Isolasi Enzim Lipase Termostabil Dari Bakteri Termofilik Isolat Air

Akta Kimindo Vol. 2 No. 2 Oktober 2007: 109-112
Akta Kimindo Vol. 2 No. 2 April 2007: 109 – 112
AKTA KIMIA
INDONESIA
Isolasi Enzim Lipase Termostabil Dari Bakteri Termofilik Isolat Air Panas
Banyuwedang Kecamatan Gerogak, Buleleng Bali‡
I Nyoman Tika1,*, I W Redhana1 dan Ni Putu Ristiati2
1Jurusan
2Jurusan
Pendidikan Kimia,FPMIPA, IKIP Negeri Singaraja, Jl. Udayana, Singaraja
Pendidikan Biologi, FPMIPA, IKIP Negeri Singaraja, Jl. Udayana, Singaraja
ABSTRAK
Isolasi enzim lipase termostabil dari bakteri termofilik dari sumber air panas Banyuwedang
Kecamatan Gerogak Buleleng Bali telah dilakukan. Seleksi bakteri termofilik penghasil lipase dengan
menggunakan media sensitive plate assay mengandung Rhodamin B ditemukan 4 koloni bakteri yang
berpendar (BYW1, BYW2, BYW3 dan BYW4). Isolat lokal Banyuwedang ditumbuhkan dalam media cair ½
LB (Lauria Bertani) pada suhu 50ºC. Aktivitas spesifik ekstrak enzim kasar masing-masing isolat BYW1,
BYW2, BYW3 dan BYW4 Banyuwedang berturut-turut sebesar 0,87 unit/mg; 1,12 unit/mg; 0,55 unit/mg;
dan 0,35 Unit/mg.
Kata kunci : Bakteri termofilik, enzim lipase, air panas Banyuwedang
ABSTRACT
Isolation of thermostable lipase enzym from thermophillic bacteria isolated from hot spring
Banyuwedang Kecamatan Gerogak Buleleng was carried out. Thermophilic bacteria were selected using
Rhodamin B media sensitive plate assay. It was found four colonie flourecence bacteria (BYW1, BYW2,
BYW3 and BYW4). Isolated bacteria from Banyuwedang were grown in Lauria Bertani (LB) media at
temperature 50oC. The specific activity of lipase crude enzymes isolated from Banyuwedang : (BYW1,
BYW2, BYW3 and BYW4) were 0.87 unit/mg; 1.12 unit/mg; 0.55 unit/mg and 0.35 Unit/mg, respectively.
Keywords : - thermophilic bacteria, lipase enzyme, hot spring Banyuwedang
PENDAHULUAN
Enzim lipase termostabil atau asilgliserol
hidrolase (E.C 3.1.1.3) merupakan enzim yang
dapat menghidrolisis rantai panjang trigliserida.
Enzim ini memiliki potensi untuk digunakan
memproduksi asam lemak, yang merupakan
prekursor berbagai industri kimia. Produksi asam
lemak secara industri menggunakan katalis kimia
menghasilkan efek samping bagi lingkungan.
Selain itu enzim lipase telah banyak dikenal
memiliki cakupan aplikasi yang amat luas dalam
bidang bioteknologi, seperti biomedikal, pestisida,
pengolahan limbah, industri makanan, biosensor,
detergen, untuk industri kulit dan industri
oleokimia (memproduksi asam lemak dan
turunannya) (Macrae,A.R.,1983).
‡ Makalah ini disajikan pada Seminar Nasional Kimia VIII,
di Surabaya 8 Agustus 2006
* Corresponding author. Tel. : 0362-25072-; Fax : 036225735 ; e-mail : [email protected]
© Kimia ITS – HKI Jatim
Enzim lipase termostabil dari bakteri
termofilik merupakan enzim yang sangat
potensial untuk mengatasi kendala teknis
industri, namun masih ditemukannya kendala
lain, dalam hal perolehan hasil (yield) enzim
lipase termostabil dari mkroorganisme termofilik
yang sangat rendah. Untuk mengatasi kendala itu
beberapa pendekatan ditempuh sebagai berikut :
pertama pencarian sumber baru enzim lipase
termostabil dari mikroorganisme termofilik yang
tumbuh dari habitat yang unik. Kedua, suhu
fermentasi yang sesuai untuk menghasilkan
lipase termostabil. Dan ketiga, rekayasa genetika
untuk menghasilkan enzim lipase termostabil
dengan ekspresi tinggi.
Pendekatan dengan mencari sumbersumber enzim baru dari mikroorganisme
termofilik yang diisolasi dari lingkungan unik
merupakan langkah yang paling memungkinkan
dilakukan, karena Indonesia memiliki banyak
sumber air panas yang potensial dan unik.
Sumber air panas yang ada di Bali sudah
dikembangkan sebagai obyek wisata namun
109
Nyoman, Redhana dan Ristiati - Isolasi Enzim Lipase Termostabil Dari Bakteri Termofilik Isolat Air Panas Banyuwedang
belum digali sebagai sumber mikroorganisme
termofilik.
Penelitian
mikroorganisme
termofilik
sumber air panas
masih belum banyak
dilakukan. Beberapa diantaranya telah diteliti
isolasi bakteri termofilik untuk menghasilkan
enzim DNA polimerase ( Akhmaloka, dkk., 2000,
Suharto dkk, 2002. Tika dkk., 2003) Pendekatan
ini merupakan langkah yang menarik untuk
mengungkap
biodiversitas
komunitas
mikroorganisme termofilik Indonesia.
Oleh karena itu tujuan penelitian ini adalah
untuk mendapatkan isolat-isolat bakteri termofilik
dari sumber air panas, dan khususnya isolat-isolat
bakteri termofilik yang dapat menghasilkan enzim
lipase termostabil dari sumber air panas di
Propinsi Bali.
water bath. Emulsi yang terbentuk dicampur
minyak olive dan 50 mL bufer posfat. Diinkubasi
pada suhu 50°C. Reaksi dihentikan dengan
penambahan 6 N HCl (1 mL) dan isooktan 5 mL,
lalu cairan ditambah isooktan 4 mL dipindahkan
ke tabung analisis, ditambahkan reagen Cu
(tembaga) dan larutan tembaga II asetat 1-hidrat
pH 6,1 yang mengandung piridin. Larutan pada
lapisan atas tabung diukur pada panjang
gelombang 715 nm.
ALAT DAN BAHAN
Bahan–Bahan yang digunakan
Rhodamin B untuk sensitive plate assay,
phytagel. Substrat yang digunakan adalah minyak
olive dan bahan kimia lain dengan derajat
proanalisis.
HASIL DAN PEMBAHASAN
HASIL Penelitian
Lokasi Banyuwedeng air panas 60-70
derajat Celsius, dan sering berubah karena
bercampur dengan sumber air tawar yang juga
digunakan oleh penduduk, serta adanya
rembesan air payau dari pantai. Hal yang sama
juga terjadi untuk sumber air panas Toya
Bungkah, resapan air danau menyebabkan suhu
relatif tidak tinggi.
PROSEDUR PENELITIAN
Identifikasi bakteri termofilik dan isolasi enzim
lipase
Identifikasi bakteri termofilik isolat lokal
(Bali) penghasil lipase meliputi uji enzim lipase,
morfologi dan pewarnaan gram. Uji aktivitas
dilakukan menurut Sensitive Plate Assay (Kouker
and Jaeger, 1987) dan titrasi. Koloni tunggal
yang tumbuh pada media padat LB ditumbuhkan
pada media yang mengandung Rhodamin B.
Diinkubasi selama 2 x 24 jam pada suhu 50oC.
Selanjutnya disinari dengan sinar UV dan diukur
halo yang terbentuk.
Uji aktivitas lipase termostabil
Aktivitas
enzim
lipase
termostabil
menggunakan metode yang dikembangkan oleh
Kwon et al., 1986. Ada tiga tahap, pertama, filtrat
kultur (1 mL) dikocok dengan emulsi 2,5 mL
(1:1,v/v) minyak olive (70% residu oleate). Kedua
20 µL CaCl2 0,02 M yang dikocok 200 rpm dalam
Penentuan Kadar Protein
Kadar protein larutan enzim ditentukan
dengan menggunakan metode Bradford, (Braford,
1976) dengan reagen dari Bio-Rad Protein Assay,
dengan menggunakan bovin serum albumin (BSA)
sebagai standar.
Gambar 1. Isolat bakteri termofilik Banyuwedang
pada media Rhodamin B , suhu 65 oC, sedangkan
E.coli tidak ditemukan
Tabel.1. Aktivitas masing masing biakan terhadap uji SPA (Media Rhodamin B)
No.
1.
Isolat dari Sumber
air panas
Banyuwedang
Indeks
(Halo) (mm)
Jumlah koloni
yang aktif Uji SPA
Jumlah Isolat koloni aktif
terhadap Uji SPA.
4
BYW1
0,8
BYW2
0,9
BYW3
0,5
BYW4
0,3
Keterangan:
SPA = Sensitive Plate Assay
110
© Kimia ITS – HKI Jatim
Akta Kimindo Vol. 2 No. 2 Oktober 2007: 109-112
Tabel 2. Aktivitas enzim ekstraseluler crude enzim lipase isolat lokal (Bali)
No.
1.
2.
3.
4.
Isolat
Aktivitas
(unit/mL)
Volume
(mL)
Protein
Total
(mg)
24
4,37
1,6 x 10-4
4,90
BYW1
BYW2
25
BYW3
25
BYW4
9,10
22
5,66
Aktivitas
spesifik
(Unit/mg)
Aktivitas
Total
(unit)
3,84 x 10 -3
0,87
2,2 x
10-4
5,50 x 10
-3
1,12
2,0 x
10-4
5,00 x 10
-3
0,55
0,9 x
10-4
1,98 x 10
-3
0,35
Satu unit aktivitas lipase didefinisikan sebagai aktivitas enzim lipase yang dapat membebaskan 1 µmol asam lemak
per menit.
Aktivitas relatif (%)
100
75
50
25
0
BYW1
BYW2
BYW3
BYW4
Isolat Banyuwedang
Gambar 2. Perbandingan aktvitas enzim ekstrak kasar lipase bakteri termofilik hasil isolasi dari sumber air
panas Banyuwedang).
1
2
3
4 5
KDa
94
67
40
30
24
14
Gambar 3. Elektroforegram SDS-Page ekstrak enzim kasar isolat Banyuwedang (1) Standar : Ekstrak kasar
lajur (2) BYW4, (3) BYW3, (4) (BYW2, (5) BYW1.
Dalam teori BM lipase berkisar antara 3060 Kda, pita tebal pada lajur 4 diduga adalah
lipase termostabil, hal ini sesuai dengan Halo
yang ditunjukkan terbesar pada isolat BYW2.
Pembahasan
Mikroorganisme penghasil lipase tersebar
luas di alam, termasuk sumber air panas, karena
© Kimia ITS – HKI Jatim
telah ditemukan beberapa bakteri yang memiliki
sifat termostabil. Ketahanan beberapa jenis
bakteri pada suhu tinggi karena
mampu
membentuk spora (endospora) (Madigan,et al.,
1997; Breithaupt, 2001) Endospora genus
Bacillus memunculkan dugaan bahwa Bacillus
termasuk salah satu kelompok mikroorganisme
sel purba, karena sebarannya amat luas di muka
111
Nyoman, Redhana dan Ristiati - Isolasi Enzim Lipase Termostabil Dari Bakteri Termofilik Isolat Air Panas Banyuwedang
bumi dan ada beberapa jenis Bacillus yang dapat
tumbuh baik pada suhu tinggi (Oskam,1963).
Habitatnya yang luas memungkinkan genus ini
mudah ditemukan baik di udara, air maupun di
tanah.
Enzim lipase yang dihasilkan oleh bakteri
termofilik biasanya dihasilkan pada seluruh fase
kehidupan mikroorganisme (Brockman, et al.,
1988). Enzim ini digunakan untuk memecah
lemak menjadi komponen asam lemak, yang
amat
dibutuhkan
dalam
metabolisme
mikroorganisme yang bersangkutan. Enzim ini
bersifat
konstitutif
artinya
terus-menerus
diekspresi tanpa membutuhkah induser. Ekspresi
enzim lipase meningkat saat mikroorganisme
memasuki fase kematian karena jumlah produk
lemak dari sel-sel yang mati meningkat (Madigan,
1994). Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa
aktivitas tertinggi ekstrak enzim kasar isolat
Banyuwedang BYW2. Hal ini juga dibuktikan
dengan reaksi antara Rhodamin B dengan asam
lemak, dimana produk dari kerja enzim lipase
yang dihasilkan oleh isolat BYW2 membentuk
kompleks dan berpendar membentuk halo
(Kauker and Jaeger, 1987, Pao and Omar, 2004).
Makin besar diameter pendaran semakin banyak
enzim lipase yang diekspresi oleh bakteri
termofilik.
KESIMPULAN
Hasil isolasi enzim lipase termostabil dari
bakteri termofilik yang berasal dari sumber air
panas Banyuwedang Kecamatan Gerogak
Buleleng Bali ditemukan 4 koloni bakteri yang
berpendar dalam media Rhodamin B (BYW1,
BYW2, BYW3 dan BYW4). Isolat lokal
Banyuwedang ditumbuhkan dalam media cair ½
LB (Lauria Bertani) pada suhu 50 ºC. Aktivitas
spesifik ekstrak enzim kasar masing-masing isolat
BYW1, BYW2, BYW3 dan BYW4 Banyuwedang
berturut-turut sebesar 0,87 unit/mg; 1,12
unit/mg; 0,55 unit/mg dan 0,35 Unit/mg.
UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis menyampaikan terima kasih
kepada Program Penelitian Dasar Dirjen Dikti,
Depdiknas RI Tahun 2006.
112
DAFTAR PUSTAKA
Akhmaloka, I.N.Tika, H.Pramono and M.
Sindumarta (2000a), Isolation
and
characterization of DNA polymerase from a
local thermophilic microorganism, J.M.S., 4,
335-343.
Akhmaloka, H.Pramono, I.N.Tika, A.Suharto, D.S.
Retnoningrum,
M.
Sindumarta,
K.Padmawinata, dan B.L. Oei
(2000b),
Eksplorasi potensi bakteri termofilik isolat
lokal : Studi kasus
DNA polmerase
termostabil, Proseding
Seminar hasil
penelitian dan pengembangan Bioteknologi
II, Cibinong 7-9 Maret 2000: 31-39.
Bradford, M. M. (1976), A rapid and and sensitive
Method for the Quantitation of Microgram
Quantities of protein utilizing the principle of
protein–Dye Binding, Anal.Biochem., 72,
248-254.
Breithaupt, H. (2001), The Hunt for living gold: The
search for organisme in extreme yields
useful enzymes for industry, EMBO report,
2(11): 968-971
Brockman, H.W., W.E. Morsen and T. Tsuijita
(1988), The Biology, biochemistry and
technology of lipase. J.Am. Oil Chem.Soc., 65,
891-896.
Macrae,A.R. (1983), Extracelullar microbial
lipases. In “Microbial Enzymes and
biotecknology’, ed. Fogarty, W.M., Applied
Science Publiser Ltd, England, pp.225-250.
Madigan, M.T., J. M. Martindo and J.Parker
(1997), Brock Biology of Microorganisms,
Eight Ed., Prentice Hall Int., Inc, New York.
Oskam, L. (1963), Characterization of plasmids
for gene cloning in Bacilli at hight
temperatures, Poefschrift, Rijksuniversiteit
Groningen.
Suharto, A.R. (2002), Identifikasi Mikroorganisme
Termofilik
Isolat Papandayan dengan
penetuan urutan dan analisisa gen 16
rRNA, Skripsi, Dept. Kimia ITB. Bandung.
Tika, I N., H. Pramono, M. Sindumarta, K.
Padmawinata dan Akhmaloka (2003),Isolasi
dan Karakterisasi Bakteri Termofilik dari
Sumber Air Panas Cimanggu, Bandung, Jawa
Barat, PIT, Permi., 29-30 agustus 2003.
© Kimia ITS – HKI Jatim