KLONING GEN PENYANDI ENDO-1,4-β
advertisement
ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga KLONING GEN PENYANDI ENDO-1,4-β-XILANASE ASAL ISOLAT A BAKTERI XILANOLITIK SISTEM ABDOMINAL RAYAP TANAH PADA E.coli Top10 (pET-30a(+)) SKRIPSI PREVITA ZEIZAR RAHMAWATI DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI UNIVERSITAS AIRLANGGA SURABAYA 2012 Skripsi Previta Zeisar Rahmawati Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli Top10 (pET-30a(+)) ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga KLONING GEN PENYANDI ENDO-1,4-β-XILANASE ASAL ISOLAT A BAKTERI XILANOLITIK SISTEM ABDOMINAL RAYAP TANAH PADA E.coli Top10 (pET-30a(+)) SKRIPSI Sebagai Salah Satu Syarat Untuk Memperoleh Gelar Sarjana Sains Bidang Kimia Pada Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Airlangga Oleh: PREVITA ZEIZAR RAHMAWATI NIM 080810623 Tanggal Lulus: 7 Agustus 2012 Disetujui Oleh: Skripsi Pembimbing I Pembimbing II Prof. Dr. Ni Nyoman Tri P., M.Si NIP. 19630615 198701 2 001 Dr. Sri Sumarsih, M.Si NIP. 19600110 198810 2 001 Previta Zeisar Rahmawati Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli Top10 (pET-30a(+)) ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga LEMBAR PENGESAHAN NASKAH SKRIPSI Judul Penyusun NIM Tanggal ujian : Kloning Gen Penyandi Endo-1,4-β-Xilanase Asal Isolat A Bakteri Xilanolitik Sistem Abdominal Rayap Tanah Pada E. coli Top10 (pET30a(+)) : Previta Zeizar Rahmawati : 080810623 : 7 Agustus 2012 Disetujui oleh : Pembimbing I, Pembimbing II, Prof. Dr. Ni Nyoman Tri Puspaningsih, M.Si NIP. 19630615 198701 2 001 Dr. Sri Sumarsih, M.Si NIP. 19600110 198810 2 001 Mengetahui, Ketua Departemen Studi Kimia Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Airlangga Dr. Alfinda Novi Kristanti, DEA NIP. 19671115 199102 2 001 Skripsi Previta Zeisar Rahmawati Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli Top10 (pET-30a(+)) ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga PEDOMAN PENGGUNAAN SKRIPSI Skripsi ini tidak dipublikasikan, namun tersedia di perpustakaan dalam lingkungan Universitas Airlangga. Diperkenankan untuk memakai sebagai referensi kepustakaan, tetapi pengutipan seijin penulis dan harus menyebutkan sumbernya sesuai dengan kebiasaan ilmiah. Dokumen skripsi ini merupakan hak milik Universitas Airlangga Skripsi Previta Zeisar Rahmawati Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli Top10 (pET-30a(+)) ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga KATA PENGANTAR Puji syukur kehadirat Allah SWT atas segala rahmat dan hidayah-Nya, sehingga penyusun dapat menyelesaikan proposal skripsi dengan judul Kloning Gen Penyandi Endo-1,4-β-Xilanase Asal Isolat A Bakteri Xilanolitik Sistem Abdominal Rayap Tanah Pada E.coli Top10 [pET-30a(+)] dengan tepat waktu. Penulisan proposal skripsi ini tidak akan selesai tanpa bantuan dan dukungan dari berbagai pihak. Oleh karena itu, penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada: 1. Prof. Dr. Ni Nyoman Tri Puspaningsih, M.Si selaku dosen pembimbing I dan Ibu Dr. Sri Sumarsih, M.Si selaku pembimbing II yang telah memberikan waktu, saran, doa dan bimbingan kepada penulis sampai terselesaikan skripsi ini. 2. Ibu Dr. Hartati, MS selaku Dosen Wali yang senantiasa membimbing serta memberikan banyak masukan. 3. Seluruh staf pengajar program studi S1 Departemen Kimia Fakultas Sains dan Teknologi yang telah memberikan bekal ilmu yang bermanfaat kepada penulis. 4. Papa, Mama, Kakak dan Adik yang memberikan kasih sayang, doa, semangat kepercayaan, dan dukungan baik secara moril maupun materi kepada penulis selama penyusunan proposal skripsi. 5. Ibu A.A. Istri Ratnadewi, terima kasih telah mempercayakan penulis untuk mengerjakan sebagian dari riset proyek penelitiannya. Skripsi Previta Zeisar Rahmawati Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli Top10 (pET-30a(+)) ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga 6. Tim proteomik TDC, mbak One, mbak Nita, mbak Laura dan mbak Titin, mas Fanani terima kasih atas segala masukan-masukan dan semangat yang diberikan kepada penulis. 7. Para staf TDC di lab. Lepra dan lab. Malaria mbak dinar, mbak ratna, mbak agnes dan mbak wahyu, terima kasih atas bantuan dalam analisis nanodrop, PCR, dan geldoc. 8. Teman – teman kelompok penelitian biokim blast (Tea, Amal, Amel, Luluk, Nadya, Dita, Siska, Rohis, Jo, Resti, Mumun, Ryan) yang saling memberikan semangat selama proses penelitian dan penyusunan skripsi ini 9. Serta pihak – pihak yang tidak dapat disebutkan satu persatu yang banyak memberikan saran, masukan dan pengalamannya. Penyusun menyadari bahwa dalam penulisan proposal skripsi ini masih banyak kekurangan, sehingga penyusun mengharapkan kritik dan saran yang membangun demi perbaikan proposal skripsi ini selanjutnya. Penyusun berharap proposal skripsi ini dapat bermanfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan khususnya ilmu bahan alam. Surabaya, Agustus 2012 Penyusun Previta Zeizar R. Skripsi Previta Zeisar Rahmawati Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli Top10 (pET-30a(+)) ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga Rahmawati, Previta Zeisar., 2012, Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli Top10 (pET-30a(+)). Skripsi ini dibawah bimbingan Prof. Dr. Ni Nyoman Tri Puspaningsih, M.Si. dan Dr. Sri Sumarsih, M.Si, Departeman Kimia, Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Airlangga, Surabaya. ABSTRAK Endo-1,4- ß-xilanase merupakan enzim yang dapat mengkatalisis hidrolisis ikatan glikosida pada xilan yang berpotensi dalam proses industri pangan, pakan, pulp dan pengolahan limbah pertanian. Penelitian ini bertujuan untuk mengamplifikasi dan kloning gen penyandi endo-1,4- ß-xilanase asal bakteri sistem abdominal rayap tanah ke dalam E.coli Top10 [pET-30a(+)] serta menentukan urutan basa nukleotida dan tingkat homologinya terhadap gen endo-1,4-β-xilanase lain yang ada di GenBank. Proses amplifikasi gen penyandi endo-1,4-β-xilanase isolat A dilakukan dengan menggunakan PCR dengan 30 siklus dan pada kondisi denaturasi 940C, annealing 580C, extension 72oC. Amplikon yang diperoleh kemudian dilakukan transformasi ke dalam plasmid pET-30a(+) dan di klon kan kedalam E.coli Top 10 dan mendapatkan rekombinan yang dinamakan pEXyl06. Dari hasil analisis sekuensing, di dapatkan urutan basa dari gen penyandi endo1,4- ß-xilanase pada plasmid pET-30a(+) rekombinan dengan ukuran gen 642 bp. Fragmen gen endo-1,4-β-xilanase asal isolat A mempunyai tingkat homologi 99% dengan gen endo-1,4-β-xilanase Bacillus subtilis strain MWO dan termasuk ke dalam kelompok glikosida hidrolase famili 11. Kata kunci : Bacillus subtilis, endo-1,4-β-xilanase, kloning gen, sekuensing, homologi, PCR Skripsi Previta Zeisar Rahmawati Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli Top10 (pET-30a(+)) ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga Rahmawati, Previta Zeisar., 2012, Cloning of Genes encoding endo-1,4-βxilanase from xilanolytic bacterial isolate A of soil termite abdominal system in E.coli Top10 (pET-30a(+)). Script is under the guidance of Prof. Dr. Ni Nyoman Tri Puspaningsih, M.Si. dan Dr. Sri Sumarsih, M.Si, Department of Chemistry, Faculty of Science and Technology, Airlangga University, Surabaya. ABSTRACT Endo-1,4-ß-xylanase is an enzyme that can catalyze the hydrolysis of the glycoside bond on xylan that industrial processes of food, feed, pulp and agricultural waste. This study aims to amplification and cloning of genes encoding endo-1,4-ß-xylanase from abdominal system termite soil bacteria into E. coli Top10 [pET-30a (+)] and determine the sequence of nucleotide bases and the level of they homology of the else endo-1,4-β-xylanase genes in GenBank. The process of amplification of the gene encoding endo-1,4-β-xylanase from isolate A were performed using PCR with 30 cycle and the conditions of denaturation at 940C, 580C annealing, extension 72oC. Then, amplicon was transformed into the plasmid pET-30a (+) and clone it into E. coli Top 10. The result showed that recombnant namely pEXyl06. From the results of sequencing analysis, in order to get bases of the gene encoding endo-1,4-ß-xylanase in the plasmid pET-30a (+) recombinants with gene size 642 bp. Gene fragments of endo-1 ,4-β-xylanase from isolate A has 99% homology with the gene endo-1 ,4-β-xylanase Bacillus subtilis strain MWO and belongs to the group of glycoside hydrolase family 11. Keywords: Bacillus subtilis, endo-1,4-β-xylanase, gene cloning, sequencing, homology, PCR Skripsi Previta Zeisar Rahmawati Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli Top10 (pET-30a(+)) ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga DAFTAR ISI Skripsi HALAMAN JUDUL .................................................................................... LEMBAR PERNYATAAN .......................................................................... LEMBAR PENGESAHAN........................................................................... LEMBAR PEDOMAN PENGGUNAAN SKRIPSI..................................... KATA PENGANTAR ................................................................................... ABSTRAK..................................................................................................... DAFTAR ISI ................................................................................................. DAFTAR GAMBAR ..................................................................................... DAFTAR TABEL ......................................................................................... DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................. i ii iii iv v vii ix xii xiv xv BAB I PENDAHULUAN ............................................................................. 1.1 Latar Belakang Masalah ............................................................... 1.2 Rumusan Masalah ......................................................................... 1.3 Tujuan Penelitian .......................................................................... 1.4 Manfaat Penelitian ........................................................................ 1 1 4 4 5 BAB II TINJAUAN PUSTAKA ................................................................... 2.1 Rayap ........................................................................................... 2.2 Xilan ............................................................................................ 2.3 Enzim-enzim xilanolitik .............................................................. 2.3.1 Enzim endo-β-xilanase ........................................................ 2.3.2 Enzim endo-β-xilosidase ..................................................... 2.3.2 Enzim α-L-arabinofuranosidase........................................... 2.4 Enzim-enzim antara untuk memanipulasI DNA ............................ 2.5 Polymerase chain reaction (PCR) ................................................ 2.6 Vektor kloning ............................................................................. 2.6.1 Plasmid pET-30a(+) .......................................................... 2.7 Kloning gen ................................................................................. 2.8 Tahapan kloning gen .................................................................... 2.8.1 Amplifikasi DNA sisipan ................................................... 2.8.2 Proses restriksi DNA insert dan DNA plasmid.................... 2.8.3 Ligasi DNA insert dengan plasmid ..................................... 2.8.4 Transformasi DNA rekombinan.......................................... 2.8.5 Sekuensing DNA................................................................ 6 6 8 9 9 10 11 12 15 16 17 18 21 21 21 22 23 24 BAB III METODE PENELITIAN ............................................................... 3.1 Tempat dan Waktu Penelitian ....................................................... 3.2 Sampel penelitian ......................................................................... 3.3 Bahan dan Alat Penelitian ............................................................. 3.2.1 Bahan penelitian ................................................................. 3.2.2 Alat penelitian .................................................................... 3.4 Diagram alir penelitian ................................................................. 26 26 26 26 26 27 28 Previta Zeisar Rahmawati Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli Top10 (pET-30a(+)) ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga Skripsi 3.5 Prosedur penelitian ...................................................................... 3.5.1 Pembuatan larutan ............................................................... 3.5.1.1 Pembuatan larutan buffer TE 500mM....................... 3.5.1.2 Pembuatan larutan lisosim........................................ 3.5.1.3 Pembuatan larutan STEP 500 µL.............................. 3.5.1.4 Pembuatan larutan Na-asetat 3M .............................. 3.5.2 Pembuatan media ................................................................ 3.5.2.1 Pembuatan media cair untuk koloni E.coli ................ 3.5.2.2 Pembuatan media cair untuk koloni E.coli (pET-30a(+))............................................................ 3.5.2.3 Pembuatan media padat ............................................ 3.5.2.4 Pembuatan media padat untuk koloni E.coli (pET-30a(+))............................................................ 3.5.3 Peremajaan isolat bakteri xilanolitik (isolat A).................... 3.5.4 Isolasi DNA kromosom isolat A ......................................... 3.5.5 Peremajaan E.coli (pET-30a(+)) ......................................... 3.5.6 Isolasi DNA plasmid pET-30a(+) ....................................... 3.5.7 Pemurnian DNA plasmid pET-30a(+)................................. 3.5.8 Amplifikasi gen penyandi endo-1,4-β-xilanase menggunakan teknik PCR ................................................... 3.5.9 Analisis DNA dengan elektroforesis gel agarosa................. 3.5.10 Pemurnian amplikon .......................................................... 3.5.11 Restriksi amplikon dan plasmid pET-30a(+) ...................... 3.5.12 Ligasi gen penyandi endo-1,4-β-xilanase dan plasmid pET-30a(+) ....................................................................... 3.5.13 Kloning pET-30a(+) rekombinan kedalam E.coli Top10 .... 3.5.13.1 Peremajaan isolat E.coli Top10 dari stok gliserol.. 3.5.13.2 Pembuatan sel kompeten E.coli Top10 ................. 3.5.13.3 Transformasi plasmid pET-30a(+) ke E.coli Top10........................................................ 3.5.14 Seleksi transforman koloni E.coli Top10 pembawa plasmid rekombinan pET-30a(+) ....................................... 3.6 Sekuensing dengan metode sanger ............................................... 3.7 Analisis homologi hasil rekombinan dengan gen lain yang telah dipublikasikan dalam database GenBank menggunakan program BLAST ......................................................................................... 29 29 29 29 29 29 30 30 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ....................................................... 4.1 Isolasi DNA kromosom isolat A...................................................... 4.2 Isolasi DNA plasmid pET-30a(+).................................................... 4.3 Amplifikasi gen penyandi endo-1,4-β-xilanase dengan teknik PCR . 4.4 Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase ..................................... 4.4.1 Restriksi amplikon dan plasmid pET-30a(+) .......................... 4.4.2 Ligasi gen penyandi endo-1,4-β-xilanase dan plasmid pET30a(+) ................................................................................... 4.4.3 Transformasi plasmid pET-30a(+) rekombinan ke E.coli 41 41 42 44 49 49 30 30 31 31 31 32 33 34 35 35 36 37 37 37 37 38 39 39 40 40 50 Previta Zeisar Rahmawati Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli Top10 (pET-30a(+)) ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga Top10.................................................................................... 51 4.4.4 Seleksi transforman E.coli Top10 pembawa plasmid pET30a(+) rekombinan ................................................................ 54 4.5 Analisis urutan basa nukleotida dan homologi DNA plasmid pET30a(+) rekombinan pembawa gen penyandi endo-1,4-β-xilanase ..... 56 BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ......................................................... 62 5.1 Kesimpulan ..................................................................................... 62 5.2 Saran............................................................................................... 62 DAFTAR PUSTAKA .................................................................................... 63 LAMPIRAN Skripsi Previta Zeisar Rahmawati Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli Top10 (pET-30a(+)) ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga DAFTAR GAMBAR Nomor Halaman 2.1 Koloni rayap ............................................................................ 7 2.2 Struktur xilan dan sisi pemotongannya. .................................... 9 2.3 Reaksi yang dikatalisis oleh eksonuklease dan endonuklease.... 12 2.4 Reaksi-reaksi yang dikatalisis oleh DNA ligase......................... 13 2.5 Reaksi-reaksi yang dikatalisis oleh DNA polimerase................. 14 2.6 Reaksi-reaksi yang oleh enzim yang memodifikasi DNA......... 14 2.7 Langkah-langkah dasar dalam PCR .......................................... 16 2.8 Peta plasmid pET-30a(+) ........................................................ 17 2.9 Langkah-langkah dasar dalam kloning gen ............................... 19 4.1 Elektroforesis hasil isolasi DNA kromosom ............................. 42 4.2 Elektroforesis hasil isolasi DNA plasmid pET-30a(+) .............. 44 4.3a Elektroforesis hasil amplifikasi gen penyandi endo-1,4-β-xilanase isolat A dengan primer xynF dan xynR ................................... 48 4.3b Hasil elektroforesis amplikon yang telah dimurnikan ............... 48 4.4 Analisis restriksi amplikon dan plasmid pET-30a(+) ................ 50 4.5 Pengikatan dan pengambilan plasmid oleh sel kompeten dengan 4.6 Skripsi Judul Gambar larutan CaCl2 ........................................................................... 51 Hasil transformasi ................................................................... 53 Previta Zeisar Rahmawati Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli Top10 (pET-30a(+)) ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga DAFTAR GAMBAR Nomor 4.7 Judul Gambar Halaman Hasil elektroforesis DNA dari transforman plasmid pembawa pET-30a(+) .............................................................................. 4.8 Skripsi 55 Alignment hasil sekuensing DNA plasmid pET-30a(+) rekombinan 57 Previta Zeisar Rahmawati Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli Top10 (pET-30a(+)) ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga DAFTAR TABEL Nomor Judul Tabel Halaman 4.1 Beberapa gen yang mempunyai homologi yang tinggi dengan gen penyandi endo-1,4-β-xilanase isolate A bakteri xilanolitik asal rayap tanah…………………………………………………………… Skripsi 60 Previta Zeisar Rahmawati Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli Top10 (pET-30a(+)) ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga DAFTAR LAMPIRAN Nomor Skripsi Judul Lampiran 1. Pembuatan Larutan TE 2. Pembuatan Larutan Lisosim 3. Pembuatan Larutan STEP 4. Pembuatan Na-Asetat 3 M 5. Pembuatan Larutan dan Bahan Untuk Elektroforesis 6. Electropherogram hasil sekuensing Previta Zeisar Rahmawati Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli Top10 (pET-30a(+)) ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga BAB I PENDAHULUAN 1.1 LATAR BELAKANG Indonesia merupakan salah satu Negara tropis di dunia yang memiliki berbagai jenis flora dan fauna. Fauna yang mempunyai tipe hidup di daerah tropis juga sangat bermacam-macam, salah satunya adalah rayap yang tergolong dalam kelas insekta. Di Indonesia, rayap mempunyai berbagai macam sebutan nama, sebagian besar menyebutnya dengan semut putih, di Sumatera digunakan istilah anai-anai, di Jawa disebut rangas, sedangkan beberapa jenis rayap di daerah Jawa Barat disebut rinyuh, sumpiyuh. Bergantung jenisnya, panjang tubuh rayap antara 4 - 11 mm. Di alam bebas, rayap berperan penting sebagai penjaga keseimbangan alam dengan cara menghancurkan kayu dan mengembalikannya sebagai "hara" ke dalam tanah. Namun di pemukiman rayap menjadi hama yang sangat merugikan dan menimbulkan kerugian ekonomis. Rayap dapat merusak bahan-bahan yang mengandung selulosa yang merupakan sumber makanan bagi rayap, karena rayap merupakan satu-satunya kelompok serangga yang mampu memanfaatkan selulosa sebagai sumber makanannya, seperti: kayu, kertas dan kain (Johnson, 1992). Komponen penyusun dinding sel kayu yaitu hemiselulosa, selulosa dan lignin. Kelimpahan selulosa dalam kayu adalah sebesar 40-55%, hemiselulosa sebesar 24-40% dan lignin sebesar 18-25% (Howard et al., 2003). Hemiselulosa tersusun atas xilan, sedangkan pada kayu lunak, komponen penyusunnya adalah glukomanan (Kumar et al, 2008). Karena kemampuan rayap sebagai pemakan 1 Skripsi Previta Zeisar Rahmawati Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli Top10 (pET-30a(+)) ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga kayu, pada sistem abdominal rayap terdapat mikroba yang bisa menghasilkan dan mensekresi enzim pendegradasi hemiselulosa seperti enzim xilanolitik. Enzim xilanolitik merupakan enzim kompleks yang terdiri atas endo-1,4-β-xilanase, βxilosidase, α-L-arabinofuranosidase, α-glukuronidase, asetil xilan esterase dan asam ferulat esterase (Collins et a.l, 2005). Enzim xilanolitik ini dapat digunakan untuk biobleching pada industri kertas, penjernihan dan meningkatkan aroma jus dan anggur, industri makanan dan pakan ternak (Jiang et al., 2009). Xilanase merupakan kelompok enzim yang memiliki kemampuan menghidrolisis hemiselulosa dalam hal ini ialah xilan atau polimer dari xilosa dan xilooligosakarida. Xilanase dapat diklasifikasikan berdasarkan substrat yang dihidrolisis, yaitu β-xilosidase, eksoxilanase, dan endoxilanase (Richana, 2002). Gen penyandi xilanase dari berbagai sumber, telah dikloning ke dalam berbagai sel inang misalnya, Kloning gen penyandi xilanase termostabil dari Actinomandura sp. S14 diekspresikan ke E.coli dan Pichia pastoris (Sriyapai et al. 2011), gen xilanase dari Bacillus subtillis strain R5 (Jalal et al., 2009), xilanase dari Bacillus strain B10 di E.coli (Huang et al., 2006), xilanase dari Paecilomyces thermophilia di E.coli dan mengkarakterisasi xilanase rekombinan (Zhang et al, 2010). Ratnadewi dkk (2009) telah melakukan: isolasi bakteri-bakteri pensekresi komponen enzim xilanolitik dari rayap tanah dan mendapatkan salah satu dari kelompok enzim xilanolitik yaitu enzim endo-1,4-β-xilanase yang dapat diperoleh melalui overekspresi gen penyandi enzim xilanolitik dari bakteri sistem abdominal Skripsi Previta Zeisar Rahmawati Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli Top10 (pET-30a(+)) ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga rayap. Enzim endo-1,4-β-xilanase yang diperoleh dimanfaatkan untuk produksi prebiotik xilooligosakarida dari xilan. Enzim endo-1,4-β-xilanase sangat penting di dunia industri dan dunia penelitian, maka perlu dilakukan adanya suatu kemampuan untuk produksi enzim endo-1,4-β-xilanase. Sehingga pada penelitian ini dilakukan kloning gen penyandi enzim endo-1,4-β-xilanase sehingga akan diperoleh gen penyandi endo-1,4-βxilanase yang murni dalam jumlah yang relatif besar. Pada penelitian ini dilakukan amplifikasi gen penyandi endo-1,4-βxilanase yang berasal dari isolat A yang kemudian di lakukan kloning ke E. coli Top10 (pET-30a(+)) dan menentukan urutan basa nukleotida dan tingkat homologi gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal sistem abdominal rayap tanah. Proses amplifikasi gen penyandi endo-1,4-β-xilanase dilakukan dengan teknik Polymerase Chain Reaction (PCR). Primer forward yang digunakan adalah berdasarkan dari sekuen primer yang telah berhasil untuk mengamplifikasi gen penyandi xilanase dari Bacillus strain B10 di E.coli (Huang et al., 2006) dan primer reverse yang digunakan adalah berdasarkan penelitian skripsi oleh Amaliah labiqah tentang amplifikasi gen penyandi endo xilanase pada rayap tanah. Proses amplifikasi gen endo-1,4-β-xilanase dilakukan proses denaturasi pada suhu 94oC, annealing menggunaka gradien suhu yaitu 40oC; 48oC; 52,oC; 58 o C dan extension pada suhu 72oC dengan jumlah siklus 30 kali. Amplikon yang diperoleh kemudian diklon ke dalam plasmid pET-30a(+). Plasmid rekombinan Skripsi Previta Zeisar Rahmawati Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli Top10 (pET-30a(+)) ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga tersebut kemudian di transformasi ke dalam sel inang Escherichia coli dengan jenis E.coli yang digunakan disini adalah E.coli Top10. 1.2 Rumusan Masalah Berdasarkan latar belakang permasalahan maka dapat diambil suatu rumusan masalah sebagai berikut : 1. Apakah gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal bakteri sistem abdominal rayap tanah dapat di amplifikasi dan diklon ke dalam E.coli Top10 (pET30a(+))? 2. Bagaimanakah urutan basa nukleotida dan tingkat homologi gen penyandi endo-1,4-β-xilanase rekombinan asal bakteri sistem abdominal rayap tanah? 1.3 Tujuan Penelitian Tujuan penelitian ini adalah sebagai berikut : 1. Melakukan amplifikasi dan kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal bakteri sistem abdominal rayap tanah ke dalam E.coli Top10 (pET30a(+)). 2. Menentukan urutan basa nukleotida dan tingkat homologi gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal bakteri sistem abdominal rayap tanah. Skripsi Previta Zeisar Rahmawati Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli Top10 (pET-30a(+)) ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga 1.4 Manfaat Penelitian Dengan melakukan kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase pada sistem abdominal rayap tanah pada E. coli Top10, diharapkan akan mendapatkan suatu rekombinan penghasil enzim endo-1,4-β-xilanase yang murni, selanjutnya enzim endo-1,4-β-xilanase dapat dimanfaatkan di dalam dunia industri makanan, peternakan dan lain-lain. Selain itu di penelitian ini juga memberikan informasi urutan basa nukleotida gen penyandi enzim endo-1,4-β-xilanase asal bakteri sistem abdominal rayap tanah. Skripsi Previta Zeisar Rahmawati Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli Top10 (pET-30a(+)) ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Rayap Rayap adalah jenis serangga pemakan selulosa yang berukuran sedang, yang termasuk dalam ordo Isoptera, secara relatif kelompok kecil dari serangga yang terdiri dari kurang lebih 1900 jenis di dunia. Hidup dalam jumlah kecil atau besar dengan organisasi yang sangat baik, komunitasnya membuat sejumlah kasta-kasta khusus yang memiliki pekerjaan khusus untuk kelangsungan hidup koloni. Rayap memiliki bentuk dan ukuran sayap depan yang sama dengan sayap belakang, sehingga ordonya disebut Isoptera (Iso = sama, ptera = sayap) (Johnson, 1992). Rayap mempunyai taksonomi sebagai berikut : Kerajaan : Animalia Filum : Arthropoda Kelas : Insekta Subkelas : Pterygota Ordo : Isoptera Famili : Mastotermitidae Kalotermitidae Termopsidae Hodotermitidae Rhinotermitidae Termitidae Skripsi 6 Previta Zeisar Rahmawati Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli Top10 (pET-30a(+)) ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga Diseluruh dunia telah dikenal sekitar 2000 spesies rayap (diidentifikasi dan dideskripsikan sekitar 120 spesies merupakan hama), sedangkan di Indonesia dari sejumlah 200 spesies yang dikenal baru sekitar 20 spesies yang diketahui berperan sebagai hama perusak kayu serta hama hutan atau pertanian (Tarumingkeng, 2001). Pada Gambar 2.1 rayap hidup di dalam habitat-habitat di bawah tanah yang lembab dan hidup di daerah kering yaitu diatas tanah. Sarangsarang rayap dapat didalam tanah seluruhnya, atau dapat menonjol diatas permukaan. Rayap-rayap kayu kering yang hidup di atas tanah tanpa kontak dengan tanah sama sekali hidup di potongan potongan batang pohon, pohonpohon dan bangunan yang terbuat dari kayu. Gambar 2.1. Koloni Rayap (Anonim) Sumber utama kelembabannya adalah air metabolik, yaitu air yang berasal dari oksidasi makanan. Pada awalnya rayap diyakini tidak dapat mencerna lignin secara baik, akan tetapi dari perbandingan oleh Seifert (1962) dari kontens lignin pada kayu dan feses menunjukkan bahwa rayap setidaknya bisa mendemilasi lignin (Kato, 1998). Selulosa dalam makanan rayap dicerna oleh berbagai macam Skripsi Previta Zeisar Rahmawati Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli Top10 (pET-30a(+)) ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga protista flagella yang berjumlah ribuan yang hidup didalam saluran pencernaan rayap (Johnson, 1992). 2.2 Xilan Xilan merupakan suatu heteropolisakarida, yaitu suatu komponen struktural utama dari hemiselulosa dari dinding sel tumbuhan. Endoxilanase (1,4β-D-xilan xilanohidrolase; EC 3.2.1.8) (Sriyapai et al,. 2010). Xilanase adalah Komponen utama hemiselulosa yang memiliki tulang punggung rantai Dxilopiranosa dengan ikatan glikosidik β-1,4. Xilan memiliki residu O-asetil, arabinosil dan 4-O-metil-D-asam glukoronat yang terikat pada tulang punggungnya. Hidrolisa lengkap xilan menjadi monomernya memerlukan kerja sinergi beberapa enzim xilanolitik (Zhou, et.,al., 2008). Xilanase banyak diketahui milik dari famili GH10 dan GH11 (Howard, 2003). Hidrolisis total xilan membutuhkan beberapa enzim yang berbeda, yaitu endo-1,4-β-xilanase (1,4-β-D-xilan xilanohidrolase, EC.3.2.1.8) yang menghidrolisis struktur dasar xilan secara acak menjadi xilooligosakarida; 1,4-βD-xilosidase (1,4-β-D-xilanxilohidrolase, EC.3.2.1.37) dan memutus xilooligosakarida menjadi xilosa. Gugus samping yang menyusun xilan akan dibebaskan oleh α-L-arabinofuranosidase, β-D-glukuronidase, galaktosidase dan asetil xilan esterase menjadi arabinosa, glukuronat, galaktosa dan asetat (Lee et al., 2009). Skripsi Previta Zeisar Rahmawati Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli Top10 (pET-30a(+)) ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga Gambar 2.2. Struktur xilan dan sisi pemotongannya (Shallom, 2003) 2.3 Enzim enzim xilanolitik Enzim-enzim pendegradasi xilan disebut enzim xilanolitik atau enzim xilanase. Macam-macam enzim xilanase yang bermanfaat antara lain: enzim endo-β-xilanase (EC.3.2.1.8), enzim β-xilosidase (EC.3.2.1.37), enzim α-Larabinofuranosidase (EC.3.2.1.55) dan enzim ekstra, yang mampu memotong rantai sisi kelompok heteroxilan . Produk akhir hidrolisis xilan adalah xilosa dan oligosakarida, dimana mempunyai aplikasi yang potensi di industri produksi makanan, farmasi, kertas, produk pertanian dan bahan bakar terbarukan (Sriyapai et al,. 2010). 2.3.1 Enzim endo-β-xilanase Endo xilanase mampu memutus ikatan β 1-4 pada bagian dalam rantai xilan secara teratur. Ikatan yang diputus ditentukan berdasarkan panjang rantai substrat, derajat percabangan, ada atau tidaknya gugus subtitusi, dan pola pemutusan dari enzim hidrolase tersebut. Enzim endo-β-xilanase (EC.3.2.1.8) Skripsi Previta Zeisar Rahmawati Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli Top10 (pET-30a(+)) ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga telah banyak dideteksi pada mikroorganisme seperti bakteri dan jamur dan masing masing telah di karakterisasi dengan baik, mikroba mikroba penghasil xilanase biasanya memiliki pH optimum asam atau netral (Gupta et al, 2000). Famili GH10 (disebut juga Famili F) merupakan kelompok endo xilanase dengan massa molekul relatif tinggi dengan harga pI yang rendah. Sebaliknya Famili GH11 (disebut juga Famili G) mempunyai massa molekul relatif rendah dengan harga pI yang tinggi. Kedua famili tersebut berbeda dalam hal sifat katalitiknya. Famili 10 mampu menyerang ikatan glikosidik di sebelah titik cabang dan mengarah ke ujung non-pereduksi dengan menggunakan dua residu xilopiranosil non-substitusi antara cabang-cabang, sedangkan famili 11 menggunakan tiga residu xilopiranosil non-substitusi. Berdasarkan hal tersebut, famili 10 mempunyai beberapa aktivitas katalitik yang sesuai dengan β-xilosidase (Kartika Ayu, 2006). Enzim xilanase GH famili 11, didapatkan dari Bacillus subtilis, dan Bacillus licheniformis. Untuk enzim xilanase GH famili 10 dijumpai pada Bacillus sp. (http://www.CAZy.org). 2.3.2 Enzim endo-β-xilosidase Endo-β-xilosidase, yaitu enzim xilanase yang mampu menghidrolisis xilooligosakarida rantai pendek menjadi xilosa. Aktivitas enzim akan menurun dengan meningkatnya rantai xilo-oligosakarida (Reilly, 1991). Xilosa selain merupakan hasil hidrolisis juga merupakan inhibitor bagi enzim endo-βxilosidase. Sebagian besar enzim endo-β-xilosidase yang berhasil dimurnikan masih menunjukkan adanya aktivitas transferase yang menyebabkan enzim ini kurang dapat digunakan industri penghasil xilosa. Skripsi Previta Zeisar Rahmawati Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli Top10 (pET-30a(+)) ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga 2.3.3 Enzim α-L-arabinofuranosidase Arabinosa residu ditemukan di pektin atau hemiselulosa seperti sebagai arabinans, arabinogalaktan, atau arabinoxylans di banyak dinding sel tumbuhan. Dalam gula bit arabinan, L-arabinosa residu terkait dalam membentuk α-1,5-Larabinan dari L arabinofuranose unit yang terpasang pada posisi 2 atau 3 dalam konfigurasi α sebagai rantai samping (Sakamoto et al., 2010). Arabinofuranosidase (EC3.2.1.55) mengkatalisis hidrolisis α-1,2 dan α-1 ,3arabinofuranosidik obligasi di hemiselulosa seperti arabinoxylan, arabinan, dan lainnya yang mengandung arabinosa polisakarida (Canakci et al., 2008). Enzim ini merupakan bagian dari glikosida hidrolase yang berperan dalm proses degradasi hemiselulosa seperti arabinoxilan, arabinogalaktan, dan Larabinan. Adanya substituen L-arabinofuranosida dalam struktur xilan dapat secara kuat menghambat aktivits endo-xilanase dan β-xilosidase yang berakibat menghalangi degradasi total dari polimer xilan (Shallom et al, 2003). Hal ini disebabkan oleh struktur L-arabinofuranosida yang cukup besar, sehingga akan terjadi halangan ruang bagi aktivitas endo-xilanase dan xilosidase. Oleh karena itu, keberadaan enzim arabinofuranosidase sangat penting dalam degradasi total xilan (Shallom et al, 2003). Arabinofuranosidase telah menerima banyak perhatian dalam beberapa tahun terakhir karena aplikasi potensi mereka dalam proses industri agro, seperti pengolahan buah-buahan, sayuran, dan sereal dan konversi hemiselulosa untuk bahan bakar dan bahan kimia. Arabinofuranosidase mungkin diterapkan untuk Skripsi Previta Zeisar Rahmawati Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli Top10 (pET-30a(+)) ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga meningkatkan aroma anggur dan jus buah serta produksi arabinosa, yang telah dilaporkan untuk menunjukkan efek antiglsemik (Canakci et al,. 2008). 2.4 Enzim-enzim Untuk Manipulasi DNA Di dalam kloning gen diperlukan enzim-enzim untuk memanipulasi DNA. Enzim-enzim ini dikelompokkan berdasarkan jenis reaksi yang dikatalisis (Brown, 2010), yaitu: 1. Nuklease, yaitu enzim yang memotong atau memendekkan atau mendegradasi molekul asam nukleat. Berdasarkan cara pemotongannya, nuklease dibedakan atas dua macam yaitu eksonuklease yang menghilangkan nukleotid satu persatu dari ujung molekul DNA dan endonuklease yang memecah ikatan fosfodiester internal pada molekul; DNA. Gambar 2.3 Reaksi yang dikatalisis oleh eksonuklease dan endonuklease Skripsi Previta Zeisar Rahmawati Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli Top10 (pET-30a(+)) ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga 2. Ligase, untuk menyambungkan antar asam nukleat satu dengan yang lain seperti pada DNA insert dengan plasmid dalam salah satu tahapan kloning gen. Gambar 2.4 Reaksi-reaksi yang dikatalisis oleh DNA ligase 3. Polimerase, untuk membuat kopi dari molekul DNA. Polimerase digunakan pada proses PCR, yaitu penggandaan DNA secara invitro yang dilakukan dalam tabung eppendorf dengan pencampuran yang membutuhkan satu set reagen tertentu yang salah satunnya enzim polimerase. Macam-macam reaksi yang dikatalis oleh enzim polymerase meliputi 4 macam jenis reaksi, yang pertama adalah basic reaction atau reaksi perpanjangan untai DNA pada umumnya, yaitu dengan mensintesis untai-untai DNA dari 5’ hingga 3’. Kedua adalah DNA polimerase I yaitu enzim yang menambah basa nukleotida pada daerah untai DNA yang kosong dan kemudian mengganti urutan basa nukleotida pada untai DNA selanjutnya dengan komplemennya Ketiga reaksi fragmen klenow yaitu reaksi penambahan basa DNA hanya di daerah untai DNA yang kosong saja. Dan yang keempat yaitu reaksi DNA reverse transcriptase yaitu reaksi yang dapat mensintesis untai DNA yang berasal dari untai RNA. Skripsi Previta Zeisar Rahmawati Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli Top10 (pET-30a(+)) ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga Gambar2.5 Reaksi-reaksi yang dikatalisis oleh DNA polimerase 4. Enzim modifikasi (modifying enzymes) yaitu suatu enzim untuk menghilangkan gugus fosfat pada ujung 5’ molekul DNA, menambah gugus fosfat dari ujung 5’ atau menambah satu atau lebih deoksinukleotida pada ujung 3’ molekul DNA. Dan yang terakhir adalah topoisomerisme, yaitu suatu enzim yang mampu membentuk dan mengubah lilitan DNA dari suatu DNA sirkuler. . Gambar2.6 Reaksi-reaksi yang oleh enzim yang memodifikasi DNA Skripsi Previta Zeisar Rahmawati Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli Top10 (pET-30a(+)) ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga 2.5 Polymerase Chain Reaction (PCR) Polymerase Chain Reaction (PCR) sangat berbeda dari kloning gen yaitu Serangkaian dari pada proses penggandaan DNA secara invitro yang dilakukan dalam tabung Eppendorf dengan pencampuran yang membutuhkan satu set reagen seperti DNA template, primer forward dan primer reverse, Taq DNA polymerase, buffer PCR, dNTP, MgCl, ddH2O dan ditempatkan pada suatu cycler secara terprogram dengan serangkaian suhu yang bervariasi. Langkah-langkah dasar dalam proses PCR adalah sebagai berikut (Brown, 2010). 1. Denaturasi DNA dilakukan pada suhu 94° C, di mana pada suhu tersebut ikatan hidrogen yang pada struktur DNA semula double-standed terdenaturasi berubah menjadi struktur DNA yang single-stranded. 2. Annealing (penempelan) primer dilakukan pada suhu 50-600 C. Dua untai tiap molekul single-stranded dapat bergabung kembali pada suhu ini. yaitu dengan cara proses penempelan primer yang dapat menempel ke molekul DNA pada posisi yang spesifik. 3. Proses sintesis DNA menggunakan suhu 74° C. Pada suhu 740C, Taq DNA polimerase bekerja dengan proses Taq DNA polimerase menempel pada ujung masing-masing primer forward dan reverse, kemudian mensintesis basa basa nukleotida sampai terbentuk untai molekul DNA yang baru 4. Suhu di naikkan kembali ke 94° C. molekul DNA double-stranded, masing-masing terdiri dari satu untai molekul DNA asli dan salah satu untai DNA baru, kembali ke proses denaturasi ke untai tunggal untuk siklus yang kedua. Skripsi Previta Zeisar Rahmawati Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli Top10 (pET-30a(+)) ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga Gambar 2.7. Langkah-langkah dasar dalam PCR (Brown, 2010) 2.6 Vektor Kloning Vektor kloning adalah konsep molekul DNA artifisial yang mampu bereplikasi dalam organisme inang dimana sepotong DNA dipelajari secara khusus dan dapat disisipkan pada posisi yang dikenal, molekul DNA rekombinan dimasukkan ke sel inang seperti E.coli, ragi, sel hewan, atau sel tumbuhan (Russell, 1994). Dalam proses kloning, gen atau DNA yang akan diklon kedalam Skripsi Previta Zeisar Rahmawati Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli Top10 (pET-30a(+)) ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga sel inang diperlukan suatu wahana atau vektor. Vektor ini yang akan mengantarkan DNA target untuk masuk kedalam sel inang. Terdapat tiga jenis utama dari vektor yang digunakan untuk kloning DNA dalam sel bakteri: plasmid, bagteriophage, dan Kosmid. Syarat sebuah vektor yang paling penting adalah bahwa wahana ini mampu mengadakan replikasi dalam sel tuan rumah sehingga menghasilkan banyak kopi molekul DNA rekombinan dan diturunkan pada sel anak saat terjadi pembelahan sel (Russell, 1994). 2.6.1 Plasmid pET30a(+) Gambar 2.8. Peta plasmid pET-30a(+) (Novagen) Diagram dari vektor plasmid pET30a(+). Vektor ini berukuran 5422bp, vektor ini memiliki beberapa fitur berikut sehingga berguna untuk kloning DNA 1. Origin of replicalion (ori) pada Plasmid pET30a(+) mengandung pBR322 sehingga, copy number pada pET30a(+) adalah 15-20 kopi per sel E. coli. Skripsi Previta Zeisar Rahmawati Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli Top10 (pET-30a(+)) ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga 2. Selectable marker pada plasmid pET30a(+) berupa kanamisin (kan). 3. Terdapat daerah sisi restriksi yang unik dan berguna untuk memasukkan DNA sekuen yang disebut polylinker atau Multiple Cloning Sites (MCS) yang digunakan untuk membuat plasmid rekombinan. 4. Terdapat lacI (lac repressor), dimana lacI adalah suatu gen yang dapat menghasilkan repressor. Repressor adalah suatu protein yang dapat menghalangi RNA polimerase menterjemahkan urutan gen dalam proses transkripsi. Bila RNA polymerase terhalangi oleh suatu repressor, maka DNA tidak bisa diterjemahkan oleh RNA polimerase dan protein tidak terekspresikan dalam sel inang. lacI yang bersifat alloserik dapat di non aktifkan oleh isopropil-β-D-thiogalaktopiranosida (IPTG) dan memicu ekspresi lac operon (Wall, 2009). 2.7 Kloning Gen Antara tahun 1971 sampai 1973 penelitian mengenai genetika mengalami revolusi dalam biologi modern. Suatu metode baru yang dikembangkan sehingga eksperimen eksperimen yang sebelumnya tidak dilakukan lagi. Metode- metode ini disebut teknologi DNA rekombinan atau rekayasa genetik yang inti dari prosesnya adalah kloning gen. Langkah-langkah dasar dalam kloning gen menurut Brown (2010) adalah sebagai berikut Fragmen DNA yang mengandung gen target di insersikan pada vektor kloning sehingga menghasilkan suatu molekul DNA rekombinan. Vektor bertindak sebagai alat transportasi gen kedalam sel inang. Sel inang dapat berupa Skripsi Previta Zeisar Rahmawati Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli Top10 (pET-30a(+)) ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga bakteri, ragi, jamur, tanaman tingkat tinggi, dan sel-sel mamalia. Vektor mengadakan replikasi di dalam sel inang, sehingga menghasilkan banyak kopi atau turunan yang identik dari vektor dan gen yang dibawanya. Ketika sel inang membelah, Kopi molekul DNA rekombinan diwariskan pada progeni dan diikuti replikasi vektor selanjutnya. Sel inang terus melakukan pembelahan sel, hingga terbentuk koloni pada media padat dan dihasilkan klon sel inang yang identik dimana tiap sel dalam satu koloni mengandung satu kopi atau lebih molekul DNA rekombinan. Molekul DNA rekombinan Vektor Fragmen DNA Bakteri Bakteri yang membawa DNA rekombinan 2. Transport kedalam sel host 3. Perbanyakan molekul DNA rekombinan 4. pembelahan sel host 5. pembelahan sel banyak yang menghasilkan klon Koloni bakteri yang tumbuh pada media padat Gambar 2.9. Langkah langkah Dasar dalam Kloning Gen (Brown, 2010) Molekul DNA rekombinan perlu dimasukkan ke dalam suatu sel inang untuk dapat mengekspresikan produk DNA sisipan. Beberapa komponen yang perlu diperhatikan dalam memilih sel inang yang baik untuk pengklonan adalah sebaiknya sel inang memiliki tingkat pertumbuhan yang cepat, dapat tumbuh pada Skripsi Previta Zeisar Rahmawati Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli Top10 (pET-30a(+)) ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga medium kultur, tidak bersifat patogen, dapat ditransformasi oleh DNA dan stabil. Sel inang dalam pengklonan umumnya berupa mikroorganisme, misalnya Escherichia coli, Bacillus subtilis, dan Saccharomyces cerevisiae (Brock et al., 1994). Eksperimen kloning gen pada umumnya dilakukan dalam 5 langkah: (1) generasi fragmen DNA yang cocok untuk kloning. (2) keterkaitan fragmen yang akan di kloning ke vektor plasmid atau genom virus oleh pengobatan DNA fragmen / vektor campuran dengan DNA ligase. (3) pengenalan produk ligasi DNA ke dalam sistem sel inang yang cocok, seperti E.coli, dengan transformasi, transfeksi atau infeksi. (4) diubah pembelotan klon DNA yang mengandung spesies hibrida yang dibutuhkan: dan (5) isolasi dan karakterisasi DNA dari spesies hibrida pada hasil klon (Timmis, 1984). Kloning merupakan suatu dorongan bagi para ilmuan karena dapat melakukan seleksi dan pemurnian suatu gen dalam jumlah besar yang bebas dari kontaminasi oleh urutan DNA lain. Kunci keberhasilan atau kegagalan suatu eksperimen kloning adalah kemampuan melakukan seleksi terhadap gen target yang akan dikloning. Bila suatu gen berhasil diklon, maka tidak akan lagi terdapat kesulitan untuk memperoleh informasi tentang struktur, fungsi, dan ekspresi pada gen tersebut (Brown, 2010). 2.8 Tahapan Kloning Gen 2.8.1 Amplifikasi DNA sisipan Sintesis dan amplifikasi DNA sisipan yang akan diklon kan menggunakan teknik PCR (Polymerase Chain Reaction), Prosedur ini digunakan untuk proses Skripsi Previta Zeisar Rahmawati Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli Top10 (pET-30a(+)) ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga amplifikasi enzimatik secara invitro dari DNA sisipan dengan cara mensintesis DNA tersebut sehingga menghasilkan jumlah salinan dari fragmen DNA dengan jumlah banyak dan spesifik (Ausubel et al, 1995). Proses PCR dibutuhkan sampel DNA yang digunakan sebagai DNA cetakan (template) dan reagen-reagen seperti Taq DNA polymerase, buffer PCR, dNTP, MgCl, ddH2O juga primer forward dan reverse (Huang et al., 2006). Reaksi amplifikasi suatu fragmen DNA diawali dengan denaturasi DNA cetakan sehingga yang awalnya DNA dalam bentuk untai ganda (double stranded) akan mengalami denaturasi menjadi untai tunggal (single stranded). Berikutnya adalah proses annealing pada suhu sekitar 55 °C. Primer akan menempel pada cetakan yang telah terpisah menjadi untai tunggal. Proses dilakukan selama 1-2 menit, kemudian pada proses sintesis DNA, suhu inkubasi dinaikkan menjadi 72 °C selama 90 detik agar terjadi proses polimerisasi untai DNA yang baru berdasarkan informasi dari DNA cetakan. DNA untai ganda yang terbentuk selanjutnya akan didenaturasi lagi dengan menaikkan suhu inkubasi menjadi 95 °C untuk tahap siklus berikutnya (Brown, 2010). 2.8.2 Proses Restriksi DNA Insert dan DNA plasmid Dalam kloning gen tahap yang paling penting adalah proses restriksi molekul DNA dan vektor dengan ukuran yang tepat. Tiap vektor harus dipotong pada posisi tunggal untuk membuka lingkaran sehingga molekul DNA baru dapat diinsersikan. Fitur yang paling penting dari sebuah enzim restriksi adalah bahwa enzim restriksi mampu membelah molekul untai ganda DNA pada suatu pasangan sekuen nukleotida tertentu yang disebut situs restriksi (Russell, 1994). Skripsi Previta Zeisar Rahmawati Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli Top10 (pET-30a(+)) ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga Enzim restriksi dibagi menjadi 3 tipe yaitu berdasarkan komposisi subunit, posisi pemotongan, spesifisitas sekuens dan kofaktor yang diperlukan (Sasnauskas, 2006). Ada dua jenis utama dari enzim restriksi: enzim restriksi tipe I, yang mengenali sekuen tertentu namun memotong di tempat lain, dan enzim restriksi tipe II, dapat memotong hanya dalam situs pengenalan. enzim tipe II adalah kelas yang paling penting. enzim restriksi di semua kelas ini membuat dua potongan untai tunggal, satu potong di masing-masing untai. ada dua pengaturan pemotongan: (1) potongan di pusat simetri (menghasilkan ujung tumpul) atau (2) potongan yang simetris, ditempatkan di sekitar garis simetri (menghasilkan ujungujung kohesif atau ujung lengket) (Freifelder, 1987). Pada proses kloning gen, enzim restriksi endonuklease yang digunakan umumnya adalah tipe II karena dapat memotong DNA pada sisi spesifik, sehingga dihasilkan pola potongan spesifik. Sisi pengenalan enzim restriksi endonuklease tipe II berupa inverted repeats, yaitu sekuen dapat dibaca sama dari arah manapun, atau disebut palindrome (Brown, 2010). 2.8.3 Ligasi antara DNA Insert dengan Plasmid DNA vektor dan DNA target yang telah dipotong dengan menggunakan enzim restriksi, kemudian digabungkan untuk membentuk DNA rekombinan (Snustad and Simmons, 2006). Proses tersebut dinamakan proses ligasi, sebab dilakukan dengan menggunakan enzim DNA ligase. DNA ligase mengkatalisis pembentukan ikatan fosfodiester antara ujung 5' fosfat dan 3'-hidroksil terminal dalam DNA dupleks (Ausubel et al, 1995). Nama enzim biasanya yang di gunakan adalah T4 ligase. Skripsi Previta Zeisar Rahmawati Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli Top10 (pET-30a(+)) ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga T4 ligase ini adalah nama enzim DNA ligase yang lain yang efisien bergabung ujung tumpul Terminal di bawah kondisi reaksi normal. Ligasi ujung lengket yang pada umumnya dilakukan pada suhu 12oC sampai 15oC, sedangkan ligasi ujung tumpul biasanya dilakukan pada suhu kamar (<30oC) dengan 10 sampai 100 kali lebih enzim dari ligasi ujung lengket. T4 DNA ligase dihambat kuat oleh konsentrasi NaCl > 150 mM. (Ausubel et al, 1995). 2.8.4 Transformasi DNA Rekombinan Transformasi DNA rekombinan adalah proses transfer DNA plasmid rekombinan ke dalam sel inang (Mulis, 1990). Syarat utama dalam transformasi DNA rekombinan adalah sel inang harus dibuat kompeten terlebih dahulu. Sel kompeten tersebut yang kemudian dicampur dengan plasmid rekombinan untuk proses transformasi ke dalam sel inang, proses ini yang disebut elektroporasi yaitu mendorong DNA ke dalam sel dengan dialiri arus listrik (Mulis, 1990). Elektroporasi merupakan metode transformasi paling cepat, mudah dan efisien. Efisiensi transformasi diperoleh dapat mencapai 1010 transforman/µg DNA (Sambrook, 1989). Metode transformasi dilakukan dengan kejutan panas (heat shock) yang diawali dengan pemberian CaCl2 untuk menghasilkan sel bakteri yang kompeten, molekul DNA, misalnya plasmid, dimasukkan ke dalam sel kemudian akan bereplikasi di dalam sel. Sel kemudian diinkubasi dalam medium pertumbuhan non-selektif untuk memulihkan kondisi sel (membran sel kembali utuh). Sel bakteri yang umum digunakan dalam proses transformasi DNA rekombinan adalah Escherichia coli (Sambrook &Russell, 2001). Skripsi Previta Zeisar Rahmawati Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli Top10 (pET-30a(+)) ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga 2.8.5 Sekuensing DNA sekuensing DNA adalaah suatu metode yang digunakan untuk membaca urutan basa nukleotida yang terdapat dalam suatu molekul gen. dalam dunia kedokteran manfaat dari sekuensing DNA adalah dapat digunakan untuk mengidentifikasi, mendiagnosis, dan mengembangkan pengobatan penyakit genetik. Dalam sekuensing DNA terdapat dua metode yang sering digunakan, yaitu metode secara enzimatik oleh Fredrick Sanger dan metode Metode kimiawi oleh Maxam - Gilbert (Brown, 2010; Devor, 2005). 1. Metode kimiawi oleh Maxam - Gilbert Metode yang dikembangkan adalah untuk sekuensing DNA untai tunggal dengan mengambil keuntungan dari proses dua langkah katalitik yang melibatkan Piperidina dan dua bahan kimia yang selektif menyerang purin dan pirimidin (Devon, 2005). Selain itu sulfat, dimetil dan piperidina secara selektif akan membelah nukleotida guanin namun dimetil sulfat dan Piperidina di asam formiat akan membelah baik nukleotida guanin maupun adenin. Fragmen DNA untai ganda yang akan ditentukan urutannya mulamula dilabel menggunakan gugus fosfor radioaktif pada ujung 5’ tiap untai. reaksi-reaksi akan di muat pada gel poliakrilamida dengan persentase tinggi dan fragmen diselesaikan oleh elektroforesis. 2. Metode enzimatik oleh Frederick Sanger Rantai pemutusan sekuensing DNA yang didasarkan pada prinsip bahwa molekul DNA untai tunggal yang berbeda panjang dengan hanya satu nukleotida tunggal dapat dipisahkan dari satu lain oleh elektroforesis gel Skripsi Previta Zeisar Rahmawati Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli Top10 (pET-30a(+)) ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga poliakrilamida. Bahan awal untuk percobaan sekuensing terminasi rantai merupakan persiapan molekul DNA untai tunggal yang identik. Langkah pertama adalah untuk penempelan oligonukleotida pendek ke posisi yang sama pada setiap molekul. Langkah kedua adalah sintesis untai reaksi, yang dikatalisis oleh enzim DNA polimerase dan membutuhkan empat trifosfat deoksiribonukleotida (dATP, dCTP, dGTP, dan dTTP) sebagai substrat. (Brown, 2010). Untuk mengetahui urutan DNA hasil analisis, adalah mengidentifikasi dideoksinukleotida diakhir setiap rantai molekulterminasi. Skripsi Previta Zeisar Rahmawati Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli Top10 (pET-30a(+)) ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga BAB III METODE PENELITIAN 3.1 Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Proteomik, Institute Tropical Desease, Universitas Airlangga, Surabaya . Penelitian ini dimulai pada bulan Januari 2012 sampai bulan Juli 2012. 3.2 Sampel Penelitian Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah isolat A dari bakteri asal sistem abdominal rayap tanah yang diperoleh dari A. A. Istri Ratnadewi S,Si. M,Si (Universitas Jember, Indonesia) dan plasmid pET-30a(+) (Novagen). 3.3 Bahan dan Alat Penelitian 3.3.1 Bahan Penelitian Bahan kimia yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: buffer TE, bacto-agar, lisozim, tris Cl, SDS, HCl, EDTA, proteinase K, kloroform, fenol, isoamilalkohol, natrium asetat, etanol absolut, etanol 70%, NaOH, dNTP, Taq DNA polimerase, primer forward xynF, primer reverse xynR, buffer PCR, MgCl2, ddH2O, agarosa, tripton, yeast extract, NaCl, buffer TAE, etidium bromida, DNA purification kit, kanamisin (100µg/mL), enzim restriksi SacI dan XhoI, T4 Ligase, buffer ligasi, NaOH, asam asetat glasial, Glukosa. 26 Skripsi Previta Zeisar Rahmawati Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli Top10 (pET-30a(+)) ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga 3.3.2 Alat Penelitian Alat-alat yang digunakan adalah autoklaf (OSK 6508 Steam pressure apparatus Ogawa Seiki Co., LTD), laminair air flow cabinet (Kottermann 8580), sentrifuga Beckman (tipe TJ-6), timbangan analitik (Mettler Toledo), pH meter (Metro-ohm 744), oven (Memmert, Jerman), rotary shaker, lemari pendingin -20 0 C (Royal Chest Freezer BD195), pipet mikro (Eppendorf), waterbath (sansat type syk-382-M), shaker incubator (Heidolph Polymax 1040), Spektrofotometer UVVIS (Shimadzu UV-1700), Polymerase Chain Reaction (BioRad), UV transluminator, Sequencer (Applied Biosystems) dan alat-alat gelas yang lazim digunakan di laboratorium. Skripsi Previta Zeisar Rahmawati Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli Top10 (pET-30a(+)) ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga 3.4 Diagram alir penelitian bakteri xilanolotik Isolat A Isolasi DNA kromosom Plasmid pET-30a(+) dalam E.coli rekombinan DNA kromosom Isolat A Amplifikasi gen penyandi endo-1,4-βxilanase dengan primer xynF dan xynR + Pemurnian amplikon Isolasi DNA plasmid Plasmid pET30a(+) Gen endo-1,4-β-xilanase Restriksi dengan SacI dan XhoI, dan pemurnian plasmid Restriksi dengan SacI dan XhoI Ligasi Plasmid Rekombinan Transformasi ke E.coli Top10 E.coli Dengan molekul DNA rekombinan (Transforman) Seleksi transforman E.coli Top10 rekombinan Sekuensing Urutan basa nukleotida gen endo-1,4-β-xilanase rekombinan Skripsi Previta Zeisar Rahmawati Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli Top10 (pET-30a(+)) ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga 3.5 Prosedur Penelitian Teknik molekuler ini dilakukan berdasarkan metode dari Smbrook et, al (1989). 3.5.1 Pembuatan Larutan 3.5.1.1 Pembuatan larutan buffer TE 500mM Larutan stok Tris Cl 500 mM sebanyak 50 mL dibuat dengan cara menimbang secara kuantitatif 3,0285 gram tris Cl, diadd kan dalam 50 mL H2O. Dibuat dalam dua pH. Yaitu pH 7,5 dan pH 8. Larutan stok EDTA 500 mM sebanyak 25 mL, ditimbang secara kuantitatif 4,653 gram EDTA, dilarutkan dalam 25 mL H2O, dibuat dalam pH 8 dengan cara menambahkan sedikit demi sedikit larutan NaOH. 3.5.1.2 Pembuatan larutan lisosim Stok lisosim 10 mg/mL ditimbang secara kuantitatif 0.01 gram dimasukkan kedalam tabung Eppendorf 1,5 mL lalu ditambahkan akuades hingga 1 mL 3.5.1.3 Pembuatan larutan STEP 500 µL Ke dalam tabung Eppendorf, ditimbang secara kuantitatif SDS 0,5 % sebanyak 0,0025 gram, ditambahkan Tris Cl 50 mM pH 7,5 sebanyak 50 µL, 400 µL EDTA 0,4 M dan proteinase K dari stok 20 mg/mL diambil 25 µL, semua dicampur dalam tabung Eppendorf dan dihomogenkan. 3.5.1.4 Pembuatan larutan Na-Asetat 3M Di timbang secara kuantitatif 2,4609 gram natrium asetat dan dimasukkan dalam gelas beker lalu diadd kan 10 mL akuades. Skripsi Previta Zeisar Rahmawati Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli Top10 (pET-30a(+)) ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga 3.5.2 Pembuatan Media 3.5.2.1 Pembuatan Media Cair untuk pemeliharaan E.coli Media cair yang digunakan adalah media Luria Bertani. Media ini dibuat dengan melarukan 1% tripton, 1% NaCl, dan 0,5% yeast extract dalam akuades., media cair yang dituangkan kedalam erlenmeyer sebaiknya mengisi 1/5 dari bagian Erlenmeyer. Hal ini dilakukan untuk mencukupi kebutuhan udara pada pertumbuhan bakteri. 3.5.2.2 Pembuatan Media Cair untuk pemeliharaan E.coli (pET-30a(+)) Media cair yang digunakan adalah media Luria Bertani kanamisin. Media ini dibuat dengan melarukan 1% tripton, 1% NaCl, dan 0,5% yeast extract dalam akuades serta 0,5 µL kanamisin, yaitu antibiotik yang digunakan untuk menumbuhkan plasmid pET-30a(+), media cair yang dituangkan kedalam Erlenmeyer sebaiknya mengisi 1/5 dari bagian Erlenmeyer. Hal ini dilakukan untuk mencukupi kebutuhan udara pada pertumbuhan bakteri. 3.5.2.3 Pembuatan Media Padat Media padat yang digunakan merupakan media LB (Luria Bertani) yang digunakan untuk meremajakan koloni Bacillus subtilis. Ditimbang 1 gram bactoagar, 0,5 gram tripton, 0,5 gram NaCl, dan 1 gram yeast extract, kemudian semua bahan di atas dilarutkan dalam 50 mL akuades. Selanjutnya media tersebut dipindahkan ke dalam erlenmeyer dan disterilkan dengan autoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit. Media steril yang masih hangat-hangat kuku dihomogenkan kemudian dituang ke dalam cawan petri sebanyak 20 mL. Media yang telah memadat disimpan dalam lemari pendingin. Skripsi Previta Zeisar Rahmawati Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli Top10 (pET-30a(+)) ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga 3.5.2.4 Pembuatan Media Padat untuk koloni E.coli (pET-30a(+)) Media yang digunakan merupakan media Luria Bertani (LB). Media padat digunakan untuk meremajakan koloni E. coli Top10 yang mengandung pET30a(+). Dibuat media padat 20 mL, ditimbang 0,4 g agar, 0,2 g pepton, 0,2 g NaCl , dan 0,1 g yeast extract, dilarutkan dalam 20 mL aquades, disterilkan dengan autoklaf suhu 1210C selama 15 menit. Media steril yang telah hangathangat kuku ditambah dengan 10 µL kanamisin (100 mg/mL), dihomogenkan kemudian dituang ke dalam cawan petri. 3.5.3 Peremajaan isolat bakteri xilanolitik (isolat A) Proses peremajaan bakteri dimulai dari mengambil biakan isolat A dari kultur sebelumnya. Isolat diambil dengan menggunakan kawat ose. Lalu kawat yang mengandung biakan ini digoreskan pada media padat yang baru. Selanjutnya biakan diinkubasi pada oven dengan suhu 370C selama 18 jam. 3.5.4 Isolasi DNA kromosom isolat A Koloni tunggal isolat A diinokulasikan ke dalam 5 ml media cair dan diinkubasi pada shaker incubator pada suhu 370C dengan kecepatan 150 rpm selama 18 jam. Kemudian sebanyak 5 ml suspensi sel disentrifuge selama 2 menit dengan kecepatan 10.000rpm pada suhu 4oC. Setelah terpisah, supernatan dibuang kemudian pellet sel diresuspensi dengan 250 µl buffer TE (50 mM tris HCl pH 8 dan 50 mM EDTA). Larutan tersebut dibekukan pada suhu -20oC selama 30 menit. kemudian ditambahan 250 µL lisozim 10mg/ml ke dalam sel beku dan dibiarkan mencair pada suhu kamar. Larutan sel yang sudah mencair dimasukkan ke dalam penangas es selama 45 menit. Lalu menambahkan larutan STEP (SDS Skripsi Previta Zeisar Rahmawati Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli Top10 (pET-30a(+)) ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga 1%, Tris Cl, EDTA pH 8, proteinase K) sebanyak 50µL ke dalam suspensi dan dicampur rata. Campuran ini selanjutnya dipanaskan dalam waterbath pada suhu 50oC selama 1 jam sambil sesekali digoyang perlahan. Kemudian ditambahkan 300µL larutan fenol jenuh ke dalam campuran lalu dikocok sampai terbentuk emulsi. Campuran disentrifugasi pada kecepatan 12.000rpm selama 5 menit sampai terpisah dua lapisan. DNA yang diinginkan berada pada lapisan atas. Lapisan atas dipipet secara hati-hati dan dipindahkan ke dalam tabung eppendorf yang steril. Selanjutnya ditambahkan larutan natrium asetat 0,3 M sebanyak 0,1 kali dari volume total hasil pemipetan DNA, lalu dicampur perlahan. Kemudian ditambahkan etanol absolut dingin sebanyak 2 kali volume larutan kemudian tabung dibolak-balik untuk pencampuran. Setelah itu, campuran diinkubasi pada suhu -20oC selama 2 jam sampai semalam. Campuran disentifugasi pada 12000 rpm selama 5 menit, kemudian supernatan dibuang dan pellet dicuci dengan 0,6 ml etanol 70%. Sentrifuge kembali campuran pada 12000 rpm selama 5 menit. Pelet diambil kemudian ditambahkan 30 µL ddH20 3.5.5 Peremajaan E.coli (pET-30a(+)) Proses peremajaan bakteri dimulai dari mengambil koloni E. coli yang mengandung plasmid pET-30a(+) dari kultur sebelumnya. Koloni diambil dengan menggunakan kawat ose. Lalu kawat yang mengandung biakan ini digoreskan pada media padat yang baru. Selanjutnya biakan diinkubasi pada oven dengan suhu 370C selama 16 jam. Skripsi Previta Zeisar Rahmawati Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli Top10 (pET-30a(+)) ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga 3.5.6 Isolasi DNA plasmid pET-30a(+) Koloni tunggal transforman E.coli diinokulasikan ke dalam 5 mL media LB cair yang mengandung 2.5 µL kanamisin dan diinkubasi pada shaker incubator pada suhu 370C dengan kecepatan 150 rpm selama 16 jam. Kemudian sebanyak 5 ml suspensi sel di sentrifugasi selama 2 menit dengan kecepatan 10.000 rpm pada suhu 40C, pellet disuspensi dengan larutan I (Glukosa 50 mM, Tris-Cl 2.5 mM pH 8, Na2EDTA 10 mM pH 8) 100 µL dan dihomogenkan lalu didiamkan 5 menit. Ditambahkan 200 µL larutan II (NaOH 0.2 N 20 µL, SDS 1% 100 µL, aquades steril 880 µL) dan dihomogenkan dengan cara membolak balik tabung Eppendorf, larutan di inkubasi di es selama 15 menit, setelah 15 menit ditambahkan 150 µL larutan III (Kalium asetat 5M, asam asetat glasial, ddH2 O dingin), di inkubasi dalam es selama 10 menit. campuran tersebut disentrifugasi selam 5 menit dengan kecepatan 12.000 rpm suhu 40C, supernatan yang diperoleh dipindah secara perlahan dengan menggunakan pipet kedalam tabung Eppendorf baru yang steril dan ditambahkan campuran fenol : kloroform : isoamil alkohol (25:24:1) 1 kali volume total, dikocok sampai terbentuk emulsi kemudian disentrifugasi lagi 12.000 rpm 2 menit. dihasilkan 3 lapis, fasa paling bawah adalah fasa organik, fasa tengah adalah suatu emulsi putih dan fasa paling atas adalah fasa cair, fasa cair di pindah dengan cara mempipet secara hati-hati kedalam tabung eppendorf baru yang steril, fasa cair tersebut dipekatkan dengan penambahan etanol absolut dingin 2 kali volume total, dan diinkubasi dalam es selama 1 jam. Campuran disentrifugasi 12.000 rpm selama 5 menit, pellet dicuci dengan etanol dingin 70% sentrifugasi lagi dan tabung eppendorf di keringkan Skripsi Previta Zeisar Rahmawati Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli Top10 (pET-30a(+)) ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga dari etanol dengan cara membalikkan tabung dan didiamkan 5 menit. Kemudian pellet dilarutkan dalam 30 µL ddH2O. 3.5.7 Pemurnian DNA plasmid pET-30a(+) Purifikasi DNA plasmid menggunakan Kit QS Aquick Gel Extraction kit 50, Pertama-tama gel agarosa yang mengandung pita DNA plasmid dipotong dengan menggunakan cutter bersih dan dimasukkan dalam tabung Eppendorf, berat total gel dan Eppendorf maksimal 1,3 gram. Pada tabung tersebut ditambahkan buffer QG 3X volume, dan diinkubasi dalam waterbath suhu 500C selama 10 menit yang setiap 5 menit tabung eppendorf dibolak balik untuk penghomogenan larutan. Setelah gel larut dengan sempurna, tabung eppendorf tersebut si spin sebentar dan di pindah kedalam sebanyak 800µL ke kolom QIAquick yang dilengkapi dengan tabung pengumpul lalu disentrifugasi 12.000 rpm selama 1 menit. Air pada tabung pengumpul dibuang dan pada kolom dicuci dengan buffer PE sebanyak 750 µL dan didiamkan selam 30 menit. Lalu disentrifugasi 12.000 rpm 1 menit, air pada tabung pengumpul dibuang dan dilakukan lagi sentrifugasi 12.000 rpm 1 menit. Kemudian ditambah ddH20 30 µL pada kolom, sedangkan tabung pengumpul di ganti dengan tabung eppendorf baru yang steril dan didiamkan 30 menit baru dilakukan sentrifugasi 12.000 rpm selama 1 menit. kemudian mengulangi langkah ini sekali lagi. Larutan yang berada dalam tabung eppendorf disimpan dalam freezer suhu -200C. Skripsi Previta Zeisar Rahmawati Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli Top10 (pET-30a(+)) ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga 3.5.8 Amplifikasi gen penyandi endo-1,4-β-xilanase menggunakan teknik PCR Proses amplifikasi gen penyandi endo-1,4-β-xilanase menggunakan teknik PCR. Komponen reaksi PCR yang digunakan komposisinya adalah 6,5 L ddH2O steril, 1µL MgCl2, 1 L primer xynF (50 pmol), 1L primer xynR (50 pmol) dan 3 L DNA kromosom (hasil isolasi DNA) yang digunakan sebagai template, mastermix 12,5 µl. Total volume PCR sebanyak 25 L. Proses amplifikasi gen endo-1,4-β-xilanase dilakukan pada kondisi denaturasi pada suhu 94oC selama 1 menit, annealing pada variasi suhu 40oC; 48oC; 52,oC; 58 oC selama 1 menit dan extension pada suhu 72oC selama 1 menit dengan jumlah siklus 30 kali. Proses amplifikasi diawali dengan predenaturasi pada suhu 94oC selama 5 menit dan diakhiri dengan post extension yang dilakukan pada suhu 72oC selama 10 menit 3.5.9 Analisis DNA dengan elektroforesis gel agarosa Analisis DNA plasmid menggunakan elektroforesis gel agarosa (1%). Sebelumnya dilakukan persiapan pada perangkat elektroforesis yaitu dengan menambahkan buffer TAE 0,5x sampai gel agarose tercelup. Campuran DNA dan loading dye yang telah homogen kemudian dimasukkan dalam sumur pada gel agarosa. Kemudian perangkat alat elektroforesis tersebut dialiri arus listrik sebesar 80 V dan dibiarkan sampai loading dye berjalan kurang lebih 2/3 gel agarosa. Gel kemudian dipindah dan dilakukan proses staining dengan direndam dalam larutan TAE yang telah diberi 20 µL Etidium Bromida (EtBr) selama 30-45 menit. Kemudian untuk menghilangkan sisa EtBr pada gel dilakukan dengan Skripsi Previta Zeisar Rahmawati Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli Top10 (pET-30a(+)) ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga memasukkan gel kedalam akuades steril. Untuk memvisualisasi DNA yang telah dielektroforesis digunakan sinar UV dan kemudian didokumentasikan dengan kamera polaroid atau menggunakan geldoc. 3.5.10 Pemurnian amplikon Pemurnian DNA kromosom hasil dari PCR menggunakan Kit QS A Quick Gel Extraction kit 50, Pertama-tama gel agarosa yang mengandung pita DNA kromosom dipotong dengan menggunakan cutter bersih dan dimasukkan dalam tabung eppendorf, berat total gel dan eppendorf maksimal 1.3 gram. Pada tabung tersebut ditambahkan buffer QG 3X volume, dan diinkubasi dalam waterbath suhu 500C selama 10 menit yang setiap 5 menit tabung eppendorf dibolak balik untuk penghomogenan larutan. Setelah gel larut dengan sempurna, tabung eppendorf tersebut si spin sebentar dan di pindah kedalam sebanyak 800µL ke kolom QIAquick yang dilengkapi dengan tabung pengumpul lalu disentrifugasi 12.000 rpm selama 1 menit. Air pada tabung pengumpul dibuang dan pada kolom dicuci dengan buffer PE sebanyak 750 µL dan didiamkan selam 30 menit. Lalu disentrifugasi 12.000 rpm 1 menit, air pada tabung pengumpul dibuang dan dilakukan lagi sentrifugasi 12.000 rpm 1 menit. Kemudian ditambah ddH20 30 µL pada kolom, sedangkan tabung pengumpul di ganti dengan tabung eppendorf baru yang steril dan didiamkan 30 menit baru dilakukan sentrifugasi 12.000 rpm selama 1 menit. kemudian mengulangi langkah ini sekali lagi. Larutan yang berada dalam tabung eppendorf disimpan dalam freezer suhu -200C. Skripsi Previta Zeisar Rahmawati Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli Top10 (pET-30a(+)) ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga 3.5.11 Restriksi amplikon dan plasmid pET-30a(+) Amplikon yang telah dimurnikan dan plasmid yang telah di isolasi dilakukan proses restriksi yaitu proses pemotongan DNA oleh enzim restriksi yang digunakan yaitu SacI dan XhoI dan reagen-reagen tertentu. kedalam tabung eppendorf 1.5 mL, DNA plasmid sebanyak 21.7 µL, dicampur dengan 3µL buffer 10X, BSA 0.3 µL, enzim restriksi SacI 2µL dan XhoI 3µL sehingga volume total adalah 30µL. Campuran tersebut di inkubasi dalam waterbath suhu 370C selama 1 jam dan setiap 30 menit di lakukan penghomogenan campuran dengan cara tabung eppendorf dibolak balik secara perlahan. 3.5.12 Ligasi Gen Penyandi endo-1,4-β-xilanase dan Plasmid pET-30a(+) Dimasukkan kedalam tabung Eppendorf baru dan steril ddH2O 7,6 µL, lalu gen penyandi endo-1,4-β-xilanase dan DNA plasmid pET-30a(+) yang telah dipurifikasi dan direstriksi, 3µL DNA plasmid dan 7µL gen penyandi endo-1,4-βxilanase, kemudian ditambahkan buffer ligasi 2µL, spin campuran tersebut dan terakhir ditambahkan T4 ligase 0,4µL. Inkubasi dalam pengangas es yang kemudian ditaruh dalam suhu 4oC selama 18 jam. 3.5.13 Kloning pET-30a(+) rekombinan kedalam E. coli Top10 3.5.13.1 Peremajaan Isolat E. coli Top10 dari Stok Gliserol Proses peremajaan E. coli Top10 dimulai dari mengambil isolat E. coli Top10 dari stok gliserol suhu -80 oC. isolat dalam keadaan beku, diambil dengan menggunakan kawat ose lalu kawat yang mengandung biakan ini digoreskan pada Skripsi Previta Zeisar Rahmawati Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli Top10 (pET-30a(+)) ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga media padat yang baru. Selanjutnya biakan diinkubasi pada oven dengan suhu 370C selama 18 jam. 3.5.13.2 Pembuatan Sel Kompeten E. coli Top10 E.coli Top10 yang telah diremajakan diinokulasikan dalam 4 mL media LB cair overnight (16-18 jam). Diambil 1% dari E.coli yang telah dikulturkan selama 18 jam dan diinokulasikan kedalam media LB cair 50mL diinkubasi pada shaker incubator pada suhu 370C dengan kecepatan 150 rpm selama 2-2,5 jam dengan syarat kultur ditumbuhkan sampai OD600 nm =0,4. Setelah kultur mencapai optical density nya sama dengan 0,4, kultur diletakkan di penangas es selama 10 menit. di ambil dengan menggunakan mikropipet sebanyak 1mL kultur yang telah dingin dan dimasukkan kedalam tabung eppendorf 1,5mL yang baru dan steril. Sentrifugasi 1 menit kecepatan 12000 rpm suhu 4oC, buang supernatannya dan diulangi kembali dengan menambahkan lagi 1mL kultur yang telah dingin kedalam tabung Eppendorf dan di sentrifugasi lalu supernatannya dibuang. Kemudian kultur dilarutkan pada 1mL CaCl2 0,1M. Larutan CaCl2 tersebut harus dalam keadaan dingin dan dihomogenkan dengan cara membolak balikkan tabung. Campuran tersebut diinkubasi dalam es selama 30 menit lalu disentrifugasi selama 1 menit 12000 rpm suhu 4oC supernatannya dibuang. Pellet yang didapat diresuspensikan dengan menggunakan 50 µL larutan CaCl2 0,1M dingin dan fresh. Untuk membuat stok gliserol, larutan sel setelah diberi larutan CaCl2 dingin, ditambahkan 14,5% 50µL gliserol, kemudian dihomogenkan dengan cara membolak balik tabung dan disimpan dalam suhu -80oC Skripsi Previta Zeisar Rahmawati Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli Top10 (pET-30a(+)) ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga 3.5.13.3 Transformasi Plasmid pET-30a(+) ke E.coli Top10 Proses transformasi dilakukan dengan mencampurkan 10 µL hasil ligasi gen penyandi endo-1,4-β-xilanase dan plasmid pET30a(+) ke dalam 100 µL sel kompeten E.coli Top10. Campuran diinkubasi pada suhu 4 °C selama 30 menit. Heat shock dilakukan dengan menginkubasi campuran sel dalam waterbath pada suhu 420C selama 1 menit, kemudian segera dipindah ke icebath selama 2 menit. Tahap selanjutnya adalah penambahan 200 µL media LB cair ke dalam masingmasing campuran sel, selanjutnya diinkubasi dalam shaker incubator suhu 370C selama 1 jam. Tahap terakhir adalah menumbuhkan sel hasil transformasi ke media agar plate yang mengandung kanamisin, yaitu dengan cara memipet 100 µL suspensi sel kemudian disebar ke permukaan media, lalu diinkubasi pada suhu 370C selama 16 jam. Plasmid yang ada dalam sel inang E.coli Top10 ditumbuhkan pada media agar LB (Luria Bertani) yang mengandung kanamisin, karena plasmid pET30a(+) memiliki gen resisten kanamisin sedang inang E.coli Top10 tidak memiliki gen resisten kanamisin. 3.5.14 Seleksi transforman koloni E.coli Top10 pembawa plasmid rekombinan pET-30a(+) Seleksi transforman untuk mendapatkan koloni pembawa plasmid yang mengandung gen endo-1,4-β-xilanase dilakukan dengan restriksi plasmid dengan enzim XhoI. Dari koloni yang tumbuh hasil transformasi produk ligasi antara gen endo-1,4-β-xilanase dan plasmid pET-30a(+) diambil koloni yang tumbuh dan dilakukan isolasi plasmid dengan metode alkali dan dilakukan secara konvensional. Dari hasil isolasi plasmid kemudian dilakukan restriksi dengan Skripsi Previta Zeisar Rahmawati Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli Top10 (pET-30a(+)) ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga enzim XhoI untuk mengetahui adanya gen insert yang telah masuk dalam plasmid pET30a(+) lalu dilakukan analisis dengan elektroforesis gel agarosa. 3.6 Sekuensing dengan metode Sanger Proses sekuensing dilakukan dengan menggunakan alat Applied Biosystems di laboratorium 1st Base dengan menggunakan primer T7 promotor dan T7 terminator. 3.7 Analisis homologi hasil rekombinan dengan gen lain yang telah dipublikasikan dalam database Genbank menggunakan program BLAST Sekuens rekombinan pembawa gen endo-1,4-β-xilanase yang telah didapatkan kemudian dianalisis homologinya dengan gen lain yang juga menyandi gen endo1,4-β-xilanase dengan menggunakan program BLAST. Program ini diakses melalui alamat website yaitu http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ selanjutnya dilakukan langkah-langkah seperti di bawah ini 1. Klik nucleotide blast 2. Dimasukkan hasil sekuens ke dalam kotak yang bertuliskan ”Enter accession number, gi, or FASTA sequence” 3. Pada kotak bertuliskan “Choose Search Set” dipilih “Others (nr etc)” sebagai database. 4. Klik BLAST Setelah melakukan langkah di atas, kemudian ditunggu selama beberapa detik dan hasil analisis homologi akan muncul. Skripsi Previta Zeisar Rahmawati Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli Top10 (pET-30a(+)) ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Isolasi DNA kromosom isolat A Hasil analisis elektroforesis gel agarosa (1%) di dapatkan kadar kemurnian DNA kromosom isolat A yaitu 267,7 ng/µL dan rasio 1,88. Teknik isolasi DNA kromosom isolat A berdasarkan dengan metode pengendapan etanol (Sambrook et al,. 1989). Kultur isolat A yang telah ditumbuhkan pada suhu 370C selama 18 jam disentrifugasi dan mendapatkan pelet sel. Pelet sel kemudian diresuspensi dengan buffer TE dan dilisis. Teknik-teknik pemecahan sel bakteri dilakukan melalui 3 macam metode, (1) cara mekanik atau fisik, yaitu sel dipechkan dengan cara sonikasi, grinding, dan homogenisasi. (2) cara kimiawi yaitu dengan menambahkan senyawa kimia seperti EDTA dan SDS. Dan (3) proses enzimatis menggunakan larutan lizosim atau kitinase (Brown, 2010). Pada penelitian ini proses lisis sel untuk DNA kromosom yaitu dengan metode enzimatis dan kimiawi, yaitu penambahan larutan lisozim yang berfungsi untuk proses lisis membran sel bakteri. Sedangkan proses lisis secara kimiawi menggunakan SDS pada tahapan pemberian larutan STEP yang terdiri atas SDS, tris Cl, EDTA dan proteinase K berfungsi untuk menyempurnakan kerusakan dinding dan membran sel bakteri saat proses lisis secara kimiawi dan enzimatis, selain itu, EDTA ditambahkan untuk menghilangkan ion magnesium yang penting dalam mempertahankan struktur sel dan untuk menghambat enzim- enzim seluler yang dapat merusak DNA (ion Mg2+ merupakan kofaktor penting bagi DNAse yang 41 Skripsi Previta Zeisar Rahmawati Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli Top10 (pET-30a(+)) ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga bisa “memakan” DNA) (Brown, 2010). Penambahan SDS berguna untuk menghilangkan molekul lipid pada membran sehingga menyebabkan kerusakan sel. Kedalam suspensi sel kemudian ditambahkan larutan fenol jenuh yang berfungsi untuk mendenaturasi protein. Larutan fenol jenuh berperan untuk mendenaturasi sehingga terjadi pengendapan protein, sehingga DNA akan larut dalam fasa air atau supernatan yang berada di lapisan atas. DNA selanjutnya diendapkan dengan natrium asetat dan etanol absolut, endapan DNA di larutkan dalam ddH2O. Analisis DNA dilakukan menggunakan elektroforesis gel agarosa (1%). A B 10000 bp 8000 bp 6000 bp 5000 bp 4000 bp 3000 bp Gambar 4.1 Elektroforesis hasil isolasi DNA kromosom. (A) Marker GeneRulerTM 1 kb DNA ladder, (B) Hasil isolasi DNA kromosom 4.2 Isolasi DNA plasmid pET-30a(+) DNA plasmid pET-30a(+) diisolasi dari E.coli dengan menggunakan metode alkali (Sambrook et al,. 1989). Kultur dari E.coli yang membawa plasmid pET-30a(+) yang telah ditumbuhkan pada suhu 370C selama 18 jam dilakukan sentrifugasi untuk didapatkan pellet sel. Pelet sel yang telah didapatkan Skripsi Previta Zeisar Rahmawati Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli Top10 (pET-30a(+)) ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga diresuspensi dengan larutan I atau larutan GTE (Glukosa, Tris-HCl dan EDTA) yang digunakan sebagai agen pengkhelat logam. Proses denaturasi pada plasmid dilakukan pada tahap penambahan larutan 0,2 N NaOH dan 1 % SDS. proses denaturasi ini dinamakan denaturasi alkali, SDS berfungsi untuk merusak membran sel bakteri dengan cara menghancurkan lemak yang terdapat dalam membran sel bakteri, sedangkan NaOH berperan sebagai pemberi suasana basa pada proses denaturasi sehingga pH yang semula normal akan berubah naik menjadi antara 12,0-12,5. Pada saat pH antara 12,0-12,5 ikatan hidrogen pada molekul DNA non-supercoiled atau DNA kromosom dari bakteri akan terdenaturasi dan menyebabkan ikatan double-helix terurai dan kedua rantai polinukleotida memisah sehingga menjadi single-helix sedangkan DNA plasmid tidak mengalami denaturasi (Brown, 2010). Dengan penambahan larutan III atau larutan garam tinggi, yang terdiri atas kalium asetat, asam asetat glasial, dan ddH2O, ekstrak sel mengalami penurunan pH dari basa ke asam sehingga untai DNA kromosom yang telah terdenaturasi akan mengalami renaturasi acak sehingga DNA kromosom akan mengelompok dan beragregasi membentuk suatu emulsi dan diendapkan dengan cara sentrifugasi sehingga DNA kromosom akan mengendap sebagai pellet sedangkan DNA plasmid akan berada pada supernatan dan tidak ikut mengendap. Sedangkan protein dihilangkan dengan cara denaturasi protein pada penambahan campuran fenol : kloroform : isoamil alkohol (25:24:1). Pada proses penambahan campuran fenol : kloroform : isoamil alkohol (25:24:1), DNA plasmid akan larut dalam fasa air atau supernatan yang berada di lapisan atas sedangkan protein akan mengendap. Setelah fasa air dipipet secara hati-hati, Skripsi Previta Zeisar Rahmawati Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli Top10 (pET-30a(+)) ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga larutan DNA plasmid ditambah dengan etanol absolut untuk proses presipitasi DNA. Untuk menganalisis DNA plasmid pET-30a(+) hasil isolasi dilakukan analisis menggunakan elektroforesis gel agarosa (1%). A B 10000 bp 8000 bp 4000 bp 3000 bp 2000 bp 1500 bp Gambar 4.2 Elektroforesis hasil isolasi DNA plasmid pET-30a(+). (A) hasil isolasi DNA plasmid pET-30a(+), (B) Marker GeneRulerTM 1 kb DNA ladder Gambar 4.2 hasil elektroforesis dari DNA plasmid pET-30a(+) menunjukkan adanya 3 pita yang secara topologi merupakan bentuk supercoil, linier dan open circular (Clowes, 1972). Plasmid pET-30a(+) mempunnyai ukuran 5422 bp (Novagen), namun demikian untuk menentukan ukuran pasang basa plasmid ditentukan dengan analisis sekuensing 4.3 Amplifikasi gen penyandi endo-1,4-β-xilanase dengan teknik PCR PCR adalah serangkaian reaksi pada proses penggandaan DNA secara invitro yang dilakukan dalam tabung Eppendorf dengan mencampurkan reagenreagen yang terdiri dari cetakan DNA, primer forward dan primer reverse, Taq Skripsi Previta Zeisar Rahmawati Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli Top10 (pET-30a(+)) ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga DNA polymerase, buffer PCR, dNTP, MgCl2, ddH2O, campuran reaksi ditempatkan pada suatu cycler secara terprogram dengan serangkaian suhu yang bervariasi (Brown, 2010). Cetakan DNA yang digunakan adalah DNA kromosom yang mengandung gen penyandi endo-1,4-β-xilanase yang akan diamplifikasi. Untuk penelitian ini, digunakan master mix yaitu suatu campuran dari dNTP, Taq polymerase dan buffer PCR. dNTP berisi basa-basa nukleotida dan dengan bantuan enzim DNA polymerase basa-basa nukleotida tersebut akan dipolimerisasi sehingga diperoleh DNA target. Dalam teknik PCR diperlukan DNA polimerase yang termostabil seperti Taq polimerase. Taq DNA polimerase memiliki kemampuan resisten terhadap denaturasi oleh panas, sehingga Taq DNA polimerase sesuai untuk proses PCR. Penambahan MgCl2 dalam reaksi PCR berfungsi sebagai kofaktor (Sambrook and Russel, 2001). Salah satu faktor penentu perolehan gen target dalam teknik PCR adalah proses desain primer oligonukleotida. Dalam penelitian ini, primer didesain dengan cara mengambil data basa nukleotida dari gen penyandi endo-1,4-β-xilanase kelompok glikosida hidrolase famili 11 dari Bacillus subtilis yang telah dipublikasikan dalam GenBank melalui website www.CAZy.org. Primer merupakan suatu oligonukleotida yang akan menempel pada cetakan DNA sehingga memungkinkan terjadinya proses amplifikasi. Primer hanya menempel pada daerah tertentu dari DNA sehingga amplifikasi DNA hanya terjadi pada daerah yang dibatasi oleh primer forward dan reverse (Brown, 2010) Suatu primer dalam PCR merupakan kunci utama dari proses PCR. Primer yang Skripsi Previta Zeisar Rahmawati Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli Top10 (pET-30a(+)) ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga didesain dengan benar, akan menghasilkan amplifikasi oleh fragmen DNA tunggal yang sesuai dengan wilayah target molekul cetakan (Brown, 2010). Pada penelitian ini. primer forward yang digunakan didesain berdasarkan dari sekuen primer yang telah berhasil untuk mengamplifikasi gen penyandi xilanase dari Bacillus strain B10 di E.coli (Huang et al,. 2006) yaitu dengan urutan basa sepanjang 39 basa nukleotida dari arah 5’ ke 3’ pada urutan start kodon (ATG). Primer forward yang digunakan memiliki panjang nukleotida 39 basa. Primer reverse yang digunakan adalah yang di desain berdasarkan penelitian skripsi tentang amplifikasi gen penyandi endo xilanase asal isolate 7 bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah oleh Amaliah Labiqah (2012) dengan urutan dari 3’ ke 5’ dengan panjang 23 basa nukleotida dan berakhir di stop kodon (TAA). Primer digunakan dengan menambahkan sisi restriksi dari enzim SacI untuk primer forward pada ujung 5’ dan XhoI untu primer reverse pada ujung 3’ Primer yang digunakan pada penelitian ini yaitu: xynF: 5’- GGGGAGCTCATGTTTAAGTTTAAAAAGAATTTCTTAGTT -3’ xynR: 5’- GCCTCGAGTTACCACACTGTTAC -3’ Pada teknik PCR ada tiga langkah utama, yaitu denaturasi, annealing (penempelan) dan extension (perpanjangan). Proses denaturasi terjadi pada suhu 940C, pada proses ini DNA cetakan mengalami denaturasi dari untai ganda menjadi untai tunggal. Denaturasi DNA terjadi akibat adanya pemanasan yang terjadi pada suhu tinggi sehingga merusak ikatan hidrogen yang menghubungkan antara untai-untai basa nukleotida. Proses denaturasi ini memudahkan primer untuk menempel pada DNA pada proses selanjutnya yaitu annealing. Annealing Skripsi Previta Zeisar Rahmawati Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli Top10 (pET-30a(+)) ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga merupakan proses penempelan primer pada DNA template yang mempunyai pasangan basa yang komplemen dengan primer. Annealing dilakukan pada suhu yang tepat karena jika suhu yang digunakan terlalu rendah maka primer akan menempel ke daerah yang kurang spesifik sehingga dimungkinkan akan terjadi amplifikasi lebih dari satu gen yang diinginkan. Namun, apabila suhu yang digunakan terlalu tinggi kemungkinan pimer tidak akan menempel pada sisi manapun dari cetakan DNA (Dieffenbach et al, 1993) oleh karena itu, dalam proses PCR selalu digunakan variasi suhu saat annealing. Proses terakhir adalah extension dilakukan pada suhu 72oC yang merupakan suhu optimum dari Taq polimerase. Extension merupakan proses perpanjangan untai DNA oleh DNA polimerase dimana perpanjangan rantai ini telah dibatasi oleh kedua buah primer yang menempel. Pada proses ini DNA polimerase berperan sangat penting, yaitu suatu enzim yang bertugas memperpanjang rantai DNA dengan menambahkan basa nukleotida yang berasal dari dNTP. Proses amplifikasi gen endo-1,4-β-xilanase dari isolat A dilakukan dengan memvariasi suhu annealing pada suhu 40oC; 48oC; 52,oC; 58 oC. Variasi suhu dilakukan dengan tujuan untuk menentukan suhu optimal dari primer agar dapat menempel pada DNA template secara sempurna. Dari hasil variasi tersebut, gen penyandi endo-1,4-β-xilanase dari isolat A dapat teramplifikasi dengan suhu annealing 58oC sedangkan pada suhu 40oC; 48oC; 52,oC DNA target tidak teramplifikasi. Amplikon yang didapatkan berasal dari pasangan primer xynF dan xynR dengan ukuran nukleotida sebesar ±600bp yang menunjukkan bahwa ukuran basa nukleotida gen endo-1,4-β-xilanase adalah ±600bp. Skripsi Previta Zeisar Rahmawati Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli Top10 (pET-30a(+)) ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga A B 10000 bp 3000 bp 1000 bp ±600 bp 250 bp Gambar 4.3a Elektroforesis hasil amplifikasi gen penyandi endo-1,4-β-xilanase isolat A dengan primer xynF dan xynR. (A) Marker, (B) hasil amplifikasi xynF dan xynR suhu 58oC Amplikon yang telah diperoleh dari proses PCR, kemudian dimurnikan dengan tujuan untuk menghilangkan sisa-sisa zat dari reagen PCR, sehingga hanya tertinggal DNA saja. Pemurnian DNA dilakukan dengan menggunakan kit pemurnian Gene Clean dari QIAGEN. Berikut adalah hasil elektroforesis hasil pemurnian amplikon A B 10000 bp 3000 bp 1000 bp ±600 bp 250 bp Gambar 4.3b Hasil elektroforesis amplikon yang telah dimurnikan. (A) Marker GeneRulerTM 1 kb DNA ladder, (B) DNA dari larutan amplikon pada suhu 58 oC. Skripsi Previta Zeisar Rahmawati Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli Top10 (pET-30a(+)) ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga 4.4 Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase 4.4.1 Restriksi amplikon dan plasmid pET-30a(+) Pada kloning gen tahap yang paling penting adalah proses restriksi molekul DNA dan vektor dengan ukuran yang tepat. Vektor harus dipotong pada posisi tunggal untuk membuka lingkaran sehingga molekul DNA dapat diinsersikan. Tipe pemotongan pada enzim restriksi sangat berpengaruh dalam kloning gen yang digunakan umumnya adalah tipe II yaitu enzim yang memotong pada tempat yang spesifik pada molekul DNA pada urutan pengenal dan tidak pada tempat lain. Endonuklease restriksi tipe II digunakan dengan alasan karena dapat memotong DNA pada sisi spesifik, sehingga dihasilkan pola potongan spesifik. Enzim restriksi yang digunakan pada penelitian ini adalah SacI dan XhoI dengan model pemotongan yaitu ujung tumpul (sticky end). Amplikon yang telah di purifikasi dan plasmid pET-30a(+) masing-masing di restriksi dengan SacI dan XhoI kemudian untuk menjaga pH pada DNA ketika terjadi proses restriksi agar stabil ditambahkan buffer restriksi. Dalam proses pemotongan DNA, enzim restriksi perlu dilindungi supaya kerja enzim dalam memotong tidak mengalami kesalahan sehingga ditambahkan BSA atau Bovine Albumin Serum yang bertugas sebagai penstabil enzim sehingga kerja enzim restriksi dalam memotong DNA tidak mengalami kesalahan. Campuran tersebut di inkubasi dalam waterbath suhu 370C selama 1 jam. Hasil analisis dilakukan dengan elektroforesis gel agarosa (1%). Skripsi Previta Zeisar Rahmawati Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli Top10 (pET-30a(+)) ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga A B 10000 bp 8000 bp pET- 5000 bp 3000 bp 2000 bp 1500 bp ampliko 500 bp Gambar 4.4 Analisis restriksi amplikon dan plasmid pET-30a(+). (A) Hasil restriksi amplikon dengan enzim SacI dan XhoI (B) Hasil restriksi plasmid pET-30a(+) dengan enzim SacI dan XhoI (C) Marker berdasarkan Gambar 4.6 pada plasmid pET-30a(+) setelah dilakukan restriksi dengan menggunakan enzim SacI dan XhoI, pada analisis gel elektroforesis tidak didapatkan lagi tiga pita seperti semula, melainkan hanya satu pita yang muncul. Hal ini dikarenakan pada plasmid yang berbentuk sirkuler, pada sisi pemotongan plasmid telah dilakukan pemotongan dengan menggunakan enzim SacI dan XhoI sehingga plasmid terbuka dan membentuk linier sehingga plasmid dengan diketahui berapa ukuran yang sebenarnya. Dalam hal ini plasmid pET-30a(+) berukuran 5422 bp. 4.4.2 Ligasi Gen Penyandi endo-1,4-β-xilanase dan Plasmid pET-30a(+) Plasmid pET-30a dan amplikon dari gen penyandi endo-1,4-β-xilanase isolat A yang telah dipotong dengan menggunakan enzim restriksi, kemudian digabungkan untuk membentuk DNA rekombinan, proses ini dinamakan dengan ligasi (Snustad and Simmons, 2006). Proses ligasi menggunakan enzim T4 ligase Skripsi Previta Zeisar Rahmawati Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli Top10 (pET-30a(+)) ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga yaitu suatu enzim yang dapat mengkatalisis ujung 5’-fosfat dan ujung 3’-hidroksil antara plasmid pET-30a dengan gen penyandi endo-1,4-β-xilanase isolat A. Untuk menjaga pH saat proses ligasi ditambahkan buffer ligasi. Sedangkan untuk mengoptimalkan proses ligasi diperlukan inkubasi selama 18 jam dan enzim T4 ligase akan bekerja secara optimal pada suhu 40C. 4.4.3 Transformasi Plasmid pET-30a(+) rekombinan ke E.coli Top10 Dalam menganalisis adanya klon dapat dilakukan setelah DNA plasmid pET-30a(+) rekombinan ditransformasi ke sel E.coli Top10 sebagai inangnya. Sel inang ini merupakan sel inang yang khusus dirancang untuk penggandaan dan penyimpanan plasmid rekombinan. Sel inang E.coli Top10 sebelum dipakai untuk transformasi, terlebih dahulu diperlakukan secara fisik atau kimiawi yaitu dengan penambahan CaCl2, atau garam lain sehingga akan memudahkan untuk masuknya DNA dari luar sel bakteri. Dalam penelitian ini sel Bakteri diperlakukan dengan penambahan larutan CaCl2 yang berfungsi melemahkan dinding sel sehingga memudahkan masuknya plasmid rekombinan ke dalam sel bakteri (Gambar 4.6). Sel-sel yang telah mengalami perlakuan ini disebut sebagai sel kompeten (Brown, 2010). Gambar 4.5 Pengikatan dan pengambilan plasmid oleh sel kompeten dengan larutan CaCl2 ( Brown, 2010) Skripsi Previta Zeisar Rahmawati Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli Top10 (pET-30a(+)) ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga Proses transformasi diawali dengan mencampurkan plasmid rekombinan dengan sel kompeten E.coli Top10 dan ditempatkan dalam wadah es yang bertujuan untuk membuat plasmid berada menempel pada dinding sel kompeten E.coli Top10. Heat shock dilakukan pada suhu 420C selama 1 menit bertujuan untuk membuat kejutan sehingga plasmid rekombinan yang telah menempel pada dinding sel masuk ke dalam sel kompeten E.coli Top10. Campuran langsung dimasukkan ke dalam wadah berisi es segera setelah heat shock. Hal ini bertujuan untuk mencegah plasmid yang sudah masuk ke dalam sel kompeten E.coli Top10 keluar kembali (Brown, 2010). Pada penelitian ini teknik transformasi yang digunakan untuk mentransfer plasmid pET-30a(+) rekombinan ke dalam sel inang E. coli Top10 dengan metode heat shock. Setelah proses heat shock ke dalam sel-sel bakteri tersebut ditambahkan medium LB dan diinkubasi pada suhu 37 °C selama 1 jam kemudian di spreader pada media LB padat yang mengandung kanamisin, karena pEXyl06 merupakan suatu plasmid rekombinan yang memiliki gen resisten terhadap kanamisin sedangkan E.coli Top10 tidak memiliki gen resisten terhadap kanamisin, dan diinkubasi pada suhu 37 °C semalam Skripsi Previta Zeisar Rahmawati Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli Top10 (pET-30a(+)) ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga A B C D Gambar 4.6 Hasil transformasi. (A) kontrol positif (E. coli Top10), (B) kontrol negatif (plasmid pET-30a dalam E. coli Top10), (C) kontrol transformasi restriksi plasmid pET-30a tanpa gen insert dalam E. Coli Top10 (D) E. coli Top10 (pEXyl06) Untuk melihat keberhasilan dari transformasi, dilakukan dengan menggunakan suatu kontrol negatif dan kontrol positif. Sebagai kontrol negatif adalah E. coli Top10 yang hasilnya sama sekali tidak tumbuh koloni pada media LB kanamisin, hal ini dikarenakan pada kontrol negatif hanya terdapat E. coli Top10 yang tidak memiliki plasmid yang resisten terhadap kanamisin. Sedangkan kontrol positif adalah plasmid pET-30a(+) non-insert yang di klon kan kedalam E. coli Top10, hasilnya tumbuh koloni dalam media LB kanamisin, hal ini dikarenakan pada kontrol positif terdapat plasmid pET-30a(+) yang memiliki penanda resisten kanamisin sehingga E. coli Top10 bisa tumbuh. Selain itu juga digunakan kontrol restriksi yaitu plasmid pET-30a(+) yang direstriksi oleh enzim Skripsi Previta Zeisar Rahmawati Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli Top10 (pET-30a(+)) ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga SacI dan XhoI kemudian diklon kan kedalam E.coli Top10 dengan metode heat shock. Kontrol restriksi ini, jika tidak tumbuh koloni pada media LB kanamisin menunjukkan bahwa efisiensi proses restriksi adalah 100 % maka kemungkinan koloni pembawa plasmid tanpa gen insert tidak akan ditemukan dalam hasil transformasi. Tetapi pada kontrol restriksi yang telah dilakukan pada penelitian ini, menunjukkan bahwa ada atau tumbuh koloni pada dalam media LB + kanamisin, hal ini menandakan bahwa koloni pembawa plasmid tanpa gen insert akan ditemukan dalam hasil transformasi. Dan dari plate hasil transformasi yang mengandung E. coli Top10 (pEXyl06) dalam media LB + kanamisin hasilnya tumbuh 20 koloni. 4.4.4 Seleksi transforman E.coli Top10 pembawa plasmid pET-30a(+) rekombinan Suatu rekombinan adalah sel yang telah mengalami transformasi yang mengandung plasmid rekombinan yaitu suatu plasmid yang telah diinsersikan oleh suatu gen target (Brown, 2010). Seleksi transforman dilakukan untuk mengetahui adanya plasmid rekombinan pembawa gen insert dari gen penyandi endo-1,4-β-xilanase dalam plasmid pET-30a(+). Seleksi transforman dilakukan dengan metode restriksi plasmid pET-30a rekombinan secara single digest dengan enzim XhoI. Tahapan awal untuk proses seleksi transforman ini dilakukan isolasi plasmid terhadap semua koloni yang tumbuh pada agar plate. Kemudian hasil isolasi plasmid ini dianalisis dengan elektroforesis gel agarosa. Setelah itu dilakukan proses restriksi dengan menggunakan enzim XhoI. Untuk hasil pembanding, dilakukan juga isolasi plasmid pET-30a(+) yang non-insert Skripsi Previta Zeisar Rahmawati Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli Top10 (pET-30a(+)) ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga kemudian dari hasil isolasi plasmid pET-30a(+) yang non-insert ada sebagian yang dilakukan restriksi secara single degest dengan enzim XhoI dan ada yang tanpa dilakukan restriksi. Setelah itu plasid pET-30a(+) rekombinan dan plasmid pET-30a(+) non-insert dilakukan analisis dengan elektroforesis gel agarosa dan ditempatkan pada satu gel untuk hasil sebagai perbandingan. Jika positif terdapat plasmid pET-30a rekombinan pita yang muncul dalam gel agarosa akan tampak sedikit berada diatas dibandingkan pita pada plasmid pET-30a(+) yang non-insert, jika dilihat dengan menggunakan perbandingan marker DNA, pita pada plasmid pET-30a(+) mempunyai ukuran 5422 bp sedangkan pita pada plasmid pET-30a(+) rekombinan mempunyai ukuran ± 6022 bp. A B C 10000 bp 8000 bp 6000 bp 5000 bp 3000 bp Gambar 4.7 Hasil elektroforesis DNA dari transforman plasmid pembawa pET-30a(+). (A) Plasmid pET-30a uncut, (B) Plasmid pET-30a yang direstriksi dengan enzim XhoI, (C) Marker, (D) DNA plasmid pET-30a rekombinan (pEXyl06) Gambar 4.7 menunjukkan pada lajur (A) yaitu hasil isolasi plasmid pET-30a(+) yang tanpa dilakukan proses restriksi, ini digunakan sebagai kontrol atau pembanding restriksi, pita yang nampak pada hasil gel elektroforesis yaitu terdapat 3 pita dan lajur (B) yaitu plasmid pET-30a(+) yang telah direstriksi Skripsi Previta Zeisar Rahmawati Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli Top10 (pET-30a(+)) ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga dengan menggunakan enzim XhoI, yang dengan tujuan untuk mengetahui ukuran dari plasmid pET-30a(+). Plasmid pET-30a(+) memiliki ukuran sebesar 5422 bp. Sedamgkan pada lajur (D) adalah DNA plasmid pET-30a(+) rekombinan (pEXyl06) yang juga telah direstriksi dengan menggunakan enzim XhoI. Dilihat pada hasil tersebut, pita DNA plasmid pET-30a(+) rekombinan yang muncul dalam gel agarosa tampak sedikit berada diatas dibandingkan pita pada plasmid pET-30a(+) non-insert, jika dilihat dengan menggunakan perbandingan marker DNA, pita pada plasmid pET-30a(+) mempunyai ukuran 5422 bp sedangkan pita pada plasmid pET-30a(+) rekombinan mempunyai ukuran ± 6022 bp. 4.5 Analisis urutan basa nukleotida dan homologi DNA plasmid pET-30a(+) rekombinan pembawa gen penyandi endo-1,4-β-xilanase Urutan basa nukleotida gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah yang terdapat dalam plasmid pET-30a(+) rekombinan dibaca dengan teknik Sekuensing. Pada penelitian ini sekuensing dilakukan dengan menggunakan primer T7 promotor dan T7 terminator, sehingga hasil urutan basa yang didapatkan merupakan seluruh bagian dari gen target dari start kodon (ATG) hingga stop kodon (TAA). Sekuensing dilakukan dengan alat Applied Biosystems 3730XL squenser. Hasil sekuensing DNA plasmid pET-30a(+) rekombinan, menunjukkan ukuran nukleotida dari gen yang didapatkan dengan menggunakan primer T7promoter yaitu didapatkan 1392 bp dan dengan primer T7terminator didapatkan 1455bp. Skripsi Previta Zeisar Rahmawati Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli Top10 (pET-30a(+)) ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga Untuk mencari urutan basa dari gen insert gen penyandi endo-1,4-βxilanase dari hasil sekuensing DNA plasmid pET-30a(+) rekombinan, ada dua tahapan yang dilakukan. Pertama adalah alignment antara sekuens DNA plasmid pET-30a(+) rekombinanan yang telah di sekuensing menggunakan primer T7promoter dengan DNA plasmid pET-30a(+) rekombinan yang telah di sekuensing dengan primer T7terminator. Sehingga didapatkan daerah yang conserve. Skripsi Previta Zeisar Rahmawati Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli Top10 (pET-30a(+)) ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga Gambar 4.8 Alignment hasil sekuensing DNA plasmid pET-30a(+) Rekombinanan Berdasarkan hasil alignment tersebut, daerah yang conserve tersebut masih terdiri dari urutan basa His Tag, basa enzim-enzim restriksi yang terdapat di plasmid pET-30a(+) dan urutan basa gen insert gen penyandi endo-1,4-β-xilanase. langkah kedua untuk mencari gen insert gen penyandi endo-1,4-β-xilanase dari daerah yang conserve tersebut. Dengan mencari letak His Tag coding sequence dan letak urutan basa enzim restriksi yang digunakan dalam penelitian ini yaitu SacI dan XhoI pada hasil sekuensing tersebut, maka di peroleh urutan basa nukleotida gen penyandi endo-1,4-β-xilanase dari hasil sekuensing DNA plasmid pET-30a(+) rekombinan yaitu dengan ukuran sebesar 642bp yang dimulai dari start kodon (ATG) berakhir di stop kodon (TAA). Urutan nukleotida gen penyandi endo-1,4β-xilanase yang terdapat dalam plasmid pET-30a(+) rekombinan adalah sebagai berikut: Skripsi 1 ATGTTTAAGT TTAAAAAGAA TTTCTTAGTT GGATTATCGG CAGCTTTAAT GAGTATTAGC 61 TTGTTTTCGG CAACCGTCTC TGCAGCTAGC ACAGACTACT GGCAAAATTG GACTGATGGG 121 GGCGGTATAG TAAACGCTGT CAATGGGTCT GGCGGGAATT ACAGTGTTAA TTGGTCTAAT 181 ACCGGAAATT TTGCTGTTGG TAAAGGTTGG ACTACAGGTT CGCCATTTAG GACGATAAAC 241 TATAATGCCG GAGTTTGGGC ACCGAATGGC AATGGATATT TAACTTTATA TGGTTGGACG 301 AGATCACCGC TCATAGAATA TTATGTAGTG GATTCATGGG GTACTTATAG ACCTACTGGA 361 ACGTATAAGG GTACTGTAAA AAGTGATGGG GGTACATATG ACATATATAC AACTACACGT 421 TATAACGCAC CTTCCATTGA TGGCGATCGC ACTACTTTTA CGCAGTACTG GAGTGTTCGC Previta Zeisar Rahmawati Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli Top10 (pET-30a(+)) ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga 481 CAGTCGAAGA GACCAACCGG AAGCAACGCT ACAATCACTT TCAGCAATCA TGTGAACGCA 541 TGGAAGAGCC ATGGAATGAA TCTGGGCAGT AATTGGGCTT ACCAAGTCAT GGCGACAGAA 601 GGATATCAAA GTGGTGGAAG TTCTAACGTA ACAGTGTGGT AA Data nukleotida hasil sekuensing tersebut, kemudian dianalisis dengan menggunakan BLAST, yaitu untuk menentukan homologi dengan database gen penyandi endo-1,4-β-xilanase lain yang telah dipublikasikan di GenBank serta untuk memastikan benar atau tidaknya gen insert yang terdapat di DNA plasmid pET-30a(+) rekombinan tersebut adalah gen penyandi endo-1,4-β-xilanase yang diinginkan. Gen penyandi endo-1,4-β-xilanase dianalisis dengan memasukkan urutan basa nukleotidanya ke dalam kotak query yang ada dalam website BLAST. Berdasarkan hasil analisis homologi BLAST, gen penyandi endo-1,4-βxilanase mempunyai tingkat homologi 99% dengan gen endo-1,4-β–xilanase Bacillus subtilis strain MW10, gen xilanase Bacillus subtilis strain R5, dan Bacillus subtilis 168 trpC2. Hal ini menunjukkan bahwa gen insert yang terdapat dalam plasmid pET-30a(+) rekombinan yang didapatkan adalah benar gen penyandi endo-1,4-β-xilanase. Berikut ini adalah tabel hasil analisis dan tingkat homologi gen penyandi endo-1,4-β-xilanase dengan database gen penyandi endo-1,4-β-xilanase lain yang telah dipublikasikan di GenBank: Accession DQ100307.1 M36648.1 Z34519.1 Skripsi Description Bacillus subtilis strain MWO endo-1,4-β-xilanase (xylB) gene, complete cds B.subtilis xylanase gene, complete cds Bacillus subtilis 168 trpC2 xynA Max ident 99% 99% 99% Previta Zeisar Rahmawati Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli Top10 (pET-30a(+)) ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga gene encoding xylanase Bacillus subtilis Xyl gene for xylanase, complete cds, strain: R5 Bacillus subtilis strain ATF-27 xylanase A gene, complete cds Bacillus subtilis strain G1 xylanase gene AB457186.1 JF312739.1 EU848308.1 99% 98% 97% Tabel 4.1 Beberapa gen yang mempunyai homologi yang tinggi dengan gen penyandi endo-1,4-β-xilanase isolat A asal rayap tanah Berikut adalah urutan basa nukleotida yang homolog antara gen penyandi endo1,4-β-xilanase isolat A dan Bacillus subtilis strain MWO endo-1,4-β-xilanase (xylB) gene, complete cds > gb|DQ100307.1| gene, complete cds Length=642 Bacillus subtilis strain MW10 endo-1,4-beta-xylanase (xylB) Score = 1153 bits (624), Expect = 0.0 Identities = 636/642 (99%), Gaps = 0/642 (0%) Strand=Plus/Plus Skripsi Query 1 Sbjct 1 Query 61 Sbjct 61 Query 121 Sbjct 121 Query 181 Sbjct 181 Query 241 Sbjct 241 Query 301 Sbjct 301 Query 361 Sbjct 361 Query 421 Sbjct 421 Query 481 ATGTTTAAGTTTAAAAAGAATTTCTTAGTTGGATTATCGGCAGCTTTAATGAGTATTAGC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATGTTTAAGTTTAAAAAGAATTTCTTAGTTGGATTATCGGCAGCTTTAATGAGTATTAGC 60 TTGTTTTCGGCAACCGTCTCTGCAGCTAGCACAGACTACTGGCAAAATTGGACTGATGGG |||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TTGTTTTCGGCAACCGCCTCTGCAGCTAGCACAGACTACTGGCAAAATTGGACTGATGGG 120 GGCGGTATAGTAAACGCTGTCAATGGGTCTGGCGGGAATTACAGTGTTAATTGGTCTAAT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGCGGTATAGTAAACGCTGTCAATGGGTCTGGCGGGAATTACAGTGTTAATTGGTCTAAT 180 ACCGGAAATTTTGCTGTTGGTAAAGGTTGGACTACAGGTTCGCCATTTAGGACGATAAAC ||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ACCGGAAATTTTGTTGTTGGTAAAGGTTGGACTACAGGTTCGCCATTTAGGACGATAAAC 240 TATAATGCCGGAGTTTGGGCACCGAATGGCAATGGATATTTAACTTTATATGGTTGGACG |||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TATAATGCCGGAGTTTGGGCGCCGAATGGCAATGGATATTTAACTTTATATGGTTGGACG 300 AGATCACCGCTCATAGAATATTATGTAGTGGATTCATGGGGTACTTATAGACCTACTGGA |||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AGATCACCTCTCATAGAATATTATGTAGTGGATTCATGGGGTACTTATAGACCTACTGGA 360 ACGTATAAGGGTACTGTAAAAAGTGATGGGGGTACATATGACATATATACAACTACACGT |||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ACGTATAAAGGTACTGTAAAAAGTGATGGGGGTACATATGACATATATACAACTACACGT 60 120 180 240 300 360 420 420 TATAACGCACCTTCCATTGATGGCGATCGCACTACTTTTACGCAGTACTGGAGTGTTCGC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TATAACGCACCTTCCATTGATGGCGATCGCACTACTTTTACGCAGTACTGGAGTGTTCGC 480 CAGTCGAAGAGACCAACCGGAAGCAACGCTACAATCACTTTCAGCAATCATGTGAACGCA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 540 480 Previta Zeisar Rahmawati Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli Top10 (pET-30a(+)) ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga Sbjct 481 CAGTCGAAGAGACCAACCGGAAGCAACGCTACAATCACTTTCAGCAATCATGTGAACGCA 540 Query 541 600 Sbjct 541 TGGAAGAGCCATGGAATGAATCTGGGCAGTAATTGGGCTTACCAAGTCATGGCGACAGAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TGGAAGAGCCATGGAATGAATCTGGGCAGTAATTGGGCTTACCAAGTCATGGCGACAGAA Query 601 Sbjct 601 GGATATCAAAGTGGTGGAAGTTCTAACGTAACAGTGTGGTAA |||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||| GGATATCAAAGTAGTGGAAGTTCTAACGTAACAGTGTGGTAA 600 642 642 Berdasarkan gen endo-1,4-β-xilanase asal Bacillus subtilis strain MWO, mempunyai ukuran 642 bp, sementara gen endo-1,4-β-xilanase isolat A bakteri xilanolitik asal rayap tanah hasil transformasi dalam E.coli Top10 (pET-30a(+)) juga mempunyai ukuran sebesar 642 bp. Hal ini dikarenakan pada urutan basa nukleotida gen endo-1,4-β-xilanase isolat A dijumpai kodon start (ATG) dan diakhiri dengan stop kodon (TAA), sehingga gen yang didapatkan adalah gen secara utuh dari start hingga stop kodon. Skripsi Previta Zeisar Rahmawati Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli Top10 (pET-30a(+)) ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga BAB V KESIMPULAN DAN SARAN 5.1 Kesimpulan Dari penelitian ini dapat disimpulkan bahwa : 1. Gen penyandi endo-1,4-β-xilanase bakteri xilanolitik isolat A asal sistem abdonminal rayap tanah dapat teramplifikasi dengan ukuran ± 600bp menggunakan teknik PCR dan dapat diklon ke dalam pET-30a(+)/E.coli Top10 dan didapatkan plasmid pET-30a(+) rekombinan (pEXyl06) 2. Dari hasil sekuensing, rekombinan yang diperoleh adalah fragmen gen endo-1,4-β-xilanase yang mempunyai tingkat homologi sebesar 99% terhadap gen endo-1,4-β-xilanase famili 11 dari GenBank. 5.2 Saran Diharapkan penelitian ini dapat diteruskan dengan melakukan ekspresi gen penyandi endo-1,4-β-xilanase sehingga dapat diperoleh enzim endo xilanase rekombinan dan bisa diketahui karakteristik dan aktifitas enzim xilanase yang dihasilkan. Skripsi Previta Zeisar Rahmawati Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli Top10 (pET-30a(+)) ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga DAFTAR PUSTAKA Ahsan, M. M., Kimura, T., Karita, S., Sakka, K., and Ohmiya, K. 1996. Cloning, DNA Sequencing, and Expression of the Gene Encoding Clostridium thermocellum Cellulase CelJ, the Largest Catalytic Component of the Cellulosome. Journal of Bacteriology 178, p. 5732-5740. An Yingfeng, Wu, W,. Lv, A., 2010 A PCR-after-ligation method for cloning of multiple DNA inserts. Analytical Biochemistry 402, p. 203–205 Ausubel, Frederick, M., Brent, Roger., Kingston, Robert, E,. Moore, David, D,. Seidman, J, G,. Smith, John, A,. and Struhl, Kevin,. 1995, Short Protocols in Molecular Biology, Third Edition, John Wiley & Sons Inc., Canada. Brown, T.A. 2010. Gene Cloning and DNA Analysis : An Introduction. 6th Ed., Weley-Blackwell Publishing, United Kingdom Canakci, S., Kacagan, M., Inan, K., Belduz, A. O., and Saha, B. C., 2008, Cloning, purification, and characterization of a thermostable α-Larabinofuranosidase from Anoxybacillus kestanbolensis AC26Sari, J Appl Microbiol Biotechno, Vol. 81, p. 61-68. Clowes, R, C., 1972, Molecular Structure of Bacterial Plasmids, Microbiology and Molecular Biology Reviews, 36(3):361 Devor, E.J., 2005, IDTutorial: DNA Sequencing, Integrated DNA technologies Dieffenbach, C. W., Lowe, T. M., and Dveksler, G. S., 1993, General Concepts for PCR primer Design, Genome Res., Vol. 3, p. S30-S37 Dwijayanthi, I., 2010, Amplifikasi dan Sekuensing Gen Penyandi Endo-1,4-βXilanase Asal Bacillus subtillis PC-01, Skripsi-S1 UNAIR Surabaya. Erlich, H, A, 1992, PCR Technology Principles and Aplications for DNA Amplification, W., H., Freeman and Company, United States of America, Page 13-14 Freifelder, David, 1987, Molecular Biology: Second Edition, Jones and Bartlett publishers, Boston. Gupta, S., Bhushan, B., and Hoondal, G. S. 2000. Isolation, Purification and Characterization of Xylanase from Staphylococcus sp. SG-13 and its Application in Biobleaching of Kraft Pulp. Journal of Applied Microbiology 88 (2, February) : 325–334. Skripsi Previta Zeisar Rahmawati Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli Top10 (pET-30a(+)) ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga Huang, J., Wang, G., Xiao, L., 2006, Cloning, sequencing and expression of the xylanase gene from a Bacillus subtilis strain B10 in Escherichia coli, Journal Bioresource Technology, Vol. 97, p. 802–808. Howard, R. L., Abotsi, E., Jansen van Rensburg E.L., and Howard, S., 2003, Lignocellulose biotechnology: issues of bioconversion and enzyme production, African Journal of Biotechnology, Vol. 2 (12), p. 602-619 Ito, K., Iwashita, K., and Iwano, K. 1992. Cloning and Sequencing of the XynC Gene Encoding Acid Xylanase of Aspergillus kawachii. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, Vol. 56, p. 1338-1340. Jalal, A., Rashid, N., Rasool, N., and Akhtar, M., 2009. Gene cloning and characterization of a xylanase from a newly isolated Bacillus subtilis strain R5. Journal of Bioscience and Bioengineering Vol.107 No.4, p. 360–365. Johnson, T., 1992, Pengenalan Pelajaran Serangga, Edisi keenam, diterjemahkan oleh soetiyono Partosoedjono, Yogyakarta, Gajahmada University Press Kato, K., Kozaki, S., and Sakuranaga, M., 1998, Degradation of lignin compounds by bacteria from termite guts, Journal Biotechnology Letters, Vol. 20, No. 5, p. 459-462. Kulkarni, N., Shendye, A., and Rao, M. 1999. Molecular and Biotechnological Aspects of Xylanases. Federation of European Microbiological Societies Microbiology Reviews 23 p. 411–456 Lehninger, A.L., 1997, Dasar-Dasar Biokimia, Jilid III Penerjemah Maggy Thenawijaya, Penerbit Erlangga, Jakarta. Lee, J.W., Park, J.Y., Kwon, M., and Choi, I.G., 2009, Purification and Characterization of a Thermostable Xylanase from the Brown-Rot Fungus Laetiporus sulpureus, Journal of Bioscience and Bioengineering, VOL. 107 No. 1, 33-37. Meryandini, A., Widhyastuti, N., dan Lestari, Y., 2008, Permurnian dan Karakterisasi Xilanase Streptomyces sp. SKK1-8, Makara, Sains, Vol. 12, No. 2, p. 55-60. Mullis, Skripsi B, Kary., 1990, Recombinant DNA Technology and Molecular Cloning, Scientific American 262:36 Previta Zeisar Rahmawati Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli Top10 (pET-30a(+)) ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga Nandika, D., Adijuwana, H., dan Rizal, E. S. 1995. Karakteristik Saluran Pencernaan Rayap Kayu Kering Cryptotermes cynochepalus Light. (Isoptera : Kalotermitidae). Jurnal Biosains 1 (2, Juli) : 7-10. Pühler, Alfred, and Timmis, Kenneth, N,. 1984, Advanced Molecular Genetics, Springer-Verlag, Berlin Heidelberg Puspaningsih, N.N.T., 2004, Gen Penyandi Xilosidase dari Bacillus thermoleovorans IT-08, Disertasi S3-IPB, Bogor. Russell, Peter, J, 1994, Fundamentals of Genetics, HarperColins Collage Publishers, New York. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Volume 1, Cold Spring Harbor Laboratory Pres, New York. Sambrook, J., Russel, I., 2001, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition, Volume 2, Cold Spring Harbor Laboratory Pres, New York. Sasnauskas G, Connolly BA, Halford SE, Siksnys V. 2007. Site-specific DNA transesterification catalyzed by a restriction enzyme, Proc Natl Acad Sci USA 104(7): 2115-20. Seifert, K., 1962, Holzforschung, Vol 19, p. 105-111 Shallom, D,. and Shoam, Y,. 2003, Microbial Hemicellulase, Journal Ecology and Industrial microbiology, Vol. 6, p. 219-228 Sriyapai, T., Somyoonsap, P., Matsui, K., Kawai, F., and Chansiri, K., 2011, Cloning of a thermostable xylanase from Actinomadura sp. S14 and its expression in Escherichia coli and Pichia pastoris, Journal of Bioscience and Bioengineering, Vol 111, p. 528-536. Stryer L, Tymoczko JL, and Berg JM. 2002. Biochemistry, Edisi ke-5, New York : WH Freeman. Tarumingkeng, R. C. 2001. Biologi dan Perilaku Rayap. Bogor : Program Studi Ilmu Hayati Institut Pertanian Bogor (diakses online dari url http : //tumoutou.net/biologi_&_perilaku_rayap.htm/). Wall, D., 2009, Recombinant DNA, Basic Procedures, Elsevier Inc. All rights reserved University of Wyoming, Laramie, WY, USA Skripsi Previta Zeisar Rahmawati Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli Top10 (pET-30a(+)) ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga Yamani, L.N. 2011. Konstruksi Sekresi Ekstraseluler Dan Peningkatan pH Optimum α-L-Arabinofuranosidase dari Geobacillus thermoleovorans IT 08, penelitian S2-UNAIR, Surabaya. Yuwono, T. 2006. Teori dan Aplikasi Polymerase chain reaction. Andi offset. Yogyakarta Zhang, M,. Jiang, Z,. Yang, S,. Hua, C,. Li, L,. 2010. Cloning and expression of a Paecilomyces thermophila xylanase gene in E.coli and characterization of the recombinant xylanase, Journal Bioresource Technology, Vol. 101, p. 688-695 Zhou, C., Bai J., Deng S., Wang J., Zhu J., Wu, M., Wang, W., 2007, Cloning of Xilanase Gene from Aspergillus usamii anf its Expression in Escherichia coli. Bioresource Technology 99, p. 831–838 Zhou, J., Huang, H., Meng, K., Shi, P., Wang, Y., Luo, H., Yang, P., Bai, Y., and Yao, B., 2010, Cloning of a New Xylanase Gene from Streptomyces sp. TN119 Using a Modified Thermal Asymmetric Interlaced-PCR Specific for GC-Rich Genes and Biochemical Characterization, Journal Appl Biochem Biotechnol, Vol. 160, p. 1277–1292. http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/, tanggal akses 21 Juli 2012 http://www.CAZy.org, tanggal akses 5 september 2011 Skripsi Previta Zeisar Rahmawati Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli Top10 (pET-30a(+))
