40 III. METODE A. Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini

40
III. METODE
A. Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Februari - Mei 2015 di Laboratorium
Biokimia Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Universitas Lampung.
B. Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan adalah erlenmeyer, beaker glass, jarum ose, pipet tetes,
mikropipet Eppendroff, neraca analitik, lemari pendingin, pembakar spirtus, biuret
dan statif, sentrifuga, magnetik stirer, autoclave model S-90N, oven, laminar air
flow CRUMA model 9005-FL, waterbatch shaker incubator HAAKE, pH meter,
waterbath, incubator, ayakan 100 mesh dan spektrofotometer UV-VIS Cary Win
UV 32.
Bahan-bahan yang digunakan adalah Nutrient Agar, aquades, Gum arab, minyak
zaitun, pepton, (NH4)2SO4, NaNO3, Na2CO3, KH2PO4, MgCl.6H2O, CaCl2. 2H2O,
NaOH, Na(K)-Tartarat, NaH2PO4, Na2HPO4, Phenolphtalein (PP), reagen folinciocalteu, HCl, HF, Buffer fosfat pH 7, lautan Bovine Serum Albumin (BSA),
41
Asam Oksalat (H2C2O4 . 2H2O), kantong selofan dan Bentonit. Mikroorganisme
yang digunakan adalah bakteri Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 yang
diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi Balai Laboratorium Kesehatan Daerah
Provinsi Lampung.
C. Prosedur Penelitian
1.
Pembuatan Media dan Larutan Pereaksi
a.
Pembuatan media pertumbuhan bakteri dengan induser minyak zaitun
2,8 gram nutrient agar (NA) dan 2 ml minyak zaitun, dilarutkan dalam 100
mL aquades kemudian disterilkan pada temperatur 120 ºC tekanan 1 atm,
setelah itu dituang ke dalam tabung, dimiringkan dan simpan pada suhu
kamar.
b.
Pembuatan media inokulum
Media yang digunakan adalah media cair M.Sarley yang dimodifikasi. Media
inokulum dibuat dengan cara menimbang bahan-bahan yang terdiri dari
pepton 1 g; Gum arab 5 g; minyak zaitun 10 ml; NaNO3 0,1 g; KH2PO4 0,1
g; MgCl2 .6H2O 0,05 g; CaCl2. 2H2O 0,05 g; dilarutkan dalam 1000 ml buffer
posfat pH 7 kemudian media disterilkan pada temperatur 121 °C, tekanan 1
atm selama 15 menit dalam autoclave.
c.
Pembuatan media fermentasi
Media fermentasi yang digunakan (gL-1) terdiri dari pepton 1 g; Gum arab 5
g; minyak zaitun 10 ml; NaNO3 0,1 g; KH2PO4 0,1 gr; MgCl2 .6H2O 0,05 g;
42
CaCl2. 2H2O 0,05 g; dilarutkan dalam buffer posfat pH 7 sebanyak 1000 mL
dalam labu erlenmeyer dan media fermentasi tersebut disterilkan
menggunakan autoclave pada suhu 121ºC, tekanan 1 atm selama 15 menit.
d.
Pembuatan larutan pereaksi

Pereaksi yang digunakan untuk pengukuran aktivitas enzim lipase metode
Titrimetri (Pereira et al., 2001).
-
Larutan NaOH 0,05 N, dengan menimbang 2 gram NaOH kemudian
dilarutkan ke dalam 1000 ml aquades.
-
Campuran etanol dan aseton perbandingan (1:1), dengan
mencampurkan 100 ml etanol dan 100 ml aseton.
-
Larutan standar primer asam oksalat 0,05 N, dengan menimbang 0,63
gram H2C2O4 . 2H2O yang dilarutkan dalam 100 ml aquades.

Pereaksi yang digunakan untuk penentuan kadar protein metode Lowry
(Lowry et al., 1951).
-
Pereaksi A
: 2 g Na2CO3 dilarutkan dalam 100 NaOH 0,1 N
-
Pereaksi B
: 5 mL larutan CuSO4.5H2O 1% ditambahkan
kedalam 5 mL larutan Na(K) tartarat 1%
-
Pereaksi C
: 2 mL pereksi B ditambahkan 100 mL pereaksi A
-
Pereaksi D
: reagen folin ciocelteau diencerkan dengan akuades
1:1.
-
Larutan standar
: larutan BSA (Bovine Serum Albumin) dengan
kadar 0, 20, 40, 60, 80, 100, 120, dan 140 ppm.
43
2.
Penentuan kondisi optimum pertumbuhan bakteri Pseudomonas
aeruginosa ATCC 27853
Penentuan kondisi optimum dilakukan dengan menginokulasi bakteri
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 pada media cair inokulum M.Sarley
dalam buffer fosfat pH 7 pada suhu ruang yang diinkubasi selama 24 jam.
Kondisi optimum meliputi: variasi suhu (ºC ) 30; 35; 40; 45; 50; 55; 60,
variasi pH 5; 5,5; 6; 6,5; 7; 7,5; 8; 8,5; 9, dan variasi waktu inkubasi selama
120 jam dengan interval waktu sampling per 24 jam. Setiap perlakuan
ditentukan aktivitas enzim lipase dengan metode Titrimetri.
3.
Produksi enzim lipase
Sebanyak 2% inokulum bakteri ditambahkan ke dalam media fermentasi dan
diinkubasi pada suhu optimum, pH optimum dan waktu fermentasi optimum
untuk memperoleh jumlah maksimum enzim yang diproduksi.
4. Isolasi enzim Lipase
Isolasi enzim adalah metode pemisahan enzim dari komponen selnya. Pada
penelitian ini isolasi enzim dilakukan dengan cara sentrifugasi. Prinsip
sentrifugasi berdasarkan kecepatan sedimentasi dengan cara pemusingan.
Sentrifugasi digunakan untuk memisahkan enzim ekstraseluler dari sisa-sisa
sel. Sentrifugasi dilakukan pada suhu rendah (di bawah suhu kamar) untuk
menjaga kehilangan aktifitas enzim (Suhartono, 1989). Media fermentasi
44
yang telah diinkubasi, selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan putaran
5000 rpm pada suhu 4°C selama 30 menit. Filtrat yang diperoleh merupakan
ekstrak kasar enzim lipase. Ekstrak kasar enzim lipase kemudian diuji
aktivitasnya dengan metode Titrimetri dan diukur kadar proteinnya dengan
metode Lowry.
5. Uji aktivitas enzim lipase metode Titrimetri (Pereira et al., 2001).
a. Uji aktivitas lipase menggunakan larutan NaOH 0,05 N, yaitu, sebanyak 2
mL substrat minyak zaitun, ditambah 1 mL buffer posfat 0,05 M pH 7 dan
1 mL larutan enzim. Campuran larutan substrat dan enzim ini kemudian di
inkubasi pada temperatur 35 ºC selama 30 menit. Kemudian substrat enzim
diinaktifkan dengan menggunakan 1 mL campuran aseton : etanol (1:1) ,
lalu tambahkan 5 tetes indikator PP 1% dan titrasi dengan larutan standar
NaOH 0,05 N. Titrasi dihentikan pada saat terjadi perubahan warna larutan
menjadi merah muda. Pengukuran aktivitas dilakukan secara duplo.
b. Untuk penentuan blanko dilakukan dengan komposisi larutan yang sama,
tetapi saat dimasukkan larutan enzim dengan segera ditambahkan campuran
aseton : etanol (1:1) sebanyak 1 mL, lalu titrasi dengan prosedur yang
sama dengan analisis sampel. Analisis aktivitas lipase dihitung
berdasarkan selisih volume titran sampel dengan blanko, seperti persamaan
dibawah ini;
Aktivitas Lipase = ( V. Sampel - V. Blanko x NaOH  x 1000 )
V. Enzim x t
45
Keterangan :
V.sampel
: Volume titran sampel (mL)
V.blanko
: Volume titran blanko (mL)
[NaOH]
: Konsentrasi NaOH (Normalitas)
V.enzim
: Volume enzim (mL)
t.
: waktu inkubasi (menit)
1000
: nilai konversi dari mmol kedalam satuan µmol
6. Penentuan kadar protein metode Lowry (Lowry et al., 1951).
Sebanyak 0,1 mL enzim ditambahkan 0,9 mL akuades lalu direaksikan dengan
5 mL pereaksi C dan diaduk rata. Kemudian dibiarkan selama 10 menit pada
suhu ruang. Setelah itu ditambahkan dengan cepat 0,5 mL pereaksi D dan
diaduk dengan sempurna, didiamkan selama 30 menit pada suhu kamar. Untuk
kontrol, 0,1 mL enzim diganti dengan 0,1 mL akuades, selanjutnya
perlakuannya sama seperti sampel. Serapannya diukur menggunakan
spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 750 nm. Untuk
menentukan konsentrasi protein enzim digunakan kurva standar BSA (Bovine
Serum Albumin).
7. Pemurnian Enzim Lipase
Enzim lipase yang diperoleh dimurnikan melalui 2 tahap sebagai berikut:
a.
Fraksinasi dengan amonium sulfat [(NH4)2SO4]
46
Ekstrak kasar enzim yang diperoleh diendapkan dengan garam ammonium
sulfat pada berbagai derajat kejenuhan yaitu (0-20 %; (20-40)%; (4060)%; (60-80)%; dan (80-100)%. Skema proses pengendapan ditunjukkan
pada Gambar 8. Sejumlah ekstrak kasar enzim yang diperoleh
ditambahkan garam ammonium sulfat secara perlahan sambil diaduk
dengan magnetic stirer pada suhu 4°C. Endapan protein enzim yang
didapatkan pada tiap fraksi kejenuhan ammonium sulfat dipisahkan dari
filtratnya dengan sentrifugasi dingin pada kecepatan 5000 rpm selama 30
menit. Kemudian diuji aktivitasnya dengan metode Titrimetri, serta diukur
kadar proteinnya dengan metode Lowry.
Ekstrak Kasar Enzim
+ (NH4)2SO4 (0-20%)
Endapan(F1)
Filtrat
+ (NH4)2SO4 (20-40%)
Endapan(F2)
Filtrat
+ (NH4)2SO4 (40-60%)
Endapan(F3)
Filtrat
+ (NH4)2SO4 (60-80%)
Endapan(F4)
Filtrat
+ (NH4)2SO4 (80-100%)
Endapan(F5)
Filtrat
Gambar 8. Skema proses pengendapan protein enzim dengan
pengendapan ammonium sulfat
47
b. Dialisis
Endapan enzim yang telah dilarutkan dari tiap fraksi ammonium sulfat
dengan aktivitas spesifik yang tinggi dimasukkan ke dalam kantong
selofan dan didialisis dengan bufer fosfat 0,05 M pH 7 selama ±24 jam
pada suhu dingin. Selama dialisis, dilakukan pergantian larutan bufer
selama 4-6 jam agar konsentrasi ion-ion di dalam kantong dialisis dapat
dikurangi. Proses ini dilakukan secara kontinu sampai ion-ion di dalam
kantong dialisis dapat diabaikan. Untuk mengetahui bahwa sudah tidak
ada lagi ion-ion garam dalam kantong, maka diuji dengan menambahkan
larutan Ba(OH)2 atau BaCl2. Bila masih ada ion sulfat dalam kantong,
maka akan terbentuk endapan putih BaSO4. Semakin banyak endapan
yang terbentuk, maka semakin banyak ion sulfat yang ada dalam kantong.
Selanjutnya dilakukan uji aktivitas dengan metode Titrimetri serta diukur
kadar proteinnya dengan metode Lowry.
8. Amobilisasi enzim lipase menggunakan bentonit.
a. Preparasi matriks bentonit
Serbuk bentonit diayak dengan ayakan 120 mesh. Sebanyak 40 gram
serbuk bentonit dikocok dengan 160 ml HCl 2 M kemudian di centrifuge
150 rpm selama 4 jam. Campuran di saring dengan kertas saring whatman
dan endapan dicuci dengan aquades sampai pH 7 lalu dikeringkan dalam
oven 105ºC sampai beratnya konstan (Adel dan Haerudin, 2003).
48
b.
Penentuan pH untuk proses pengikatan enzim lipase pada bentonit
Enzim lipase sebanyak 1 ml diikatkan pada 1 gram bentonit dengan variasi
pH 5 ; 5,5 ; 6 ; 6,5 ; 7 ; 7,5 dan 8 menggunakan buffer fosfat 0,05 M,
kemudian, diaduk 5-10 menit. Campuran tersebut dibiarkan hingga
terpisah antara endapan dan filtrat lalu endapan dan filtrat diuji aktivitas
enzim lipase dengan metode titrimetri.
c. Amobilisasi enzim lipase
Sebanyak 1 mL enzim lipase di amobil dengan 1 gram bentonit pada pH
pengikatan. Kemudian campuran diaduk hingga rata dan simpan dalam
fryzer selama 30 menit. Selanjutnya dicuci dengan akuades sebanyak tiga
kali, dicentrifuge dan endapan (enzim amobil) diuji aktivitasnya untuk
pemakaian berulang dengan metode Titrimetri.

Pemakaian berulang enzim amobil
1. Endapan (enzim amobil) ditambah 2 mL minyak zaitun dan 1 mL
buffer fosfat 0,05 M pH 7.
2. Untuk blanko ditambahkan 1 ml campuran aseton : etanol (1:1)
3. Campuran diinkubasi pada suhu 35 ºC selama 30 menit
4. Kemudian disaring sampai diperoleh filtrat dan endapan
5. Filtrat di titrasi dengan NaOH 0,05 N menggunakan indikator PP 1%
6. Endapan sebagai enzim lipase amobil yang telah dipakai dilakukan
pengulangan sampai enam kali dan setiap pengulangan ditentukan
aktivitas enzim menggunakan metode titrimetri.
49
9. Karakterisasi enzim lipase sebelum dan sesudah amobilisasi
a.
Penentuan suhu optimum
Untuk mengetahui suhu optimum kerja enzim dilakukan dengan
memvariasikan suhu yaitu 30, 35; 40; 45; 55; 60; 65; dan 70; .
Selanjutnya aktivitas enzim diukur dengan metode Titrimetri.
b.
Penentuan KM dan Vmaks
Konstanta Michaelis-Menten (KM) dan laju reaksi maksimum (Vmaks)
enzim lipase ditentukan dengan memvariasikan konsentrasi substrat 0.5;
1,0; 1,5; 2,0; dan 2,5% dalam buffer fosfat pada pH 8 dan suhu 35 ºC
selama 30 menit. Selanjutnya diukur aktivitas enzim dengan metode
Titrimetri dan data aktivitas enzim dan konsentrasi substrat diplotkan ke
dalam kurva Lineweaver-Burk untuk penentuan nilai KM dan Vmaks.
c.
Uji stabilitas termal enzim lipase (Yang et al., 1996)
Penentuan stabilitas termal enzim dilakukan dengan mengukur aktivitas
sisa enzim setelah diinkubasi selama periode waktu 60 menit pada suhu
dan pH optimum. Caranya adalah dengan mengukur aktivitas enzim
setelah proses pemanasan setelah interval waktu 10 menit. Aktivitas awal
enzim (tanpa proses pemanasan) diberi nilai 100%.
50
Perhitungan aktivitas sisa (Virdianingsih, 2002).
d. Penentuan waktu paruh (t1/2), konstanta laju inaktivasi (ki), dan perubahan
energi akibat denaturasi (∆Gi)
Penentuan nilai ki (konstanta laju inaktivasi termal) enzim lipase hasil
pemurnian dan hasil amobilisasi dilakukan dengan menggunakan
persamaan kinetika inaktivasi orde 1 (Kazan et al., 1997) dengan
persamaan:
ln (Ei/E0) = - ki t
Sedangkan untuk perubahan energi akibat denaturasi (∆Gi) enzim hasil
pemurnian dan hasil amobilisasi dilakukan dengan menggunakan
persamaan (Yandri et al., 2007):
∆Gi = - RT ln (ki h/kB T)
Keterangan :
R
= konstanta gas (8,315 J K-1 mol-1)
T
= suhu absolut (K)
ki
= konstanta laju inaktivasi termal
h
= konstanta Planck (6,63 x 10-34 J det)
kB
= konstanta Boltzmann (1,381 x 10-23 JK-1)
51
Secara keseluruhan, penelitian ini terangkum dalam diagram alir penelitian yang
ditunjukkan dalam Gambar 9.
Produksi Enzim
Isolasi Enzim
Ekstrak Kasar Enzim
Uji aktivitas enzim lipase
(metode Titrimetri) dan
penentuan kadar protein
metode Lowry
Pemurnian Enzim :
1. Fraksinasi dengan
ammonium sulfat
2. Dialisis
Amobilisasi Enzim
Karakterisasi Enzim
Enzim Lipase amobil
Penentuan
suhu optimum
Uji pemakaian
berulang enzim amobil
Penentuan
Km dan Vmaks
Gambar 9. Diagram alir penelitian
Penentuan
stabilitas termal