metode penelitian

METODE PENELITIAN
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan mulai bulan Februari 2005 hingga bulan Maret
2008 di Laboratorium Biologi Molekuler dan Seluler Tanaman dan Laboratorium
BIORIN (Biotechnology Research Indonesia – The Netherlands), Pusat Penelitian
Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi Institut Pertanian Bogor.
Bahan
Bahan tanaman yang digunakan adalah daun dan akar M. malabathricum
L. yang diperoleh dari lahan asam Jasinga, Bogor. Plasmid pGEM®-T-Easy
(Promega) digunakan sebagai vektor pengklonan dan E. coli galur DH5α
digunakan
sebagai
inang
vektor
rekombinan.
Primer
aktin
ActF:TCACCAACTGGGACGACATG dan ActR: TCATGAGGTAGTCAGTCAGGT
digunakan sebagai alat evaluasi cDNA total. Primer spesifik dari gen SNR A.
thaliana
L.
yaitu
snrF:
ATGGATATTGATCACGGCAGA
dan
snrR:
ATAACCACGTCAGG CAAAGG digunakan untuk mengisolasi cDNA MmFSNR.
Metode penelitian
Isolasi dan pengklonan fragmen MmFSNR dilakukan melalui beberapa
tahapan yaitu isolasi RNA total, sintesis cDNA total, isolasi cDNA MmFSNR,
pengklonan cDNA MmFSNR ke dalam vektor, transformasi genetik E. coli dan
analisis MmFSNR.
Isolasi RNA total. RNA total diisolasi menggunakan metode Chang et al.
(1993) yang dimodifikasi. Daun dibuang tulangnya, ditimbang sebanyak 1 gram
lalu ditambah 10 ml buffer 2XCTAB (2% CTAB, 2% PVP 25000, 0.1 M tris pH
9.5, 20 mM EDTA, 1.4 M NaCl, 1% ß-mercaptoetanol dan 0.1% DEPC) yang
sebelumnya telah dihangatkan pada suhu 65ºC, digerus dengan bantuan pasir
kuarsa hingga menjadi serbuk halus. Campuran serbuk daun dan buffer ekstraksi
diinkubasi selama 10 menit pada suhu 65ºC dan digoyang beberapa kali,
diekstraksi dengan 10 ml Kloroform:Isoamilalkohol (24:1) lalu disentrifugasi
pada 10000 rpm pada suhu 4oC (Sorval Ultra Pro 80) selama 10 menit. Bagian atas
cairan (supernatan) dipindahkan ke tabung baru kemudian ditambah ¼ volume
LiCl 10M. Campuran diinkubasi pada suhu -20ºC selama 2.5 jam kemudian
disentrifugasi (Sorvall Ultra Pro 80) pada kecepatan 10000 rpm selama 10 menit
pada suhu 4ºC. Fase cairan dibuang, RNA total yang mengendap disuspensi
dengan 500μl TE 1x (10mM Tris HCl pH 7.4 dan 1 mM EDTA) dan dipindah ke
tabung eppendorf. RNA diekstraksi dengan 1xvolume fenol pH 9, disentrifugasi
pada kecepatan 14000 rpm (Jouan BR4i) selama 10 menit pada suhu 20 ºC.
Suspensi RNA (di bagian atas) dan dipresipitasi dengan penambahan 1 x volume
PCI (25:24:1) dan disentrifugasi pada kecepatan 14000rpm (Jouan BR4i) selama
10 menit pada suhu 20ºC. Supernatan diambil dan dipresipitasi
dengan
penambahan ¼ x volume LiCl 10M dan kemudian diinkubasi selama semalam
pada suhu -20ºC. Untuk mengendapkan RNA total, campuran disentrifugasi pada
kecepatan 14000rpm (Jouan BR4i) selama 10 menit pada suhu 4ºC. Cairan
dibuang dan endapan RNA dibilas dengan penambahan 500μl ethanol 70%
kemudian disentrifugasi pada kecepatan 14000 rpm (Jouan BR4i) selama 10 menit
pada suhu 4ºC. Endapan dikeringkan dengan vacuum dryer selama 15 menit
kemudian diresuspensi dengan H2O yang telah diperlakukan dengan DEPC.
Kuantitas RNA total hasil isolasi ditentukan dengan spektrofotometer UV-VIS
(Cecil CE 2020) pada panjang gelombang 260 nm. Konsentrasi RNA ditentukan
dengan menetapkan satu satuan absorban pada panjang gelombang 260 nm setara
dengan 40 μg/ml RNA. Kemurnian RNA total ditentukan berdasarkan
perbandingan nilai absorban pada panjang gelombang 260 nm dengan 280 nm
(Saunders & Parker 1999). Keutuhan RNA ditentukan berdasarkan elektroforesis
pada gel agarose 1% (FMC, USA) dengan larutan MOPS (4.2g/l MOPs, 0.41 g/l
Na-asetat, 0.37 g/l EDTA (2Na)H2O). RNA sebanyak 1μl dicampur dengan 12 μl
larutan premiks
[MOPS, 50% (v/v) formamide,17.5% (v/v) formaldehid dan
27.5% (v/v) air DEPC] dipanaskan 65 ºC 10 menit, didinginkan di es 5 menit
dan ditambahkan 1/6 x volume loading dye (0.25% bromophenol blue, 0.25%
xylene cyanol FF, 30% gliserol) kemudian dielektroforesis pada 100 volt selama
30 menit. Visualisasi RNA dilakukan pada transiluminator GelDoc (Labquip)
setelah diwarnai dengan EtBr selama 30 menit dan dibilas dengan H2O.
14
Sintesis cDNA total. cDNA total disintesis melalui reaksi transkripsi balik
(ReverseTranscriptase/RT) menggunakan Superscript III Reverse Transcriptase
(Invitrogen). Komposisi sintesis cDNA total adalah 5 μg RNA total, 1x RT buffer,
20 pmol oligodT, 4mM dNTP, 10mM DTT, 40 U Enzim SuperScript TM III RTase
dan dH2O yang telah diperlakukan dengan DEPC hingga volume reaksi mencapai
20μl. Sintesis cDNA dilakukan pada suhu 52°C selama 50 menit. Keberhasilan
terbentuknya cDNA dan kemurnian cDNA diuji dengan menggunakan PCR
dengan primer spesifik aktin. Komposisi reaksi PCR adalah 0.75 μl cDNA total
hasil RT, 1x Buffer taq, 30 mM MgCl2, 3 mM dNTP mix, 15 pmol primer ActF,
15 pmol primer ActR, 4% Me2SO, 0.75 U enzim taq DNA polymerase (Fermentas
Inc.) dan ddH2O dengan volume reaksi 15 μl. PCR dilakukan pada kondisi
praPCR pada 95 °C 5 menit, denaturasi pada 94°C 30 detik, penempelan primer
pada 57°C selama 30 detik dan pemanjangan pada 72° C selama1.5 menit. PCR
dilakukan sebanyak 35 siklus dan pascaPCR dilakukan pada suhu 72°C selama 5
menit. Hasil PCR actin dielektroforesis dalam gel agarose 1.2% dengan larutan
penyangga TAE 1X (4.84 g/l Tris Hydroximetilaminomethan, 0.1142 ml/l asetat
glasial, 2 ml 0.5M EDTA pH 8). Elektroforesis dilakukan pada voltase konstan 50
volt selama 1 jam. Visualisasi hasil elektroforesis dilakukan diatas transiluminator
UV (Hoever) dan difoto menggunakan kamera digital yang dihubungkan ke
komputer
dengan menggunakan program Digidoc. Bila hasil visualisasi
menunjukkan pita ukuran 450bp maka RNA yang digunakan sebagai bahan reaksi
RT murni dan cDNA total tidak terkontaminasi DNA genom sehingga cDNA
total ini dapat digunakan untuk mengisolasi cDNA MmFSNR.
Isolasi cDNA MmFSNR. Reaksi PCR dengan primer spesifik dilakukan
menggunakan cDNA hasil RT dan sepasang primer spesifik untuk snrF dan snrR
yang didisain dari A. thaliana. Campuran PCR terdiri dari 2 μl 10X PCR Buffer
(200mM Tris HCl pH 8.4, 500mM KCl) (Fermentas), 2 μl 25mM MgCl2
(Fermentas), 1 μl 10mM dNTP Mix, 1 μl primer forward (10 pmol), 1 μl primer
reverse (10 pmol), 0.2 μl Taq DNA polymerase (5 Unit/μl),1 μl cDNA (hasil RT)
dan ddH2O hingga volume mencapai 20 μl. PCR dilakukan dengan kondisi praPCR pada 94°C, 5 menit; denaturasi pada 94°C, 30 detik; penempelan primer
pada 55°C , 30 detik; dan pemanjangan pada 72°C, 7 menit sebanyak 35 siklus
15
menggunakan alat PCR (MJ Research TM 100).
Hasil PCR dengan primer
spesifik kemudian diuji dengan elektroforesis.
Pengklonan cDNA MmFSNR kedalam vektor pGEM®-T-Easy. Hasil
sintesis cDNA spesifik dari mRNA Melastoma selanjutnya disisipkan ke dalam
vektor pGEM®-T-Easy (Promega) mengikuti prosedur Promega. Ligasi dilakukan
dengan mencampurkan 1- 3 μl cDNA spesifik dengan 5 μl
Ligation,1μl vektor pGEM®-T-Easy (50ng), 1 μl
buffer 2X Rapid
T4 DNA Ligase (3 Weiss
units/μl), dan ddH2O sampai volume akhir 10 μl. Campuran reaksi diinkubasi
pada 4 OC selama semalam.
Transformasi genetik E. coli. Transformasi E. coli dengan vektor
rekombinan dilakukan
berdasarkan prosedur Suharsono (2002). Satu koloni
bakteri E. coli galur DH5α dikulturkan dalam 2 ml LB cair (10g/l Bacto-tryptone,
5 g/l Yeast extract, 10 g/l NaCl) menggunakan shaking incubator berkecepatan
250 rpm pada suhu 37ºC selama semalam. Kemudian, 200 μl disubkultur dalam
20 ml LB cair
dengan kondisi yang sama hingga OD600=0.4-0.5. Bakteri
dipindahkan ke tabung eppendorf 1.5 ml dan diinkubasi dalam es selama 10 menit
lalu disentrifugasi pada kecepatan 3000rpm (Jouan BR4i) pada suhu 4ºC selama 5
menit. Endapan bakteri disuspensi dalam 495 μl buffer transformasi TB (10mM
PIPES, 15mM CaCl2.2H2O, 250 mM KCl, 55 mM MnCl2.4H2O, pH 6.7) dan
diinkubasi dalam es selama 10 menit kemudian disentrifugasi dengan kecepatan
3000rpm pada suhu 4ºC selama 5 menit. Endapan bakteri ditambah 82.5 μl TB
dan disuspensi dengan hati-hati kemudian ditambah 3.3 μl DMSO dan diinkubasi
di dalam es selama 10 menit sehingga diperoleh bakteri kompeten. Sebanyak
50µl dari bakteri kompeten tersebut dicampur dengan 10µl (50-100ng) DNA
plasmid hasil ligasi dan diinkubasi dalam es selama 25 menit. Campuran
dipanaskan pada suhu 45ºC selama 45 detik dan diinkubasi kembali ke dalam es
selama 5 menit. Campuran ini ditambah 100µl media 2xYT (16g/l Bacto-tryptone,
10g/l Yeast extract, 5 g/l NaCl pH 7.0) dan diinkubasi pada suhu 37ºC selama 20
menit dalam shaking incubator berkecepatan 250 rpm. Bakteri disebar merata
diatas media LB yang mengandung ampicilin menggunakan batang kaca yang
dibengkokkan lalu diinkubasi pada suhu 37ºC selama semalam. Seleksi
transforman rekombinan dilakukan dengan memilih koloni putih yang tumbuh.
16
Analisis cDNA sisipan. Analisis cDNA sisipan dimulai dengan isolasi
plasmid rekombinan. Plasmid diisolasi menggunakan prosedur Suharsono (2002).
Kultur E. coli sebanyak 150 µl ditumbuhkan dalam 15 ml media LB dan
diinkubasi di inkubator bergoyang (250 rpm) pada suhu 37OC semalam. Kultur
bakteri disentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm (Jouan BR4i) pada suhu 4OC
selama 30 menit. Pelet disuspensikan dengan 300μl buffer suspensi (50 mM TrisHCl, pH 7,5 dan 10 mM EDTA). Suspensi bakteri ditambah 300μl buffer lisis
(0,2 M NaOH dan 1% SDS) dan dibolak balik perlahan beberapa kali. Campuran
ditambah 300μl buffer netralisasi (5 M Na-Asetat, Asam asetat glasial, dan H2O
PH 4,8) dan disentrifugasi 13000 rpm pada suhu 4OC selama 20 menit.
Supernatan diambil dan diekstrak dengan 1xvolume PCI (25:24:1), divorteks dan
disentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm pada suhu 4OC selama 2 menit.
Supernatan diambil dan diperlakukan dengan RNAse pada suhu 37OC semalam.
Larutan diekstrak kembali dengan PCI dan disentrifugasi seperti ekstraksi
sebelumnya. Supernatan diambil dengan hati-hati dan ditambahkan 0,1x volume 3
M NaOAc pH 5.2 dan 2x volume EtOH absolut. Larutan diinkubasi selama 2 jam
pada suhu -20 OC dan disentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm pada suhu 4OC
selama 20 menit. Pellet dibilas dengan 1 x volume EtOH 70% dan dikeringkan
dengan alat vakum. DNA kering disuspensikan di 10-20 μl ddH2O.
Analisis
urutan
nukleotida
MmFSNR
dan
protein
MmFSNR.
Pengurutan DNA dilakukan menggunakan DNA Sequencer ABI Prism Model
310 versi 3.7. Identifikasi urutan nukleotida dilakukan menggunakan beberapa
analisis. Analisis kesejajaran lokal fragmen MmFSNR berdasarkan urutan
nukleotida dan asam amino dengan data yang ada di GenBank dilakukan dengan
menggunakan program BLAST (Basic Local Alignment Search Tools) yang
tersedia dalam NCBI (National Center for Biotechnology Information) melalui
akses situs http://www.ebi.ac.uk/BLAST (Mount, 2001). Analisis situs restriksi
dilakukan dengan menggunakan program Bioedit versi 7.0.0 dan NEBCutter
(http://www.firstmarket.com/cutter/cut2.htm). Program Bioedit versi 7.0.0 juga
digunakan untuk melakukan analisis deduksi asam amino dari urutan DNA dan
analisis hidrofobisitas protein MmFSNR yang dibandingkan dengan protein SNR
pada padi dan pada Medicago truncantula.
17