1 BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Olah raga
advertisement
1 BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Olah raga merupakan hal yang penting dalam kehidupan kita, karena olah raga dapat mempertahankan dan meningkatkan kesehatan tubuh, serta akan dapat berdampak kepada kinerja fisik tubuh dan dapat juga mencegah terjadinya penuaan dini. Berolah raga secara teratur akan dapat memberi rangsangan kepada semua sistem tubuh sehingga dapat mempertahankan tubuh tetap dalam keadaan sehat. Olah raga juga bertujuan untuk rekreasi dan untuk mencapai suatu prestasi dalam suatu kejuaraan (Adiputra, 2008). Olah raga yang baik adalah olah raga yang dilakukan secara teratur dengan memperhatikan kemampuan tubuh dan sesuai dengan takaran berolah raga (Adiputra, 2008). Kita lihat di lapangan, para atlet sering melakukan pelatihan fisik yang berlebihan untuk mempersiapkan diri dalam menghadapi suatu kejuaraan atau pertandingan dalam waktu yang singkat. Pelatihan fisik yang berlebihan dapat menimbulkan resiko yang tinggi bagi atlet dan mungkin tidak memperoleh hasil yang maksimal sehingga akan dapat menimbulkan cedera bagi atlet tersebut. Pelatihan fisik yang berlebihan ini terjadi akibat dari tipe pelatihan yang terlalu berat, intensitas pelatihan yang terlalu banyak, durasi pelatihan yang terlalu panjang dan frekuensi pelatihan yang terlalu sering (Hatfield, 2001). Dampak dari pelatihan fisik yang berlebihan adalah adanya ketidakseimbangan antara pelatihan fisik dengan waktu pemulihan. Pelatihan fisik yang berlebihan dapat berefek buruk pada kondisi homeostasis dalam tubuh, yang akhirnya berpengaruh juga terhadap sistem kerja organ tubuh (Adiputra, 2008). Pelatihan fisik memulai respon fisiologis dan biokimia yang kompleks. Setiap gerakan otot yang cepat dimulai dengan metabolisme anaerobik. Tenaganya berasal dari pemecahan Adenosin Triphosphate (ATP) dengan hasil Adenosin Diphosphate (ADP) dan berlangsung di mitokondria. Pelepasan energi disertai dengan meningkatnya aliran elektron dalam rangkaian respirasi mitokondria sehingga terbentuk oksigen reaktif superoksida (O2-), hydrogen peroksida (H2O2) 1 2 dan upaya pembentukan ATP. Pelatihan cenderung mengosongkan ATP dan meningkatkan jumlah ADP yang tentunya hal itu merangsang ADP katabolisme dan konversi Xanthine dehydrogenase menjadi Xanthene oxidase. Xanthene oxidase inilah akan membentuk radikal bebas (O2-). Terbentuknya radikal bebas menyebabkan ketidakseimbangan yang disebut sebagai stress oksidatif dengan hasil akhir rusaknya lemak, protein dan Deoxyribo Nucleic Acid (DNA). Berolahraga dengan dosis yang tidak tepat akan menyebabkan radikal bebas bertambah (Adiputra, 2008). Olah raga dengan intesitas tinggi dan durasi lama terbukti dapat menimbulkan kerusakan sel (Sutarina & Edward, 2004). Penelitian yang dilakukan pada tikus yang diberikan beban kerja aktivitas fisik (swimming stress) dengan beban ekor 2% dari berat badan tikus menunjukkan adanya peningkatan kadar Malondialdehide (MDA) yang bermakna dibandingkan dengan kelompok kontrol (Maslachah, 2008). Penelitian pada tikus yang direnangkan, dengan waktu 8 jam/hari dengan lamanya renang 30 menit diikuti 10 menit istirahat selama 28 hari didapatkan radikal bebas pada kelompok perlakuan 235,27 nmol/mg jaringan, sedangkan pada kelompok tanpa perlakuan 196,79 nmol/mg jaringan (Misra et al. 2005). Pelatihan fisik yang berlebihan dapat menyebabkan terjadinya penurunan jumlah dan motilitas spermatozoa (Binekada, 2002; Manna et al. 2007). Penelitian tentang pelatihan fisik yang berlebihan (stres fisik) dengan penurunan kualitas spermatozoa menunjukkan bahwa terjadi peningkatan Reactive Oxygen Species 3 (ROS) dalam seminal plasma dan penurunan perlindungan oleh antioksidan (Tremellen, 2008). Sitoplasma sel spermatogenik mengandung sejumlah kecil scavenging enzyme, namun enzim antioksidan intrasel ini pun tidak mampu melindungi membran plasma yang melingkupi akrosom dan ekor dari serangan radikal bebas. Pada latihan fisik yang berlebihan jumlah antioksidan intrasel tidak mampu menetralisir radikal bebas, akibatnya muncul stres oksidatif. Stres oksidatif dapat menyebabkan kerusakan jaringan testis terutama tubulus seminiferus (Safarinejad et al. 2009). Radikal bebas adalah sekelompok bahan kimia baik berupa atom maupun molekul yang memiliki elektron tidak berpasangan pada lapisan luarnya (Droge, 2002). Adanya elektron yang tidak berpasangan menyebabkan senyawa tersebut sangat reaktif mencari pasangan, dengan cara menyerang dan mengikat elektron molekul yang berada di sekitarnya, dan bila senyawa ini bertemu dengan radikal baru akan terbentuk radikal baru lagi dan seterusnya sehingga akan terjadi reaksi berantai (chain reaction). Radikal bebas yang banyak terbentuk di dalam tubuh, dapat menimbulkan kerusakan secara biomolekul yang berdampak pula pada kerusakan struktur dan fungsi sel, yang akhirnya menimbulkan gangguan pada sistem kerja organ secara keseluruhan (Winarsi, 2007). Radikal bebas dapat menyebabkan gangguan sistem reproduksi manusia. Adanya radikal bebas dapat menyebabkan gangguan pada spermatozoa sebesar 30-80% dari kasus infertil (Tremellen, 2008). Radikal bebas ini akan menimbulkan gangguan pada spermatogenesis dan membran spermatozoa 4 sehingga menurunkan motilitas spermatozoa dan kemampuan untuk menembus sel telur (ovum). Gangguan membran sel ini disebabkan karena membran sel merupakan salah satu target utama kerusakan atau cedera sel yang diakibatkan oleh berbagai stimuli dari luar termasuk radikal bebas (Sutarina & Edward, 2004). Membran sel spermatogenik mengandung sejumlah besar asam lemak tak jenuh rantai panjang (PUFA) sehingga rentan terhadap peroksidasi lipid (Astuti, 2009). Radikal bebas juga dapat menyebabkan kerusakan DNA spermatozoa khususnya pada integritas DNA pada inti selanjutnya dapat menimbulkan kematian sel (Tremellen, 2008; Aitken & Krausz, 2001). Antioksidan baik endogen maupun eksogen sangat penting bagi fungsi tubuh, karena antioksidan tersebut mampu meredam dampak negatif oksidan dalam tubuh. Antioksidan endogen misalnya enzim superoksida dismutase (SOD), katalase, dan glutation peroksidase (GSH-Px), sedangkan antioksidan eksogen misalnya vitamin E, vitamin C, β-karoten, flavonoid, asam urat, bilirubin dan albumin. Pemanfaatan senyawa antioksidan eksogen secara efektif sangat diperlukan untuk mencegah terjadinya stres oksidatif. Antioksidan eksogen merupakan sistem pertahanan preventif, dimana sistem kerja antioksidan ini adalah dengan memotong reaksi oksidasi berantai dari radikal bebas atau dengan cara menangkapnya (Winarsi, 2007). Βeta karoten merupakan suatu antioksidan pemutus rantai, bersifat lipofilik yang dapat berperan pada membran sel spermatozoa untuk mencegah peroksidasi lipid (LPO). Penelitian pada kelinci didapatkan bahwa beta karoten dapat meningkatkan sistem reproduksi kelinci betina dan dapat mendukung terjadinya 5 fertilisasi (Ragip et al. 2002). Penambahan beta karoten pada medium EBSS dapat meningkatkan motilitas dan viabilitas spermatozoa sehingga dapat mendukung penatalaksanaan infertilitas pria pada Teknik Reproduksi Bantu (Karyadi, 2003). Belum banyak dilakukan penelitian tentang pemberian beta karoten terhadap proses spermatogenesis. Berdasarkan latar belakang di atas, maka penulis ingin membuktikan bahwa beta karoten dapat mencegah gangguan spermatogenesis oleh radikal bebas yang terbentuk karena pelatihan fisik yang berlebih. 1.2 Rumusan Masalah Berdasarkan uraian pada latar belakang masalah, dapat dirumuskan permasalahan sebagai berikut: 1. Apakah beta karoten per oral sebagai antioksidan dapat mempertahankan jumlah sel-sel Spermatogonium A pada tubulus seminiferus mencit setelah menerima pelatihan fisik berlebih? 2. Apakah beta karoten per oral sebagai antioksidan dapat mempertahankan jumlah sel-sel Spermatosit Pakiten pada tubulus seminiferus mencit setelah menerima pelatihan fisik berlebih? 3. Apakah beta karoten per oral sebagai antioksidan dapat mempertahankan jumlah sel-sel Spermatid 7 pada tubulus seminiferus mencit setelah menerima pelatihan fisik berlebih? 6 4. Apakah beta karoten per oral sebagai antioksidan dapat mempertahankan jumlah sel-sel Spermatid 16 pada tubulus seminiferus mencit setelah menerima pelatihan fisik berlebih? 5. Apakah beta karoten per oral sebagai antioksidan dapat mempertahankan kualitas struktur tubulus seminiferus mencit setelah menerima pelatihan fisik berlebih? 1.3 Tujuan Penelitian 1.3.1 Tujuan Umum Untuk mengetahui pemberian beta karoten per oral sebagai antioksidan dapat mencegah gangguan spermatogenesis pada mencit yang menerima pelatihan fisik berlebih. 1.3.2 Tujuan Khusus 1.3.2.1 Mengetahui jumlah sel-sel Spermatogonium A pada tubulus seminiferus mencit yang diberi beta karoten per oral sebelum mendapat pelatihan fisik berlebih. 1.3.2.2 Mengetahui jumlah sel-sel Spermatosit Pakiten pada tubulus seminiferus mencit yang diberi beta karoten per oral sebelum mendapat pelatihan fisik berlebih. 1.3.2.3 Mengetahui jumlah sel-sel Spermatid 7 pada tubulus seminiferus mencit yang diberi beta karoten per oral sebelum mendapat pelatihan fisik berlebih. 7 1.3.2.4 Mengetahui jumlah sel-sel Spermatid 16 pada tubulus seminiferus mencit yang diberi beta karoten per oral sebelum mendapat pelatihan fisik berlebih. 1.3.2.5 Mengetahui kualitas struktur tubulus seminiferus mencit yang diberi beta karoten per oral sebelum mendapat pelatihan fisik berlebih. 1.3.2.6 Mengetahui pemberian beta karoten 0,2 mg per oral lebih dapat mempertahankan jumlah sel-sel spermatogenik dan kualitas tubulus seminiferus dibandingkan dengan pemberian beta karoten 0,1 mg per oral pada mencit setelah menerima pelatihan fisik berlebih. 1.4 Manfaat Penelitian 1.4.1 Manfaat Teoritis Menambah wawasan bagi ilmu pengetahuan mengenai peranan beta karoten sebagai antioksidan dalam mencegah hambatan spermatogenesis pada mencit yang mendapat pelatihan fisik berlebih. 1.4.2 Manfaat Praktis Menawarkan beta karoten sebagai antioksidan kepada masyarakat untuk mengatasi keadaan stres fisik akibat pelatihan fisik yang berlebih. 8 BAB II KAJIAN PUSTAKA 2.1 Pelatihan Fisik Berlebih Berolah raga yang dilakukan secara teratur dengan dosis pelatihan yang tepat dapat mencapai dan mempertahankan keadaan sehat dan kebugaran fisik. Kondisi lingkungan yang memadai dan dosis/takaran pelatihan yang tepat untuk 9 setiap individu, meliputi frekuensi, intensitas, tipe dan waktu sangat mendukung untuk mendapatkan hasil yang maksimal dan resiko yang minimal pada pelatihan olah raga. Frekuensi pelatihan yang dianjurkan 3 sampai 4 kali seminggu, dengan intensitas 72-87% dari denyut jantung maksimal (220-umur) dengan variasi 10 denyut per menit. Tipe pelatihan yang dianjurkan merupakan suatu kombinasi dari latihan aerobik dan pelatihan otot dalam waktu 30-60 menit, yang mana sebelumnya didahului oleh 15 menit pemanasan dan disusul oleh 10 menit pendinginan (Pangkahila, 2009). Pelatihan berlebih sering akibat dari tipe pelatihan yang terlalu berat, intensitas pelatihan yang terlalu banyak, durasi pelatihan terlalu panjang dan frekuensi pelatihan yang terlalu sering (Hatfield, 2001). Sumber energi yang digunakan pada aktifitas fisik maupun pelatihan daya tahan tinggi diperoleh dari glikogen otot dan proses glukogenesis untuk menghasilkan ATP. ATP yang tersedia dalam jaringan otot terbatas, kebutuhan ATP dipertahankan oleh creatinin phosphate (CP) dan glikogen yang tersimpan dalam otot (Hernawati, 2009). Ada tiga jalur yang dapat memasok ATP tambahan sesuai kebutuhan selama kontraksi otot meliputi: 1) Pemindahan fosfat berenergi tinggi dari kretainin fosfat ke ADP; 2) fosforilasi oksidatif (siklus asam sitrat dari sistem transportasi elektron); dan 3) glikolisis (Sherwood, 2001). Hidrolisis 1 mol ATP akan menghasilkan energi sebesar 31 kJ (7.3 kkal) serta akan menghasilkan produk lain berupa ADP (adenosinediphospate) dan Pi 9 (inorganik fosfat). Kegiatan olahraga dengan aktivitas aerobik yang dominan, metabolisme energi akan berjalan melalui pembakaran simpanan karbohidrat, lemak dan sebagian kecil (±5%) dari pemecahan simpanan protein yang terdapat di dalam tubuh untuk menghasilkan ATP (adenosine triphospate). Aktivitas yang bersifat anaerobik, energi yang akan digunakan oleh tubuh untuk melakukan aktivitas yang membutuhkan energi secara cepat ini akan diperoleh melalui 10 hidrolisis phosphocreatine (PCr) serta melalui glikolisis glukosa secara anaerobik. Proses metabolisme energi secara anaerobik ini dapat berjalan tanpa kehadiran oksigen (O2). Metabolisme anaerobik dapat menghasilkan produk sampingan berupa asam laktat, yang apabila terakumulasi dapat menghambat kontraksi otot dan menyebabkan rasa nyeri pada otot yang pada akhirnya dapat menyebabkan stres fisik dengan gejala gerakan-gerakan bertenaga saat berolahraga tidak dapat dilakukan secara kontinu dalam waktu yang panjang dan harus diselingi dengan interval istirahat (Hernawati, 2009). Pelatihan fisik berlebih juga akan dapat menimbulkan gangguan pada fungsi endokrin, seperti peningkatan kadar kortisol dan penurunan kadar testosteron (Maffetone, 2007). Pada pelatihan fisik berlebih terjadi peningkatan sekeresi ACTH dan penurunan kadar LH plasma. Setelah pelatihan fisik berlebih, corticotropin releasing hormon (CHR) menginduksi pelepasan ACTH dan β endorphin. Peningkatan β endorphin dapat menghambat pelepasan gonadotropin (sekresi LH) (Safanirejad, et.al., 2009). Penurunan sekresi LH dapat menyebabkan terjadinya penurunan hormon testosteron yang diproduksi oleh sel Leydig (Colon, 2007) 2.2 Pembentukan Radikal Bebas akibat Pelatihan Fisik Berlebih Radikal bebas (free radical) adalah suatu senyawa atau molekul yang mengandung satu atau lebih elektron tidak berpasangan pada orbita luarnya. Ada elektron yang tidak berpasangan menyebabkan senyawa tersebut sangat reaktif 11 mencari pasangan, dengan cara menyerang dan mengikat elektron molekul yang berada di sekitarnya (Winarsi, 2007). Tubuh mengandung molekul oksigen yang stabil dan yang tidak stabil. Molekul oksigen yang stabil sangat penting untuk memelihara kehidupan sel. Sejumlah tertentu radikal bebas diperlukan untuk kesehatan, tetapi radikal bebas bersifat merusak dan sangat berbahaya. Fungsi radikal bebas dalam tubuh adalah melawan radang, membunuh bakteri dan mengatur tonus otot polos dalam organ dan pembuluh darah (Giriwijoyo, 2004) Radikal bebas menyebabkan kerusakan sel dengan tiga cara yaitu (Kumar et al. 2005; Eberhardt, 2001): 1. Peroksidasi komponen lipid dari membran sel dan sitosol, yang menyebabkan serangkaian reduksi asam lemak (otokatalisis) yang berakibat kerusakan membran dan organel sel. 2. Kerusakan DNA, yang berakibat mutasi DNA bahkan kematian sel. 3. Modifikasi protein teroksidasi oleh karena terbentuknya cross linking protein, melalui mediator sulfidril atas beberapa asam amino labil seperti sistein, metionin, lisin dan histidin. Bila radikal bebas yang terbentuk bertemu dengan asam lemak tak jenuh ganda dalam membran sel, akan terjadi reaksi peroksidasi lipid dari membran sel tersebut yang mengakibatkan peningkatan fluiditas membran, gangguan integritas membran dan inaktifasi ikatan membran dengan enzim dan reseptor. Tahap akhir reaksi akan dibebaskan aldehid seperti malodialdehyde, pentane, etana dan conjugated diane yang juga bersifat merusak tubuh (Murray et al. 2000). 12 Pelatihan fisik memulai respon fisiologis dan biokimia yang kompleks. Setiap gerakan otot yang cepat dimulai dengan metabolisme anaerobik. Tenaganya berasal dari pemecahan ATP dengan hasil ADP atau AMP dan berlangsung di mitokondria. Pelepasan energi disertai dengan meningkatnya aliran elektron dalam rangkaian respirasi mitokondria sehingga pembentukan oksigen reaktif (O2-) dan H2O2 dan upaya pembentukan ATP. Pelatihan cenderung mengosongkan ATP dan meningkatkan jumlah ADP yang tentunya akan merangsang ADP katabolisme dan konversi Xanthine dehydrogenase menjadi Xanthene oxidase. Xanthene oxidase inilah akan membentuk radikal bebas (O2-). Terbentuknya radikal bebas akan menyebabkan ketidakseimbangan yang disebut sebagai stress oksidatif dengan hasil akhir rusaknya lemak, protein dan DNA. Berolahraga dengan dosis yang berlebih akan menyebabkan radikal bebas bertambah (Adiputra, 2008). 2.3 Antioksidan Pengertian secara kimia, senyawa antioksidan adalah senyawa pemberi elektron (electron donors). Pengertian antioksidan secara biologis adalah senyawa yang mampu menangkal dan meredam dampak negatif oksidan dalam tubuh. Antioksidan bekerja dengan cara mendonorkan satu elektronnya kepada senyawa yang bersifat oksidan sehingga aktivitas senyawa oksidan tersebut bisa terhambat (Winarsi, 2007). Keseimbangan oksidan dan antioksidan sangat penting karena berkaitan dengan sistem tubuh, terutama untuk menjaga integritas dan berfungsinya membran lipid, protein sel dan asam nukleat. Komponen terbesar yang menyusun 13 membran sel adalah senyawa asam lemak tak jenuh yang diketahui sangat sensitif terhadap perubahan keseimbangan oksidan dan antioksidan. Penyebab utama kerusakan oksidatif di dalam tubuh adalah senyawa oksidan. Kerusakan oksidatif terjadi akibat rendahnya antioksidan dalam tubuh sehingga tidak dapat mengimbangi reaktivitas senyawa oksidan. Berdasarkan mekanisme kerjanya antioksidan digolongkan menjadi 3 kelompok yaitu antioksidan primer, sekunder dan tersier. Antioksidan primer meliputi enzim superoksida dismutase (SOD), katalase dan glutation peroksidase (GSH-Px). Antioksidan primer bekerja dengan cara mencegah pembentukan senyawa radikal bebas yang telah terbentuk menjadi molekul yang kurang aktif. Antioksidan sekunder merupakan antioksidan eksogenous atau non enzimatis (Winarsi, 2007). Menurut Soewoto (2001), antioksidan sekunder meliputi vitamin E, vitamin C, beta karoten, flavonoid, asam urat, bilirubin dan albumin. Antioksidan sekunder ini bekerja dengan cara memotong reaksi oksidasi berantai dari radikal bebas atau dengan cara menangkapnya. Akibatnya radikal bebas tidak beraksi dengan komponen seluler (Winarsi, 2007). Kelompok antioksidan tertier meliputi sistem enzim DNA-repair dan metioin sulfoksida reduktase, dimana enzim-enzim ini berfungsi dalam perbaikan biomolekuler yang rusak akibat reaktivitas radikal bebas. Aktivitas fisik yang berlebihan, memerlukan antioksidan lebih banyak. Penggunaan antioksidan vitamin E 600 mg, vitamin C 1000 mg dan beta karoten 30 mg selama 6 bulan dapat menurunkan radikal bebas sebesar 17-36% (Giriwijoyo, 2004). 14 2.4 Beta Karoten sebagai Antioksidan Beta karoten merupakan salah satu dari 600 komponen karotenoid yang banyak ditemukan dalam tanaman (Winarsi, 2007). Karotenoid adalah suatu substrat pigmen kuning sampai merah yang terdapat pada tumbuh-tumbuhan. Lima puluh di antaranya potensial dapat menjadi vitamin A yang kemudian dinamakan karotenoid pro vitamin A. Beta karoten memiliki struktur dasar berupa satuan isoprene (Mayes (b), 2002). Beberapa isoprene ini bergandengan ujung dengan ujung membentuk rantai konyugasi sebagaimana membentuk struktur karotenoid umumnya. Beta karoten terdiri dari 8 unit isoprene yang melingkar pada ujung-ujungnya dan terlihat seperti di bawah ini: Gambar 2.1. Rumus Bangun Beta Karoten Sumber : Mayes (b), 2002 Beta karoten membentuk 2 molekul vitamin A. Di dalam tubuh manusia, hanya sebagian saja beta karoten yang dikonversi menjadi vitamin A dan sisanya disimpan sebagai cadangan (Mayes(b), 2002). Proporsi beta karoten yang dikonversi dikontrol oleh kadar/status vitamin A, sehingga tidak sampai menjadi hipervitaminosis vitamin A. Beta karoten memainkan peranan biologis yang penting walaupun dalam status sebagai provitamin. Penyerapan vitamin beta 15 karoten ke dalam tubuh manusia memerlukan garam empedu melalui usus halus bagian atas. Sebagian beta karoten dikonversi menjadi vitamin A di dinding mukosa usus. Absorpsi beta karoten sangat cepat, dengan watu penyerapan maximum dapat terjadi 2 samapi 6 jam setelah makanan masuk dalam pencernaan. Sisa beta karoten disimpan dalam jaringan lemak sehingga terlihat berwarna kekuningan. Beta karoten dijual dalam bentuk kapsul gelatin keras dan lembut, dalam tablet multivitamin dan formula vitamin antioksidan di pasaran (Roche, 2000). Beta karoten memiliki aktivitas biologis sebagai antioksidan dengan menetralisir radikal bebas yang timbul dari reaksi normal biokimia tertentu ataupun dari sumber eksogen seperti polusi udara, asap rokok, pelatihan fisik berlebih, dll. Beta karoten juga dapat meredam singlet oxygene, suatu molekul yang reaktif yang terbentuk dari pajanan sinar ultraviolet pada kulit, sehingga dapat mencegah berkembangnya menjadi sel kanker. Singlet oxygene seperti radikal bebas lainnya dapat memicu pembentukan rantai reaksi radikal bebas selanjutnya (Roche, 2000). Penelitian yang dilakukan oleh Ronal menunjukkan bahwa pemberian beta karoten 30-60 mg/hari selama 2 bulan pada pria dan wanita umur 50 tahun dapat meningkatkan sistem kekebalan tubuh seperti meningkatnya sel limposit yang lebih aktif sehingga dapat melindungi tubuh terhadap kanker, infeksi virus dan bakteri (Atmosukarto & Rahmawati, 2003). Beta karoten ini juga dapat meredam singlet oxygene dan mengurangi perubahan lemak menjadi radikal bebas dengan jalan merusak lipid peroksidase pada sperma. Penelitian-penelitian di laboratorium melaporkan bahwa efek beta 16 karoten sinergis dengan efek vitamin E dan vitamin C. Suplemen beta karoten juga dapat meningkatkan imun dan integritas kulit (Roche, 2000). 2.5 Peranan Beta Karoten dalam Spermatogenesis Beta karoten adalah suatu antioksidan pemutus rantai, bersifat lipofilik sehingga berperan pada membran sel termasuk sel spermatozoa untuk mencegah peroksidasi lipid (LPO). Peroksidasi lipid adalah reaksi rantai yang timbul oleh radikal hidroksil terhadap asam lemak tak jenuh dari fosfolipid dan glikolipid yang menyusun membran sel. Radikal bebas hidroksil adalah suatu oksidan kuat yang terbentuk dari proses biologis alamiah yang berturut-turut, pertama terbentuk hydrogen peroksida (H2O2) terutama terbentuk karena aktivitas enzim-enzim oksidase yang terdapat dalam retikulum endoplasma dan periksisom (Mayes(a), 2002). Enzim-enzim tersebut mengkatalis terbentuknya hydrogen peroksida ini kemudian terbentuk radikal hidroksil (•OH). H2O2 merupakan oksidan yang kuat dan dapat mengoksidasi berbagai senyawa yang terdapat dalam sel. Daya rusak H2O2 bukan hanya karena senyawa tersebut merupakan oksidan yang kuat, tetapi juga karena menghasilkan radikal hidroksil bila bereaksi dengan logam transisi Fe++ dan Cu+ yang disebut reaksi Fenton. Radikal hidroksil juga terbentuk dari H2O2 dengan ion superoksida yang dikenal dengan reaksi Haber-Weiss (Mayes(a) & (b),2002; Winarsi,2007). Radikal hidroksil adalah yang paling reaktif di antara senyawa-senyawa oksigen reaktif, bila dengan asam lemak tak jenuh dapat menimbulkan reaksi 17 berantai yang dikenal dengan peroksidasi lipid. Akibat reaksi berantai ini adalah terputusnya rantai asam lemak menjadi berbagai senyawa yang bersifat toksik terhadap sel dan dapat juga terjadi ikatan silang antara dua asam lemak atau antara asam lemak dengan rantai peptide yang timbul karena reaksi dua radikal. Semua hal di atas menyebabkan kerusakan parah pada membran sel termasuk sel spermatozoa. Radikal hiroksil juga mengadakan reaksi dengan asam-asam amino penyusun protein. Sistein adalah yang paling rawan karena mengandung gugus sulfhidril yang paling peka terhadap serangan radikal hidroksil. Pembentukan ikatan disulfide menimbulkan ikatan intra atau antar molekul, sehinga protein kehilangan fungsi biologisnya termasuk enzim-enzim kehilangan aktivitasnya. Melalui dua mekanisme inilah (memutus asam lemak dan protein kehilangan fungsi biologisnya) suatu oksidan atau radikal bebas merusak membran sel dan merusak aktivitas enzim yang berhubungan dengan pembentukan energi spermatozoa sehingga menurunkan motilitas bahkan dapat merusak sel spermatozoa sendiri dan besar kemungkinan akan memperburuk morfologi dan selanjutnya menurunkan motilitas spermatozoa. Peranan antioksidan seperti beta karoten, vitamin E, vitamin C, glutathion dan antioksidan lainnya adalah untuk membersihkan dan meredam oksidan atau radikal bebas di atas. Antioksidan seperti beta karoten adalah senyawa yang dapat memberi elektron kepada radikal bebas atau oksidan sehingga senyawa radikal stabil (Mayes(b), 2002). 18 2.6 Spermatogenesis pada manusia Spermatogenesis adalah proses yang kompleks dan terjadi secara kontinyu memerlukan waktu cukup panjang dari pembelahan dan diferensiasi sel induk spermatogonia sampai menjadi spermatozoa matang. Proses ini berlangsung di testis dan merupakan hal yang sangat penting menentukan fertilitas seorang pria. Proses spermatogenesis terjadi di tubulus seminiferus yang terletak di testis selama kehidupan seksual aktif. Proses spermatogenesis terjadi dari rangsangan hormon gonadotropin hipofise anterior, yang dimulai rata-rata usia 13 tahun dan berlanjut sepanjang kehidupan (Gupta, 2005). Faktor-faktor yang mempengaruhi proses spermatogenesis (Gupta,2005) yaitu: a. Faktor dalam (endogen): - Hormonal - Psikologis - Genetik - Umur - Maturasi b. Faktor luar (eksogen): - Bahan kimia atau obat-obatan - Fisik berupa bendungan, suhu, radiasi oleh sinar X dan getaran ultrasonic - Vitamin dan gizi seperti vitamin A, vitamin E dan glutamine - Trauma dan keradangan. 19 Gambar 2.2 Spermatogenesis Pada Manusia (Sumber: Eroschenco, 2003) Satu siklus spermatogenesis pada manusia membutuhkan waktu 70 ± 4 hari untuk memproduksi spermatozoa dari spermatogonium. Spermatogenesis secara fungsional menjadi 3 tahap, yaitu: spermatositogenesis, meiosis dan spermiogenesis. 2.6.1 Spermatositogenesis Tahap spermatositogenesis terjadi proliferasi atau perbanyakan dari sel induk spermatogonia. Spermatogonia mengalami pembelahan mitosis dan dari pembelahan satu spermatogonium induk terbentuk dua sel spermatogonia yang baru, satu sel induk spermatogonia terus berdeferensiasi sedangkan yang lain tetap menjadi spermatogonium. Spermatogonium induk disebut Spermatogonium Ad. (dark type A Spermatogonium) dan dari Spermatogonium Ad akan dihasilkan sepasang Spermatogonia Ad baru dan salah satu dari generasi Spermatogonia Ad membelah dan menghasilkan sepasang Spermatogonia Ap (pale type A. Spermatogonia), yang selanjutnya berkembang menjadi Spermatogonia B (Gupta, 20 2005). Selanjutnya Spermatogonium B ini akan bermitosis menjadi spermatosit primer dan untuk membedakan Spermatogonium A dan Spermatogonium B dengan melihat intinya. Pada Spermatogonium A intinya oval, jernih, selaput inti tipis, sedangkan Spermatogonium B intinya bulat, mengandung kromatin kasar dan selaput inti tebal (Gupta, 2005). 2.6.2 Meiosis Pada fase meiosis ini terjadi pembelahan dari spermatosit primer menjadi spermatosit sekunder dan diikuti dengan terjadinya reduksi jumlah kromosomnya. Fase meiosis ini ada 2 tahap yaitu meiosis I dan meiosis II. 2.6.2.1 Meiosis I Setelah sintesis DNA dan pembentukan kromatid sejenis lengkap, spermatosit preleptoten memasuki profase (profase I) dari pembelahan meiosis pertama (meiosis I) yang ditunjukkan dengan masa yang panjang. Selama profase, ukuran sel induk dan nukleusnya meningkat secara progresif, bentuk nukleus yang menunjukkan perubahan penting dari kromosom adalah dasar untuk mengklarifikasi spermatosit primer. Tahap-tahap urutan profase I adalah leptoten I, zygoten I, pakhiten I, diploten I dan diaknesis I. Kromosom menjadi padat pada spermatosit leptoten, tetapi tidak berpasangan dan nampak seperti filamen halus dan benang kromatin berbintik-bintik dalam nukleus. 21 Spermatosit zygoten, sedikit lebih besar ditunjukkan oleh benang kromatin yang panjang dan lebih tebal dan mulai tampak seperti karangan bunga karena kromosom menggumpal pada satu sisi nucleus (Gupta, 2005) Kromosom sudah lengkap berpasangan pada Spermatosit pakiten, dan bertahan sampai sekitar 2 minggu. Setiap kromosom terdiri dari sepasang kromatid sejenis yang bergabung pada sentromernya. Pasangan kromosom homolog ini masing-masing berisi 4 kromatid dan disebut sebagai bifalen atau tetrad. Spermatid pakiten ditandai oleh nukleus yang ovoid dan besar, berisi bahan kromatid yang tebal dan pendek serta nukleus berbentuk spheris yang menonjol. Pasangan kromosom telah terpisah hampir di sepanjang lengannya, kecuali pada tempat dimana kiasma berlokasi pada spermatosit diploten dan bila dibandingkan Spermatosit pakiten, spermatosit diploten merupakan tipe sel induk yang terbesar dengan nukleus yang lebih besar dan daerah yang lebih terang di antara tonjolan pita kromatin. Selama diakinesis I kromosom terus memendek untuk mencapai pemadatan maksimal dan terlepas seluruhnya dari membran nukleus. Setelah masa profase I yang panjang, tahap selanjutnya adalah meiosis I berjalan secara cepat. Diakinesis I akan segera diikuti oleh metaphase I. Tahap ini membran nukleus mulai memisah, timbul benang-benang spindel dan pasangan kromosom mensejajarkan diri pada poros ekuatorial sel dengan berorientasi pada sentromer di kutub yang berbeda. Pasangan kromosom homolog tersebut selanjutnya berpisah, sedangkan sentromer dengan kromatid sejenis bergerak menuju kutub 22 sel yang berlawanan selama anaphase I. Tahap telofase I kromosom haploid akan berkelompok pada sel yang berlawanan. Setelah tahap ini, sel akan membelah membentuk dua spermatosit sekunder yang masing-masing berisi pasangan kromosom haploid (23 kromosom atau 1 N jumlah kromosom), dengan kromatid sejenis yang masih bergabung pada sentromernya (2N kandungan DNA). Spermatosit sekunder berbentuk spheris dan lebih kecil dari spermatosit primer. Nukleusnya bulat dan berwarna lebih gelap, berisi pola kromatid yang relatif homogen dengan beberapa gumpalan kromatid yang besar. Spermatosit sekunder, waktu hidup pendek ± 8 jam, gambar kurang spesifik sehingga secara histologik sulit diidentifikasikan (Gupta, 2005). 2.6.2.2 Meiosis II Setelah interfase yang singkat, spermatosit sekunder memasuki pembelahan meiosis II, yang mirip dengan pembelahan mitosis, hanya sel yang memasuki meiosis II mengandung jumlah kromosom haploid. Selama metaphase II ke dua puluh tiga kromosom spermatosit sekunder masing-masing berisi 2 kromatid sejenis dan bergabung bersama pada sentromernya, akan mengatur diri pada poros ekuatorial sel. Selama anaphase II, sentromer membelah secara longitudinal dan kromatid sejenis terpisah dari kromosomnya dan mulai bergerak ke kutub sel yang berlawanan. Kromatid akan berkelompok pada kutub yang berlawanan selama telofase II dan sel akan membelah untuk membentuk 2 spermatid yang masing- 23 masing berisi sejumlah kromosom haploid dan kandungan DNA haploid (1N) (Gupta, 2005). 2.6.3 Spermiogenesis Fase spermiogenesis ini akan terjadi perubahan morfologi dan fungsional tanpa diikuti pembelahan sel dari spermatid menjadi spermatozoa. Spermiogenesis dibagi dalam 4 fase yait fase golgi, fase cap (fase tutup), fase akrosom dan fase pematangan atau maturasi (Gupta,2005; Sadler, 2000). 1. Fase golgi, terbentuk butiran kromosom dalam alat golgi spermatid. Butiran ini nantinya akan bersatu membentuk satu bentukan dengan akrosom disebut granula akrosom. Granula akrosom ini melekat ke salah satu sisi inti yang bakal jadi bagian depan spermatozoa. 2. Fase cap, granula akrosom semakin membesar, bertambah pipih dan menuju bagian depan inti, sehingga akhirnya terbentuk semacam tutup (cap) spermatozoa. 3. Fase akrosom, terjadi redistribusi bahan akrosom. Nukleuplasma berkondensasi dan sementara inti spermatid memanjang dengan batas kaudal menyempit dan membentuk sudut sehingga inti kelihatan lebih pipih dan tutup (cap) mengitari bagian ventral inti. Bahan-bahan akrosom menyebar dan berada pada bagian pada bagian ventral inti, pemanjangan dan pemipihan inti berlangsung terus sehingga bagian anterior spermatid dari bentuk bundar sampai menjadi agak pipih dan pada saat spermatid telah mencapai panjang maksimum, bahan-bahan akrosom telah menutup seperempat bagian anterior spermatid. 24 4. Fase maturasi (pematangan), bentuk spermatid sudah hampir sama dengan spermatozoa dewasa, terjadi perubahan spermatid sesuai dengan ciri spesies, terjadi penyempurnaan akrosom, bentuk inti dan perkembangan serta maturasi dinding spermatozoa dan selanjutnya melepaskan diri dari epitel seminiferus menuju lumen menjadi spermatozoa bebas. Jadi pada fase spermiogenesis ini dikenal beberapa perkembangan spermatid yang terakhir yaitu : a. Pembentukan akrosom yang menutupi lebih dari setengah permukaan inti b. Perubahan dalam bentuk dan derajat kondensasi dari nukleus c. Pembentukan leher, bagian tengah dan ekor d. Meluruh sebagian besar sitoplasma. Gambar 2.3 Tubulus Seminiferus pada pembesaran 400 kali (Sumber: Indira, 2008) 25 2.7 Spermatogenesis pada mencit Spermatogenesis pada mencit terjadi selama 35 hari. Spermatogenesis terjadi dalam tiga tahap yaitu fase proliferasi, meiosis, dan spermiogenesis. Fase proliferasi dimulai dari pembelahan spermatogonia yang terjadi beberapa kali sehingga menghasilkan Spermatogonia tipe A2, A3, dan A4. Spermatogonia A4 mengalami pembelahan menghasilkan spermatogonia intermedia yang kemudian akan membelah lagi menghasilkan Spermatogonia tipe B. Spermatogonia tipe B ini selanjutnya akan mengalami mitosis sehingga terbentuk spermatosit primer dan berada pada fase istirahat pada tahap preleptoten (Gilbert, 1985, Premesemara, 2010). Fase meiosis terdiri dari dua tahap yaitu meiosis I dan II yang masingmasing terdiri dari fase profase, metafase, anafase, dan telofase. Profase pada meiosis I meliputi leptoten, zigoten, pakhiten, diploten, dan diakinesis. Meiosis I berakhir dengan terbentuknya spermatosit sekunder yang selanjutnya akan mengalami meiosis II dan berakhir dengan pembentukan spermatid (Johnson & Everitt,1990, Pramesemara, 2010). Fase selanjutnya adalah spermiogenesis yang merupakan transformasi spermatid menjadi spermatozoa yang terdiri dari 16 tingkat. Tahapan – tahapan itu antara lain : 1. Tahap 1, dimulai dengan pembentukan spermatid yang baru sebagai akibat dari pembelahan mitosis yang kedua. Di daerah golgi timbul beberapa struktur yang bulat yang disebut idiosom. 26 2. Tahap 2, terlihat adanya granula proakrososm pada idiosom, jumlah granula biasanya dua dimana yang satu biasanya lebih besar. 3. Tahap 3, terjadi penggabungan granula proakrosom sehingga terbentuk granula akrosom yang besar yang berbatasan dengan nukleus. 4. Tahap 4, ditandai dengan membesarnya granula dan letaknya lurus di atas nukleus. 5. Tahap 5, ditandai dengan bertambah pipihnya cap (tutup) dan bergerak menuju ke samping nukleus perpanjangannya. 6. Tahap 6, pertumbuhan cap (tutup) mengalami kemajuan yang cukup pada permukaan luar nukleus. 7. Tahap 7, pertumbuhan pada bagian depan cap (tutup) terus berlangsung sampai menutup sepertiga sampai setengah bagian inti dan ini disebut sebagai head cap. 8. Tahap 8, disini dimulai tahap akrosom. Sistem akrosom bergerak ke arah basal nulkeus dan nukleus spermatid memanjang. 9. Tahap 9, ditandai dengan perubahan bentuk nukleus spermatid nyata, yaitu ujung kaudal menyempit dan membentuk sudut, sehingga kelihatan lebih pipih. 10. Tahap 10, bahan – bahan akrosom telah berada pada dinding dorsal inti, pemanjangan dan pemipihan inti berjalan terus sehingga spermatid menjadi sempit pada bagian depan. 11. Tahap 11, terjadi perubahan ujung kaudal spermatid bentuk bundar sampai menjadi agak pipih. 27 12. Tahap 12, spermatid telah mencapai panjang yang maksimum. Akrosom telah menutup seperempat bagian anterior spermatid dan tampak seperti struktur bentuk biji di atas nukleus. 13. Tahap 13, bentuk spermatid sudah hampir sama dengan spermatozoa dewasa, yaitu mengalami pemendekan dratis hampir 20%. 14. Tahap 14, terjadi penyempurnaan akrosom, bentuk dan penampakan spermatozoa dewasa telah tercapai. 15. Tahap 15, terjadi penyempurnaan bentuk inti dan perkembangan serta maturasi dinding spermatozoa. 16. Tahap 16, menggambarkan spermatozoa melepaskan diri dari epitel seminiferus menuju ke lumen menjadi spermatozoa bebas. 2.8 Tubulus Seminiferus 2.8.1 Anatomi dan Histologis Tubulus Seminiferus Tubulus seminiferus adalah bagian dari organ reproduksi pria yang terletak di dalam testis yang berperan penting dalam proses spermatogenesis. Tubulus seminiferus berbentuk tabung dengan panjang sekitar 30 – 70 cm dan diameter 150 – 250 µm. Di dalam testis, tubulus seminiferus dimampatkan dan terletak di dalam lobulus testis (Gupta, 2005). Testis manusia merupakan organ padat berbentuk bulat oval yang masingmasing berukuran 4 x 2,5 cm, yang terletak di dalam skrotum dan dibungkus oleh tunika albugenia pada bagian dalam serta tunika vaginalis di bagian luarnya. 28 Testis dibagi oleh septa-septa jaringan ikat menjadi 200 – 300 buah lobuli. Masing-masing lobulus berisi satu sampai empat buah tubulus seminiferus (Gupta, 2005; Sherwood, 2001). Hampir 80% massa testis terdiri dari sel-sel spermatogenik di dalam tubulus seminiferus, sedangkan 20% sisanya terdiri dari jaringan ikat, pembuluh darah dan sel-sel yang ada di antaranya. Tubulus seminiferus merupakan pabrik spermatozoa, tempat berlangsungnya proses spermatogenesis. Tubulus seminiferus dibedakan menjadi tubulus seminiferus kontortus dan tubulus seminiferus rektus. Tubulus seminiferus kontortus dari masing-masing lobulus testis bergabung membentuk tubulus seminiferus rektus, yang merupakan saluran lurus yang langsung menghubungkan tubulus seminiferus dengan rete testis dibagian posterior testis. Dari rete testis ini selanjutnya spermatozoa akan dialirkan melalui duktus eferentes kemudian memasuki epidydimis dan siap untuk dikeluarkan (Gupta, 2005; Sherwood, 2001). Secara histologi, tubulus seminiferus merupakan suatu struktur berbentuk tabung yang dindingnya tersusun atas lapisan epitel tubulus seminiferus dan tunika propria. Tunika propria merupakan komponen dinding tubulus yang terluar, yang terdiri dari berkas-berkas anyaman serat kolagen tipe I yang tersusun atas sel-sel fibroblas. Pada beberapa jenis mamalia seperti tikus, di antara jaringan ikat terdapat pula sel-sel myoid yang menyerupai sel-sel otot polos. Komponen epitel dari tubulus seminiferus terdiri dari dua jenis sel yaitu : 1. Sel penyangga yang non-proliferatif (sel Sertoli) 2. Sel-sel epitel germinal yang proliferatif. 29 Sel-sel epitel germinal akhirnya akan menghasilkan spermatozoa. Antara komponen jaringan ikat dan epitel dipisahkan oleh lapisan tipis membran basalis. Ruang interstitial antara tubulus seminiferus satu dengan yang lainnya diisi oleh jaringan ikat longgar yang mengandung kapiler peritubular yang padat, saluran limfatik, sel-sel mesenkim dan kadang-kadang makrofag. Terdapat juga sebaran kelompok-kelompok sel Leydig yang berperan dalam produksi hormon testosteron. 2.8.2 Kerusakan Tubulus Seminiferus Seperti halnya sel-sel di bagian tubuh yang lainnya, sel-sel penyusun tubulus seminiferus juga dapat mengalami cedera oleh berbagai hal yang mengakibatkan kerusakan struktur maupun fungsi sel tersebut. Oleh karena fungsi utama tubulus seminiferus adalah untuk spermatogenesis maka faktor-faktor yang merusak struktur tubulus seminiferus akan menimbulkan gangguan pada proses spermatogenesis. Secara umum kerusakan tubulus seminiferus dapat digambarkan ke dalam empat kategori (Burkitt, 1993) : 1. Atrofi tubuler yaitu keadaan dimana terjadi kehilangan sel-sel spermatogenik di dalam tubulus seminiferus, menurunnya diameter tubulus seminiferus dan tampak penebalan pada membran basalis (Robbins & Cotran, 2004). 2. Nekrosis tubuler yaitu kerusakan seluruh unsur sel di dalam tubulus seminiferus, terlihat adanya sisa-sisa bahan nekrotik, tampak membran 30 basalis mengalami kerusakan akibat terjadinya lisis, dan terlihat adanya sel radang. 3. Hilangnya sel-sel intermedia, pada keadaan ini tampak sel-sel Sertoli, spermatosit primer dan spermatid tanpa spermatogenesis. 4. Penurunan spermatogenesis yaitu penurunan paling sedikit 75% jumlah spermatozoa yang terlihat dalam lumen dengan bentuk intermedia yang utuh. BAB III KERANGKA KONSEP 3.1. Kerangka Berpikir Dari rumusan masalah dan teori di atas, maka dapat disusun kerangka konsep sebagai berikut : proses spermatogenesis yang terjadi pada tubulus seminiferus dapat dipengaruhi oleh faktor eksternal dan internal. Faktor internal yang mempengaruhi proses spermatogenesis antara lain : hormon khususnya hormon testosteron, genetik/strain, psikologi, maturasi, dan umur. Sedangkan faktor eksternal yang mempengaruhi proses spermatogenesis 31 yaitu makanan (vitamin dan gizi), pelatihan fisik berlebih, zat kimia, dan faktor fisik(suhu, radiasi), trauma dan keradangan. Pelatihan fisik yang berlebih menyebabkan timbulnya radikal bebas sehingga akan dapat menimbulkan terjadinya ketidakseimbangan (stres oksidatif). Radikal bebas yang terbentuk berefek pada kerusakan sel-sel spermatogenik dengan cara merusak komponen lipid dari membran sel. Spermatozoa rentan dari proses lipid peroksidasi karena struktur dari membran sel spermatozoa sangat tinggi kandungan asam lemak tak jenuhnya, dimana penting untuk mengatur proses spermatogenesis. Pemberian beta karoten sebagai antioksidan eksogen dapat membantu mencegah terjadinya kerusakan sel, termasuk sel-sel spermatogenik. Beta karoten yang mempunyai sifat pemutus rantai, bersifat lipofilik dapat berperan pada membran sel termasuk sel spermatozoa untuk mencegah terjadinya peroksidasi lipid (LPO). Jadi, pemberian beta karoten diharapkan mampu mencegah gangguan spermatogenesis pada mencit yang menerima pelatihan fisik berlebih. 3.2 Kerangka Konsep 31 Kerangka konsep penelitian ini dapat dilihat pada bagan di bawah ini : Faktor Internal 1. Hormon 2. Genetik 3. Psikologi 4. Maturasi 5. Umur Faktor Eksternal Pelatihan fisik berlebih dan pemberian beta karoten 1. Makanan 2. Kimia/obat-obatan 3. Fisik 4. Trauma 5. Keradangan 32 Spermatogenesis Jumlah Spermatogonium A, Spermatosit pakhiten, Spermatid 7 dan 16, dan perbaikan kualitas struktur Tubulus Seminiferus. Spermatogenesis Jumlah Spermatogonium A, Spermatosit pakhiten, Spermatid 7 dan 16, dan kualitas lumen Tubulus Seminiferus. Gambar 3.1 Bagan kerangka konsep penelitian 3.3 Hipotesis Penelitian Berdasarkan kerangka konsep di atas maka hipotesis yang diajukan dalam penelitian ini adalah: 1. Beta karoten per oral sebagai antioksidan dapat mempertahankan jumlah sel-sel Spermatogonium A pada tubulus seminiferus mencit setelah menerima pelatihan fisik berlebih. 2. Beta karoten per oral sebagai antioksidan dapat mempertahankan jumlah sel-sel Spermatosit Pakiten pada tubulus seminiferus mencit setelah menerima pelatihan fisik berlebih. 3. Beta karoten per oral sebagai antioksidan dapat mempertahankan jumlah sel-sel Spermatid 7 pada tubulus seminiferus mencit setelah menerima pelatihan fisik berlebih. 33 4. Beta karoten per oral sebagai antioksidan dapat mempertahankan jumlah sel-sel Spermatid 16 pada tubulus seminiferus mencit setelah menerima pelatihan fisik berlebih. 5. Beta karoten per oral sebagai antioksidan dapat mempertahankan kualitas struktur tubulus seminiferus mencit setelah menerima pelatihan fisik berlebih. BAB IV METODE PENELITIAN 4.1 Rancangan Penelitian Penelitian ini adalah penelitian eksperimental dengan rancangan randomized pre-test – post-test control group design (Cohen et al., 2007) 34 Pre-test P1 Post-test O1 O2 P2 R P S RA O3 O4 P3 O5 O6 Gambar 4.1 Bagan rancangan penelitian Keterangan : P = Populasi S = Sampel R = Randomisasi RA = Random Alokasi O1 = Pemeriksaan awal sel-sel spermatogenik dan kualitas tubulus seminiferus pada kelompok kontrol sebelum diberi beta karoten dan pelatihan fisik berlebih O2 = Pemeriksaan sel-sel spermatogenik dan kualitas tubulus seminiferus pada kelompok kontrol tanpa pemberian beta karoten dan setelah mendapatkan pelatihan fisik berlebih. O3 = Pemeriksaan awal sel-sel spermatogenik dan kualitas tubulus seminiferus 34 pada kelompok perlakuan sebelum pemberian beta karoten dosis 0,1 mg dan sebelum mendapatkan pelatihan fisik berlebih. O4 = Pemeriksaan sel-sel spermatogenik dan kualitas tubulus seminiferus pada kelompok perlakuan setelah pemberian beta karoten dosis 0,1 mg dan setelah mendapat pelatihan fisik berlebih. 35 O5 = Pemeriksaan awal sel-sel spermatogenik dan kualitas tubulus seminiferus pada kelompok perlakuan sebelum pemberian beta karoten dosis 0,2 mg dan sebelum mendapat pelatihan fisik berlebih. O6 = Pemeriksaan sel-sel spermatogenik dan kualitas tubulus seminiferus pada kelompok perlakuan setelah pemberian beta karoten dosis 0,2 mg dan setelah mendapat pelatihan fisik berlebih. P1 = Perlakuan pada kelompok kontrol tanpa pemberian beta karoten (diberikan minyak zaitun (olive) 0,5 ml) dan pemberian pelatihan fisik berlebih pada mencit. P2 = Perlakuan pada kelompok perlakuan dengan pemberian beta karoten dosis 0,1 mg dan pemberian pelatihan fisik berlebih pada mencit. P3 = Perlakuan pada kelompok perlakuan dengan pemberian beta karoten dosis 0,2 mg dan pemberian pelatihan fisik berlebih pada mencit. 4.2 Lokasi dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Farmakologi Fakultas Kedokteran, Universitas Udayana dan pemeriksaan histopatologi dikerjakan di Laboratorium Patologi Balai Penyelidik Penyakit Veteriner Denpasar (BPPV). Penelitian dilaksanakan dalam waktu 8 (delapan) minggu, dengan rincian sebagai berikut: 1. Satu minggu untuk persiapan 2. Lima minggu untuk perlakuan 3. Satu minggu untuk pembuatan dan pembacaan sediaan histopatologi. 36 4. Satu minggu untuk analisis statistik dan penyusunan usulan kelayakan. 4.3 Penentuan Sumber Data 4.3.1 Kriteria Sampel Penelitian Sampel dalam penelitian ini adalah mencit jantan dewasa strain Balb-C dengan kriteria sebagai berikut : 4.3.1.1 Kriteria inklusi - Berat Badan 20 – 22 gram - Umur 2 – 3 bulan - Sehat - Satu hibrid 4.3.1.2 Kriteria ekslusi Adalah sampel yang memenuhi kriteria inklusi namun karena sesuatu hal dikeluarkan dari sampel sebelum pelaksanaan penelitian seperti mencit tidak mau makan. 3.3.1.1 Kriteria Drop Out Adalah sampel yang memenuhi kriteria inklusi namun karena sesuatu hal dikeluarkan dari sampel selama penelitian seperti mencit tidak mau makan atau sakit. 37 4.3.2 Besar Sampel Besar sampel yang diperlukan dalam penelitian ini didasarkan pada rumus Pocock (2007) 2σ2 n= x ƒ (α,β) (µ2 - µ1)2 Keterangan : N = jumlah sampel Σ = SD ( standar deviasi ) kelompok perlakuan dengan penberian beta karoten ƒ ( α,β ) = Besarnya didapat dari tabel (Pocock, 2007) µ1 = Rerata hasil Spermatogonium A pada kelompok perlakuan dengan pemberian beta karoten. µ2 = Rerata hasil spermatogonium A pada kelompok pre-test. Dari penelitian pendahuluan didapatkan data : 1. Standar deviasi (σ) kelompok perlakuan dengan pemberian beta karoten = 6,94 2. Rerata hasil Spermatogonium A pada kelompok perlakuan dengan dengan pemberian beta karoten (µ2) = 85,80 3. Rerata hasil Spermatogonium A pada kelompok pre-test (µ1) = 98,10. 4. ƒ ( α,β ) = 10,5 38 Jadi, jumlah sampel (n) yang didapat 6.7 ~ 7, dan ditambah 1 ekor mencit untuk masing-masing kelompok sebagai cadangan. Dalam hal ini, pada masing – masing kelompok terdapat 8 ekor mencit. Jadi total mencit yang diperlukan 48 ekor mencit jantan. 4.3.3 Teknik Pengambilan Sampel Oleh karena sampel ini bersifat homogen yaitu mencit jantan yang memenuhi syarat sebagai sampel penelitian berdasarkan kriteria inklusi, maka diambil secara acak sederhana untuk mendapatkan jumlah sampel. Sampel yang dipilih dibagi menjadi 3 kelompok yaitu kelompok perlakuan tanpa pemberian beta karoten, kelompok perlakuan dengan pemberian beta karoten dosis 0,1 mg dan kelompok perlakuan pemberian beta karoten dosis 0,2 mg 4.4 Variabel Penelitian 4.4.1 Identifikasi Variabel Variabel yang akan diukur adalah jumlah sel Spermatogonium A, Spermatosit Pakiten, Spermatid 7, Spermatid 16, dan kualitas struktur tubulus seminiferus setelah perlakuan selama 35 hari. 4.4.2 Klasifikasi Variabel 4.4.2.1 Variabel Bebas : Pelatihan fisik berlebih, dosis pemberian beta karoten. 39 4.4.2.2 Variabel Tergantung : Jumlah sel Spermatogonium A, Spermatosit Pakiten, Spermatid 7, Spermatid 16, tingkat perbaikan lumen tubulus seminiferus. 4.4.2.3 Variabel Kendali : Strain mencit jantan, umur, berat badan, lingkungan (suhu, kelembaban, cahaya), kesehatan mencit. 4.4.3 Definisi Operasional Variabel 4.4.3.1 Pelatihan fisik berlebih pada mencit adalah pelatihan berlebih yang diukur berdasarkan waktu maksimal kemampuan renang mencit pada ember berdiameter 35 cm dengan kedalaman air 20 cm, yang dilakukan setiap hari selama 65 menit (Binekada, 2002), dengan lama pelatihan 35 hari. 4.4.3.2 Dosis pemberian beta karoten adalah pemberian sediaan antioksidan beta karoten dalam bentuk serbuk yang dilarutkan dengan minyak zaitun (olive) 0,5 ml yang diberikan 1 kali sehari secara oral melalui zonde dan diberikan 6 jam sebelum dilakukan pelatihan fisik berlebih. Dosis pemberian beta karoten mengacu pada penelitian yang dilakukan sebelumnya oleh Ronal, yaitu pemberian beta karoten 30-60 mg per hari pada pria dewasa. Berdasarkan tabel konversi perhitungan dosis menurut Laurance & Bacharah (Get & Barnes, 1994), maka perhitungan konversi dosis untuk beta karoten adalah sebagai berikut: 40 Dosis manusia pada pria dewasa (rata-rata berat ± 70 kg) = 30 mg Dosis mencit 20 gr = 0,0026 x 30 mg = 0,078 mg Jika dosis manusia pada pria dewasa (rata-rata berat ± 70 kg) = 60 mg Dosis mencit 20 gr = 0,0026 x 60 mg = 0,156 mg Jadi dosis yang digunakan dalam penelitian ini adalah 0,1 mg dan 0,2 mg per hari. 4.4.3.3 Sel – sel spermatogenik diamati pada stadium VII tubulus seminiferus dengan menggunakan mikroskop elektrik dengan pembesaran 400 kali dan diamati dalam 5 lapang pandang (mulai dari kiri atas bergeser ke kanan atas, bergeser ke tengah, bergeser ke kiri bawah dan bergeser ke kanan bawah) pada setiap preparat dari testis kanan dan testis kiri kemudian dijumlahkan dan dirata-ratakan : • Jumlah sel Spermatogonium A: jumlah sel dengan bentuk bulat, dekat membran basal, inti berbentuk lonjong dengan kromatin halus dan selaput inti tipis yang diamati dan dihitung di bawah mikroskop. • Jumlah sel Spermatosit Primer Pakiten: jumlah sel berbentuk bulat, besar, inti gelap dengan kromosom terlihat jelas yang diamati dan dihitung di bawah mikroskop. • Jumlah sel Spermatid 7: jumlah sel berbentuk bulat, lebih kecil dari Spermatosit Pakiten, inti bulat, pucat dan terang yang diamati dan dihitung dibawah mikroskop. 41 • Jumlah sel Spermatid 16: jumlah sel yang menunjukkan spermatozoa yang telah lengkap dan sempurna yang diamati dan dihitung dibawah mikroskop. 4.4.3.4 Tingkat perbaikan kualitas tubulus seminiferus : perbaikan pada struktur histologis tubulus seminiferus yang diamati di bawah mikroskop elektrik dengan tidak adanya empat katagori kerusakan tubulus seminiferus (Burkitt, 1993), dengan menggunakan pembesaran 400 kali dan diamati dalam 5 lapang pandang (mulai dari kiri atas bergeser ke kanan atas, bergeser ke tengah, bergeser ke kiri bawah dan bergeser ke kanan bawah) pada setiap preparat dari testis kanan dan testis kiri kemudian dijumlahkan dan dirata-ratakan: 1. Atrofi tubuler yaitu keadaan dimana terjadi kehilangan sel-sel spermatogenik di dalam tubulus seminiferus, menurunnya diameter tubulus seminiferus dan tampak penebalan pada membran basalis. 2. Nekrosis tubuler yaitu kerusakan seluruh unsur sel di dalam tubulus seminiferus, terlihat adanya sisa-sisa bahan nekrotik, tampak membran basalis mengalami kerusakan akibat terjadinya lisis, dan terlihat adanya sel radang. 3 Hilangnya sel-sel intermedia. Pada keadaan ini tampak sel–sel sertoli, spermatosit primer dan spermatid tanpa spermatogenesis. 4 Penurunan spermatogenesis yaitu penurunan paling sedikit 75% jumlah spermatozoa yang terlihat dalam lumen dengan bentuk intermedia yang utuh. 42 4.4.3.5 Cahaya, suhu, dan kelembaban: merupakan kondisi lingkungan yang dialami mencit jantan dewasa. Pada penelitian ini kondisi lingkungan selama percobaan akan dibuat sama. 4.4.3.6 Berat badan : berat mencit yang ditimbang dengan timbangan gram. 4.4.3.7 Umur mencit : ditentukan dengan melihat tanggal kelahiran yang telah dicatat pada kandang percobaan. 4.4. Hubungan Antar Variabel Variabel Tergantung Variabel Bebas Spermatogenesis 1.Pemberian beta karoten 1. Jumlah sel mg) - sel spermatogenik (Spermatogonium A, Spermatosit Pakiten, Spermatid 7 dan Spermatid 16) (0,1 mg & 0,2 2. Kualitas tubulus seminiferus 2. Pelatihan fisik berlebih 1. Variabel Kendali Strain Berat badan Lingkungan Kesehatan Gambar 4.2 : Bagan Hubungan Antar Variabel 4.5 Bahan Penelitian Bahan atau Materi : - Beta karoten - Minyak zaitun (olive) 43 - Mencit putih jantan. - Makanan mencit berupa pellet dan air minum dari air ledeng - Ether untuk mematikan mencit. - Larutan buffer formalin 10% - Bahan kimia untuk pembuatan sediaan histologis antara lain alkohol 70%, alkohol 75%, alkohol 95/96%, alkohol 100%, xylol, parafin cair, bahan pewarna hematoxylin-eosin, entelan. 4.6 Alat Penelitian Alat yang dipakai dalam pengambilan data penelitian ini adalah sebagai berikut : - Kandang mencit terbuat dari besi, di dalamnya terdapat sekam dan botol minuman - Ember berdiameter 35 cm dan kedalaman air 20 cm - Mikroskop elektrik merek Olympus tipe CX-21.. - Stop watch - Timbangan, merek Tanita, buatan Japan - Spuit injeksi 1 ml - Slang plastik, panjang ± 2 cm - Alat bedah minor (bak paraffin, pisau bedah, pinset dan gunting bedah) - Duplex Tissue Prosessor merek Tissue-Tek II - Peralatan untuk sediaan histologis seperti mikrotom, oven, scalpel, holder, spatula, hotplate, staining jar, gelas obyek dan kaca penutup. 44 4.7 Prosedur Penelitian 4.7.1 Persiapan Hewan coba Mencit jantan dewasa, strain Balb-C, sehat, berumur 2-3 bulan dengan berat badan 20-22 gram dilakukan aklimatisasi selama 2 minggu di tempat penelitian untuk penyesuaian dengan lingkungan. Setelah itu, mencit-mencit dikelompokkan secara random menjadi 3 kelompok yaitu: kelompok p1 diberi minyak olive 0,5 ml dan diberi perlakuan pelatihan fisik berlebih, kelompok p2 diberi beta karoten 0,1 mg dan diberi perlakuan pelatihan fisik berlebih dan kelompok p3 diberi beta karoten 0,2 mg dan diberi perlakuan pelatihan fisik berlebih, kemudian dimasukkan dalam kandang masing-masing kelompok. Selama penelitian hewan coba diberikan makan dan minum secara teratur, kebersihan dan kenyamanan kandang dijaga. Sebelum perlakuan, 8 ekor mencit pada masing-masing kelompok dilakukan pembedahan untuk pemeriksaan histopatologi pada kelompok pre-test. Setelah dilakukan pembedahan untuk pengambilan testis, mencit tersebut dikubur supaya tidak menimbulkan bau tidak sedap serta efek negatifnya. 4.7.2 Jalannya Penelitian Setelah dilakukan persiapan hewan coba maka dilakukan penelitian dengan urutan kerja (protokol penelitian) seperti di bawah ini: 1. Pada minggu pertama, mencit telah dipisahkan masing-masing ke dalam 3 buah kandang dan diberi nama kelompok kontrol (kelompok yang diberi minyak zaitun 0,5 ml dan pelatihan fisik berlebih), perlakuan 1 (kelompok 45 yang beri beta karoten 0,1 mg dan pelatihan fisik berlebih) dan perlakuan 2 (beri beta karoten 0,2 mg dan pelatihan fisik berlebih). 2. Sebelum diberi perlakuan 8 (delapan) ekor mencit dari masing-masing kelompok dibedah untuk pemeriksaan histopatologi awal (pre-test). 3. Kemudian sisa mencit 8 (delapan) ekor pada masing-masing kelompok diberi perlakuan. 4. Enam jam sebelum perlakuan pelatihan fisik berlebih, mencit diberi minyak zaitun 0,5 ml pada kelompok kontrol dan beta karoten 0,1 mg pada kelompok perlakuan 1 serta beta karoten 0,2 mg pada kelompok perlakuan 2, setelah itu baru dilakukan pelatihan fisik berlebih dengan cara merenangkan mencit selama 65 menit. Ekor mencit dirangsang dengan lidi supaya mencit terus bergerak selama waktu yang ditentukan. Perlakuan ini dilakukan selama 35 hari 5. Hari ke-36, 8 ekor mencit pada masing-masing kelompok dibedah dan diambil testisnya untuk pemeriksaan histopatologi (post-test). Testis mencit tadi dimasukkan ke dalam cairan fixasi berupa buffer formalin 10%. Sediaan histopatologi dikerjakan di Laboratorium Patologi Balai Penyelidik Penyakit Veteriner (BPPV) Denpasar, dan selanjutnya peneliti mengamati langsung hasil dari sediaan histopatologi yang telah 4.7.3 Alur Penelitian Mencit Mencit (48 ekor) Kontrol Kontrol Perlakuan Perlakuan Perlakuan (16 ekor) (16 ekor) (16 ekor) 46 Kontrol Perlakuan Perlakuan Histopatologi Jumlah Spermatogenik Kualitas Tubulus Seminiferus Pre-test Pre-test Pre-test (8 ekor) (8 ekor) (8 ekor) Perlakuan beta karoten 0,1 mg & pelatihan fisik berlebih Perlakuan minyak zaitun 0,5 ml & pelatihan fisik berlebih Perlakuan beta karoten 0,2 mg & pelatihan fisik berlebih (8 ekor) (8 ekor) (8 ekor) Histopatologi Jumlah Spermatogenik Kualitas Tubulus Seminiferus Post-test Post-test Post-test (8 ekor) (8 ekor) (8 ekor) Gambar 4.3. Bagan Alur Penelitian 4.7.4 Cara Membuat Sediaan Mikroskopis Mencit dipingsankan dengan eter, kemudian daerah perineum dibuka dengan gunting bedah secara hati – hati lalu testis diangkat. Testis dipisahkan, kemudian difiksasi pada larutan buffer formalin 10% selama 3 jam, lalu dilakukan dehidrasi. Mula – mula pada alkohol 70% selama 1/2 jam, kemudian dimasukkan 47 ke dalam alkohol 95% selama 1/2 jam, kemudian dimasukkan ke dalam alkohol 100% pertama (I) selama 1/2 jam, kedua (II) selama 1 jam, ketiga (III) selama 1 jam dan keempat (IV) selama 1 jam. Kemudian proses clearing dimasukkan ke dalam xylol pertama (I) selama 1 jam dan xylol kedua (II) selama 2 jam, kemudian impregnasi/embeding dengan memasukkan ke dalam parafin pertama (I) selama 21/2 jam dan parafin kedua (II) selama 4 jam. Kemudian dibuat blok parafin dan disimpan dalam almari es. Selanjutnya blok parafin dipotong dengan mikrotom setebal 5 mikron dan selanjutnya dilakukan pewarnaan (staining). Pewarnaan sediaan testis dengan Hematoxylin-Eosin (HE), dengan cara pertama deparafinisasi dengan xylol, hidrasi dengan serial alkohol 100% (2 x 2 menit) 95% (2 menit) - 90% (2 menit) - 80 % (2 menit) - 70% (2 menit) kemudian diwarnai dengan hematoxylin selama 1 menit, lalu cuci dengan air keran beberapa menit sampai air bersih, lalu diwarnai dengan eosin biarkan selama 5 menit, lalu cuci 2 kali dengan alkohol 75%, kemudian dilakukan dehidrasi dengan alkohol 95%, kemudian bersihkan dengan xylol sebanyak 2 kali masing-masing selama 5 menit selanjutnya dilakukan mounting menggunakan entelan (Luna, 1968, & Jusuf, 2009). 4.7.5 Cara Pengumpulan Data Data yang dikumpulkan pada penelitian ini diperoleh dari : 1. Hasil pemeriksaan pre-test terhadap masing-masing kelompok yang kemudian diambil testisnya dan diamati secara mikroskopis. 48 2. Hasil pemeriksaan post-test terhadap kedua kelompok yang diambil testisnya dan diamati secara mikroskopis. Data kuantitatif pada masing-masing mencit diperoleh dari rata-rata jumlah sel-sel spermatogenik dalam 5 lapang pandang baik pada tubulus seminiferus testis kanan dan tubulus seminiferus testis kiri secara mikroskop dengan pembesaran 400 kali. Data kualitatif diperoleh dari rata-rata persentase jumlah tubulus seminiferus normal (tidak ada kategori kerusakan tubulus menurut kriteria Burkit) dalam lima lapangan pandang baik pada tubulus testis kanan dan tubulus testis kiri secara mikroskopis dengan pembesaran 400 kali. . 4.8 Analisis Data Data yang diperoleh pada penelitian ini dianalisis sebagai berikut: 1. Analisis deskriptif. 2. Uji normalitas data dilakukan dengan tes Shapiro-Wilk. Data terdistribusi normal bila p>0,05. 3. Uji homogenitas dilakukan dengan Levene’s Test. Data dinyatakan homogen bila p>0,05 4. Uji komparabilitas yang dipakai meliputi : • Untuk mengetahui efek pemberian beta karoten, maka dibandingkan rerata sel spermatogenik post-test pada kelompok perlakuan tanpa pemberian beta karoten dan kelompok perlakuan 49 dengan pemberian beta karoten dosis 0,1 mg dan dosis 0,2 mg maka dipergunakan uji One Way Anova. • Untuk mengetahui efek pemberian beta karoten pada masingmasing kelompok, maka dibandingkan rerata sel spermatogenik pretest dan post-test masing-masing kelompok. Data yang berdistribusi normal menggunakan uji Paired T-Test. • Pada data yang tidak berdistribusi normal, memakai uji Wilcoxon untuk menganalisis data berpasangan (pre-test dan post-test). • Analisis data menggunakan tingkat kepercayaan 95% atau dinyatakan berbeda bila p<0,05.
