vnn

DETEKSI VIRAL NERVOUS NECROTIC (VNN)
DENGAN METODE RT – PCR
1.
Tujuan
Untuk mendeteksi VNN (viral nervous necrotic) secara benar
2.
Ruang lingkup
Melakukan deteksi VNN (viral nervous necrosis) dengan metode RT-PCR
3.
Acuan
OIE, 2006. Manual of Diagnostics Test for Aquatic Animals. Chapter 2.1.7, hal. 161-167
4.
Bahan
a. TRIzol Reagent
b. Chloroform
c. Isopropanol
d. Ethanol 75%
e. RNase free water
f. Go Taq PCR Core System I (Promega): 5XPCR Buffer, 25 mM MgCl 2, 10 mM
dNTPMix, dan Go Taq DNA polymerase (5U/µl)
g. AMV Reverse Transcriptase (10U/µl)
h. RNAse Inhibitory (10U/µl)
i. 1 set primer (10 µM):
 VNNF2 = 5’-CGT-GTC-AGT-CAT-GTG- TCG-CT-3’
 VNNR3 = 5’-CGA-GTC-AAC-ACG-GGT-GAA-GA –3’
j. Agarose
k. Ethidium bromide (10 mg/ml)
l. Loading buffer
m. Larutan TBE
n. 100 bp DNA ladder
o. Akuades
p. Mikrotube
5.
Alat
a. Fume hood
b. Sentrifus
c. Vortex mixer
d. Waterbath
e. Mikropipet
f. Laminar flow horizontal (biohazard)
g. Thermal cycler
h. Elektroforesis horizontal
i. UV transilluminator
j. Kamera digital
6.
Prosedur kerja
a. Ekstraksi RNA menggunakan TRIzol Reagent (Invitrogen)
1) Homogenisasi: Homogenisasi 50-100 mg sampel mata atau otak segar atau yang
telah disimpan di dalam freezer atau difiksasi alkohol dalam 1 ml TRIzol Reagent
menggunakan glass-Teflon atau power homogenizer (Polytron, atau Tekmar’s
TISSUMIZER atau yang ekuivalen). Volume sampel sebaiknya tidak lebih dari
10% volume TRIzol Reagent yang digunakan untuk homogenisasi, kecuali
sampel air.
Pilihan: Ada tahap isolasi tambahan yang mungkin diperlukan untuk sampel yang
banyak mengandung protein, lemak, polisakarida atau material
ekstraseluler seperti otot dan jaringan lemak. Setelah homogenisasi,
material yang tidak terlarut dikeluarkan dari homogenat dengan
sentrifugasi dengan kecepatan 12.000 g selama 10 menit pada suhu 28oC. Pelet mengandung membran ekstraseluler polisakarida, dan DNA
yang mempunyai berat molekul besar, sementara supernatan mengandung
RNA. Pada sampel dari jaringan lemak, maka lemak yang terkumpul
pada permukaan harus dihilangkan. Pada setiap proses isolasi RNA,
pindahkan larutan homogenat jernih ke dalam mikrotube bersih dan
lanjutkan dengan penambahan chloroform dan fase separasi berikutnya.
2) Fase separasi: Inkubasi sampel yang telah dihomogenisasi selama 5 menit pada
suhu 15 – 30oC agar proses disosiasi kompleks nukleoprotein berjalan sempurna.
Tambahkan 0,2 ml chloroform untuk setiap 1 ml TRIzol Reagent. Tutuplah
mikrotube dan kocok dengan tangan secara kuat selama 15 detik dan inkubasi
pada suhu 15 – 30oC selama 2 – 3 menit. Sentrfugasi sampel dengan kecepatan
tidak lebih dari 12.000 g selama 15 menit pada suhu 2 – 8oC. Setelah sentrifugasi,
campuran terpisah menjadi bagian bawah berwarna merah (fase phenolchloroform), interfase, dan bagian atas yang jernih (fase air). RNA terlarut dalam
fase air. Volume fase air sekitar 60% dari volume TRIzol Reagent yang
digunakan untuk homogenisasi.
3) Presipitasi RNA: Pindahkan cairan lapisan paling atas (fase air) ke dalam
mikrotube baru. Presipitasi RNA dari fase air dengan menambahkan isopropyl
alcohol. Gunakan 0,5 ml isopropyl alcohol per 1 ml TRIzol Reagent yang
digunakan untuk proses homogenisasi awal. Inkubasi pada suhu 15 – 30oC selama
10 menit dan sentrfugasi dengan kecepatan tidak lebih dari 12.000 g selama 10
menit pada suhu 2 – 8oC. Presipitat RNA tidak terlarut sebelum sentrifugasi,
membentuk pelet seperti gel pada dinding dan dasar mikrotube.
4) Pencucian RNA: Buang supernatan, cuci pelet RNA dengan sekurangnya 1 ml
etanol 75% per 1 ml TRIzol Reagent yang digunakan untuk proses homogenisasi
awal. Kemudian divortex dan disentrifugasi dengan kecepatan tidak lebih dari
7.500 g selama 5 menit pada suhu 2 – 8oC
5) Pelarutan kembali RNA: Pada akhir prosedur, keringkan pelet RNA (kering udara
atau kering vacuum selama 5-10 menit. Jangan mengeringkan RNA dengan
sentrifus vacuum. Jangan membiarkan RNA menjadi kering benar karena akan
menurunkan kelarutannya. Larutkan sampel RNA sehingga mempunyai rasio
A260/280 < 1,6. Larutkan RNA dalam RNase free wáter atau larutan SDS 0,5%
dengan melewatkan larutan beberapa kali ke pelet melalui mikrotip dan
inkubasikan selama 10 menit pada suhu 55-60oC (Hindari penggunaan SDS bila
RNA akan digunakan dalam reaksi enzimatik). RNA dapat juga dilarutkan
kembali dalam 100% formamide (deionized) dan disimpan pada suhu -70oC.
b. Catatan dalam isolasi RNA:
1) Isolasi RNA dari sejumlah kecil sampel jaringan (1-10 mg) atau sel (102-104):
tambahkan 800 µl TRIzol Reagent ke dalam jaringan atau sel. Dilanjutkan proses
lisis sampel, tambahkan chloroform dan berikutnya dengan fase separasi seperti
dijelaskan pada tahap 2). Sebelum presipitasi dengan isopropyl alcohol,
tambahkan 5-10 µg Rnase free glycogen (Cat. No. 10814) sebagai pembawa RNA
pada fase air. Untuk menurunkan viskositas, potong DNA genomik dengan
melewatkannya ke dalam jarum suntik 26G sebelum penambahan chloroform.
Glycogen akan tetap berada di dalam fase air dan terpresipitasi dengan RNA.
Pada konsentrasi glycogen hingga 4 mg/ml tidak mengganggu sintesis rantai
pertama dan tidak menghambat proses PCR.
2) Setelah proses homogenisasi dan sebelum penambahan chloroform, sampel dapat
disimpan pada suhu -60 sampai -70oC selama sekitar 1 bulan. Presipitat RNA
(tahap 4, pencucian RNA) dapat disimpan dalam ethanol 75% selama sekitar 1
minggu pada suhu 2 – 8oC atau selama sekitar 1 tahun pada suhu -5 sampai -20oC.
3) Table-top centrifuge yang dapat mencapai kecepatan maksimum 2.600 g dapat
digunakan dalam protokol ini dengan menambah waktu sentrifugasi menjadi 3060 menit pada tahap 2 dan 3.
c. Reaksi RT-PCR untuk deteksi VNN
1) Komposisi larutan RT-PCR untuk deteksi VNN (25 µl/reaksi) dibuat dengan
mencampurkan bahan-bahan sebagai berikut:
 Akuades steril
13,125 µl
 5XPCR buffer
5
µl
 MgCl2
4
µl
 dNTP Mix
0,5
µl
 Primer VNNF2
0,5
µl
 Primer VNNR3
0,5
µl
 Taq DNA polymerase
0,125 µl
 RNAse Inhibitor
0,125 µl
 AMV Reverse Transcriptase
0,125 µl
 Sampel RNA
1
µl
25
µl
Total volume
2) Banyaknya bahan yang dipersiapkan adalah 1,1 x jumlah sampel.
3) Setelah semua bahan dicampur, kecuali sampel RNA, bagikan ke dalam
mikrotube 0.2 ml dengan volume masing-masing 24 µl.
4) Tambahkan sampel RNA, termasuk kontrol negatif dan kontrol positif.
5) Pengaturan suhu pada thermal cycler adalah sebagai berikut:
 Untuk reaksi reverse trancription, thermal cycler diatur dengan suhu 48oC
selama 45 menit dan 94oC selama 2 menit.
 Selanjutnya untuk proses PCR, thermal cycler diatur dengan suhu denaturasi
95oC selama 30 detik, suhu annealing 54oC selama 30 detik, suhu extention
72oC selama 1 menit. Proses PCR dilakukan sebanyak 25 siklus. Kemudian
dilanjutkan dengan extra extention pada suhu 72oC selama 5 menit. Setelah
proses selesai sampel disimpan pada suhu 4oC.
d. Pengamatan hasil PCR pada gel agarose
1. Masukkan 2 % gel agarose ke dalam elektroforesis
2. Tambahkan larutan TBE ke dalam elektroforesis hingga gel agarose terendam
3. Sampel hasil PCR diambil sebanyak 5 µl dan ditambah dengan loading buffer
sebanyak 1 µl. Campur dengan baik, kemudian disuntikkan ke dalam lubang
sumuran dengan menggunakan mikropipet
4. Setelah semua sampel disuntikkan, pasang tutup elektroforesis dan hidupkan
listrik dengan voltase diatur 150 V
5. Setelah 0,5 jam, proses dihentikan dan gel agarose direndam dalam larutan
ethidium bromide (5 μg/ml) selama 5 menit
6. Kemudian gel agarose direndam dalam akuades selama 10 menit untuk
menghentikan proses pewarnaan
7. Gel agarose diamati di atas UV transilluminator :
 Hasil positif terdeteksi VNN bila terlihat perpendaran pita DNA dengan
ukuran 427 bp
 Hasil negatif VNN bila tidak terlihat perpendaran pita DNA dengan ukuran
427 bp