
muda
merah
muda
0.1
datar
keriting
bundar
kokus
positif
0.5
cembung
licin
bundar
batang
negatif
1
licin
bundar
batang
positif
licin
bundar
batang
negatif
1
datar
seperti
tombol
seperti
tombol
licin
bundar
batang
positif
kuning
merah
muda
0.1
cembung
berombak
bundar
kokus
positif
0.5
timbul
licin
bundar
batang
positif
Warna
F1
F2
F4
F6
EPN2
EP2.22
FFB1
0.1
Lampiran 3 Bagan alir pembuatan reagen cupric-acetate pyridine
5 gram cupric-acetate
Larutkan dengan 100 ml akuades hingga homogen
Sesuaikan pH larutan dengan pyridine hingga mencapai pH 6
12
Lampiran 4 Kurva standar asam palmitat
absorbansi (715 nm)
0.6
y = 0.137x + 0.029
R² = 0.990
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0
1
2
3
4
konsentrasi lemak bebas (µmol/ml)
Lampiran 5 Data standar asam palmitat
Volume asam
palmitat 1% (ml)
Volume Isooktan
(ml)
Konsentrasi asam lemak
bebas µmol/ml
Absorbansi 715
nm
0.001
3.999
0.01
0.004
0.010
3.990
0.08
0.035
0.050
3.950
0.39
0.084
0.100
3.900
0.78
0.127
0.150
3.850
1.17
0.198
0.200
3.800
1.56
0.223
0.250
3.750
1.95
0.330
0.300
3.700
2.34
0.369
0.350
3.650
2.73
0.394
0.400
3.600
3.12
0.448
0.450
3.550
3.51
0.504
Konsentrasi lemak bebas dihitung dengan rumus:
Konsentrasi asam lemak bebas (μmol/ml) =
V asam palmitat × [asam palmitat] × 1000
volume total
Keterangan:
V asam palmitat = Volume asam palmitat yang digunakan (ml)
Volume total
= volume total asam palmitat, isooktan, dan cupric-acetate pyridine (5 ml)
[asam palmitat] = Molaritas asam palmitat dengan konsentrasi 1% (b/v) dan berat molekul
256. 43, yaitu sebesar 0.039 M
1000
= konversi M ke mM
Aktivitas lipase dihitung dengan rumus:
Aktivitas lipase (Unit/ml) =
Keterangan:
X
T
X
T
= konsentrasi asam lemak bebas (µmol/ml) yang perhitungannya diperoleh dari
persamaan linear standar asam palmitat y = 0.137x + 0.029
= waktu inkubasi (30 menit)
13
Lampiran 6 Kurva standar kadar protein
absorbansi (595 nm)
2.000
1.500
y = 0.007x + 0.130
R² = 0.981
1.000
0.500
0.000
0
50
100
150
200
250
konsentrasi protein (µg/mL)
Lampiran 7 Data standar kadar protein
[BSA] µg/mL
Volume BSA (µl)
Bufer fosfat (µl) Absorbansi 595 nm
5
2.5
997.5
0.063
10
5
995
0.139
25
12.5
987.5
0.387
50
25
975
0.641
75
37.5
962.5
0.789
100
50
950
0.875
125
62.5
937.5
1.082
150
75
925
1.375
175
87.5
912.5
1.506
200
100
900
1.631
Aktivitas spesifik lipase dihitung dengan rumus:
Aktivitas spesiϐik lipase (Unit/mg) =
Keterangan:
X
T
X
T
= aktivitas lipase (U/ml)
= kadar protein (ml/mg) yang perhitungannya diperoleh dari persamaan linear
astandar kadar protein y = 0.007x + 0.130 dikali dengan faktor pengenceran
14
Lampiran 8 Pengukuran aktivitas enzim, kadar protein, dan aktivitas spesifik enzim lipase ekstrak
kasar bakteri lipolik asal frukosfer kelapa sawit dan S. epidermidis.
Isolat
Aktivitas Enzim
(Unit/ml)
Kadar Protein (µg/mL)
Aktivitas Spesifik Enzim
(Unit/mg)
F1
0.023
61.57
0.374
F2
0.044
55.57
0.792
F4
0.017
312.86
0.054
F6
0.100
151.79
0.659
FFB1
0.011
87.00
0.126
EPN2
0.013
206.86
0.063
EP2.22
0.084
92.14
0.912
S9
0.117
258.57
0.452
Lampiran 9 Pengukuran suhu optimum enzim
Isolat
Suhu
Aktivitas Lipase (U/ml)
Ulangan 1
EP2.22
F2
F6
S9
Ulangan 2
Rata-rata
Standar
Aktivitas
Deviasi
relatif (%)
30
0.063
0.065
0.064
0.002
88
40
0.075
0.071
0.073
0.003
100
50
0.043
0.053
0.048
0.007
65
60
0.052
0.052
0.052
0.000
70
70
0.060
0.064
0.062
0.002
85
80
0.028
0.034
0.031
0.004
42
30
0.088
0.074
0.081
0.010
71
40
0.088
0.089
0.088
0.001
78
50
0.097
0.091
0.094
0.004
83
60
0.109
0.107
0.108
0.001
95
70
0.113
0.114
0.113
0.001
100
80
0.105
0.077
0.091
0.019
80
30
0.084
0.079
0.082
0.003
90
40
0.074
0.070
0.072
0.003
79
50
0.064
0.066
0.065
0.001
72
60
0.081
0.079
0.080
0.001
88
70
0.087
0.095
0.091
0.005
100
80
0.079
0.084
0.082
0.004
90
30
0.085
0.064
0.074
0.014
42
40
0.165
0.149
0.157
0.012
89
50
0.185
0.168
0.176
0.013
100
60
0.160
0.146
0.153
0.010
87
70
0.103
0.109
0.106
0.004
60
80
0.067
0.057
0.062
0.007
35
15
Lampiran 10 Pengukuran pH optimum enzim
Isolat
pH
Aktivitas Lipase (U/ml)
Ulangan 1
EP2.22
F2
F6
S9
Ulangan 2
Rata-rata
Standar
Aktivitas
Deviasi
relatif (%)
5
0.036
0.047
0.041
0.008
61
5.5
0.034
0.048
0.041
0.010
60
6
0.041
0.053
0.047
0.008
69
6.5
0.043
0.061
0.052
0.013
76
7
0.047
0.067
0.057
0.014
84
7.5
0.062
0.074
0.068
0.009
100
8
0.033
0.062
0.048
0.021
70
8.5
0.031
0.050
0.041
0.014
60
9
0.038
0.046
0.042
0.006
62
5.0
0.016
0.024
0.020
0.006
34
5.5
0.021
0.024
0.023
0.002
39
6.0
0.024
0.023
0.024
0.001
41
6.5
0.025
0.025
0.025
0.000
43
7.0
0.029
0.024
0.026
0.003
45
7.5
0.023
0.034
0.028
0.008
48
8.0
0.033
0.038
0.035
0.004
60
8.5
0.051
0.065
0.058
0.010
100
9.0
0.036
0.037
0.037
0.001
63
5
0.016
0.005
0.011
0.008
21
5.5
0.024
0.005
0.014
0.013
28
6
0.047
0.024
0.035
0.016
69
6.5
0.046
0.020
0.033
0.018
64
7
0.044
0.019
0.031
0.018
62
7.5
0.043
0.040
0.041
0.002
81
8
0.054
0.035
0.044
0.014
87
8.5
0.060
0.041
0.051
0.013
100
9
0.059
0.027
0.032
0.022
84
5.0
0.022
0.048
0.035
0.019
25
5.5
0.023
0.050
0.037
0.019
26
6.0
0.061
0.098
0.079
0.026
57
6.5
0.073
0.110
0.091
0.026
66
7.0
0.109
0.169
0.139
0.042
100
7.5
0.083
0.121
0.102
0.027
73
8.0
0.023
0.075
0.049
0.037
35
8.5
0.039
0.072
0.056
0.024
40
9.0
0.036
0.062
0.049
0.019
35
16
Lampiran 11 Protokol Qiaquick® PCR Purification Kit menggunakan microcentrifuge
5x volume PCR larutan PB
Taruh di kolom
Sentrifus 13000, 1 menit
Buang supernatan
Ditambah 750 µl larutan PE
Sentrifus 13000, 1 menit, 2x
Taruh di tabung baru, diamkan 10-15 detik
Ditambah 20 µl larutan EP
Diamkan 10-15 detik
Sentrifus 13000 rpm, 1 menit
Simpan supernatan
Lampiran 12 Protokol Big Dye® X-Terminator Purification Kit
Hasil cycle sequencing
Ditambah 18 µl SAM solution
Ditambah 4 µl x-terminator solution
Vorteks 30 menit
Sentrifus 1000 rpm (microcentrifuge), 2 menit
15 µl supernatan di loading ke plate sequencer
Run
Download