TRANSFORMASI GENETIK TEMBAKAU DENGAN

TRANSFORMASI GENETIK TEMBAKAU DENGAN GEN
BtCspB PENYANDI COLD SHOCK PROTEIN MELALUI
PERANTARA Agrobacterium tumefaciens
SEAGAMES WALUYO
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
PERNYATAAN TESIS DAN SUMBER INFORMASI
SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Transformasi Genetik
Transformasi genetik tembakau dengan gen BtCspB penyandi Cold Shock Protein
melalui Agrobacterium tumefaciens adalah benar karya saya bersama komisi
pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi
mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan
maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan
mencantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini. Dengan ini saya
melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor.
Bogor, Juni 2013
Seagames Waluyo
NRP P051100051
RINGKASAN
SEAGAMES
WALUYO.
Transformasi
genetik
tembakau
dengan
gen BtCspB penyandi Cold Shock Protein Melalui Perantara Agrobacterium
tumefaciens. Dibimbing oleh SUHARSONO dan SUSTIPRIJATNO.
Cold shock protein (Csp) merupakan komponen penting dalam organisme
untuk ketahanan terhadap kondisi cekaman abiotik. Protein ini melindungi RNA
dari kesalahan melipat dari berbagai cekaman abiotik. Gen BtCspB dari Bacillus
thuringensis telah difusikan dengan promoter Ubiquitin di daerah T-DNA dari
pCambia 1300int, dan telah diintroduksikan ke dalam Agrobacterium tumefaciens
LBA4404. Ekspresi berlebihan gen ini di dalam tanaman kemungkinan dapat
meningkatkan toleransi terhadap cekaman abiotik termasuk cekaman dingin,
panas dan kekeringan. Penelitian ini bertujuan untuk melakukan transformasi
genetik tembakau (Nicotiana tabacum L) cv Samsun dengan gen BtCspB dibawah
kendali promoter Ubiquitin dan terminator NosT yang diperantarai
A. tumefaciens.
Potongan daun tembakau diinokulasi melalui metode ko-kultivasi dengan
A. tumefaciens LBA4404 yang membawa pCambia1300int-BtCspB. Penelitian ini
membandingkan pengaruh lama perendaman untuk inokulasi eksplan yaitu 20 dan
30 menit terhadap efisiensi transformasi. Seleksi kalus transgenik dilakukan
dengan menggunakan 20 mg/l dan 50 mg/l higromisin dengan media regenerasi
MS yang mengadung, 1 mg/l BAP dan 0,1 mg/l NAA.
Berdasarkan kalus yang resisten terhadap 50 mg/l higromisin, efisiensi
transformasi antara perendaman 20 menit dan 30 menit pada penelitian ini adalah
relatif sama yaitu 65% dan 57,5%. Analisis PCR menunjukkan bahwa gen
BtCspB di bawah kendali promoter Ubiquitin telah terintegrasi ke dalam genom
tembakau transgenik. Analisis genotipe menunjukkan bahwa gen hpt diwariskan
kepada tembakau generasi T1 dengan mengikuti hukum Mendel. Berdasarkan
analisis khi-kuadrat, rasio tanaman yang resisten dan sensitif terhadap higromisin
pada generasi T1 adalah 3:1 yang menunjukkan bahwa gen hpt yang terintegrasi
kedalam genom tanaman transgenik generasi To adalah satu salinan.
Kata kunci: Tembakau (Nicotiana tabacum), Cold Shock Protein, transformasi
dan A. tumefaciens
SUMMARY
SEAGAMES WALUYO. Transformation Genetic Tobacco with BtCspB Coding
Cold Shock Protein
Agrobacterium Tumefaciens-Mediated.Supervised by
SUHARSONO and SUSTIPRIJATNO.
Cold shock protein (Csp) is essential for organisms to survive in the
abiotic stress condition. It protects RNA from misfolding caused by various
abiotic stresses. BtCsp gene had been isolated from Bacillus thuringiensis, fused
to promoter of ubiquitin in the T-DNA of pCambia 1300int, and introduced into
Agrobacterium tumefaciens LBA4404. We suppose that plant overexpressing this
gene would be tolerant to abiotic stress including cold heat and drought stress.
This research had an objective to transform genetically Nicotiana tabacum cv
Samsun by BtCsp gene under the control of pUbiquitin promoter and NosT
terminator mediated by A. tumefaciens.
Leaf disks were inoculated by the method of co-cultivation with
A. tumefaciens LBA4404 harboring pCambia1300int-BtCspB. We compared the
effect of shoaking time between 20 and 30 minutes on the transformation
efficiency. The transformation calli were selected on the medium containing
20 mg/l and 50 mg/l hygromcin and regenerated on MS medium containing
1 mg/l BAP and 0,1 mg/L IAA.
Based on resistant calli to 50 mg/l hygromicin, the efficiency of
transformation between 20 and 30 minutes was selatively equal i.e 65% and
57.5% respectively. PCR analaysis showed that BtCspB gene under the control of
Ubquitin promoter is integrated into N. tabacum genome of To generation.
Genetic analysis showed that hpt gene was inherited to the progeny T1 generation
following Mendalian law. Based on chi-square analysis, the ratio of resistant and
sensitive plant To hygromycin in T1 generation was 3:1, indicating that only one
copy of hpt gene was integrated into the genome of transgenic plant in To
generation.
Keywords: Tobacco (Nicotiana tabacum), Cold Shock Protein, Transformation,
and A. tumefaciens mediated
©Hak Cipta Milik IPB Tahun 2013
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya tulis ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik,
atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan
kepentingan IPB.
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apapun tanpa izin IPB.
TRANSFORMASI GENETIK TEMBAKAU DENGAN GEN
BtCspB PENYANDI COLD SHOCK PROTEIN MELALUI
PERANTARA Agrobacterium tumefaciens
SEAGAMES WALUYO
Tesis
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains pada
Program Studi Bioteknologi
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
7
Penguji Luar Komisi: Dr. Ir. Utut Widyastuti, MSi
Judul Tesis : Transfonnasi Genetik Tembakau dengan Gen BtCspB Penyandi
Cold Shock Protein Melalui Perantara Agrobacterium tumefaciens
: Seagames Waluyo
Nama
NIM
: P051100051
Disetujui oleh Komisi Pembimbing Prof. Dr. Jr. Suharsono, DEA
Ketua
Dr. Sustiprijatno, MSc
Anggota
Diketahui oleh
Ketua Program studi Bioteknologi
Prof. Dr. Jr. Suharsono, DEA
Tanggal Ujian: 25 Juni 2013
Tanggal Lulus:
2 3 JUL 2013
8
Judul Tesis : Transformasi Genetik Tembakau dengan Gen BtCspB Penyandi
Cold Shock Protein Melalui Perantara Agrobacterium tumefaciens
Nama
: Seagames Waluyo
NIM
: P051100051
Disetujui oleh
Komisi Pembimbing
Prof. Dr. Ir. Suharsono, DEA
Dr. Sustiprijatno, MSc
Ketua
Anggota
Diketahui oleh
Ketua Program studi Bioteknologi
Dekan Sekolah Pascasarjana
Prof. Dr. Ir. Suharsono, DEA
Dr. Ir. Dahrul Syah, MScAgr
Tanggal Ujian: 25 Juni 2013
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah Subhanahu Wa Ta’ala
atas segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Topik
yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Juni 2012 sampai
dengan Febuari 2013 ini ialah rekayasa genetik tanaman, dengan judul
Transformasi genetik tembakau dengan gen BtCspB penyandi cold shock protein
melalui perantara Agrobacterium tumefaciens. Terima kasih penulis ucapkan
kepada Prof. Dr. Ir. Suharsono, DEA dan Dr. Sustiprijatno, MSc selaku
pembimbing atas segala perhatian dan bimbingannya selama penelitian dan
penulisan naskah tesis. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada
Dr. Ir. Utut Widyastuti, MSi selaku penguji luar komisi atas kritik dan saran
terhadap tesis ini. Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr.Tri Joko Santoso yang
telah memberikan materi genetik berupa Agrobacterium tumefaciens yang
membawa pCAMBIA1300int-BtCspB dan Prof. Dr. Ir. Suharsono, DEA yang
memberikan materi genetik berupa benih tembakau cv Samsun. Penghargaan
penulis sampaikan kepada Kepala Balai Besar Penelitian dan Pengembangan
Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian (BB-Biogen) dan Kepala
Laboratorium Molekuler BB-Biogen yang telah memberikan izin untuk penelitian
di Balai Besar Sumber Daya Genetik dan Bioteknologi Pertanian (BB-Biogen),
grup riset gandum yang telah membantu penelitian hingga selesai, teman-teman
PS Bioteknologi IPB angkatan 2010, dan Kost Baristar atas motivasinya. Kepada
Rikno Harmoko, MSc, Bernet Agung Saputra, SP, Rhyza Aditia Priatama, SSi
penulis mengucapkan trimakasih atas bantuannya dalam mendapatkan beberapa
artikel dari jurnal yang akses terbatas. Ungkapan terima kasih juga disampaikan
kepada ayah, ibu, dan seluruh keluarga serta Selvi Ariyunita, SSi atas doa,
semangat dan kasih sayangnya.
Semoga karya tulis ini bermanfaat
Bogor, Juni 2013
Seagames Waluyo
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
DAFTAR GAMBAR
DAFTAR LAMPIRAN
vi
vi
vi
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Tujuan Penelitian
1
1
2
TINJAUAN PUSTAKA
Protein yang terinduksi panas
Transformasi Diperantarai Agrobacterium tumefaciens
Kultur In Vitro Tembakau
3
3
4
4
METODE
Bahan Penelitian
Metode Penelitian
Konfirmasi gen BtCspB menggunakan analisis PCR koloni
Konfirmasi gen BtCspB menggunakan enzim ristriksi
Persiapan bahan tanam dan Agrobacterium tumefaciens
Inokulasi, kokultivasi, seleksi dan regenerasi
Analisis molekuler tembakau transgenik To dengan PCR
Analisis pewarisan gen hpt ke generasi T1
Analisis molekuler tembakau transgenik T1 dengan PCR
5
5
6
6
6
6
7
8
8
HASIL DAN PEMBAHASAN
Transformasi genetik tembakau L. Samsun
dengan gen BtCspB
Analisis molekuler tembakau transgenik To dengan PCR
Analisis pewarisan gen hpt di dalam tembakau transgenik
9
9
12
14
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran
17
17
DAFTAR PUSTAKA
RIWAYAT HIDUP
18
25
DAFTAR TABEL
1
2
3
4
Jumlah eksplan yang membentuk kalus di media seleksi
Jumlah tunas yang dihasilkan dari kalus yang resisten higromisin
di media regenerasi yang mengandung 50 mg/l higromisin
Hasil PCR dengan primer UbiQF dan CspR2 pada
tanaman tembakau T1
Jumlah tembakau yang resisten dan sensitif terhadap
higromisin dari generasi T1 dengan pola segregasi gen hpt
10
12
13
15
DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
5
6
Peta daerah T-DNA pada plasmid pCambia 1300int-BtCspB
Konfirmasi keberadaan gen BtCspB di dalam A. tumefaciens
Perakitan tanaman tembakau transgenik yang
mengandung gen BtCspB
Hasil PCR dengan primer UbiQF dan CspR, dan aktinF dan aktinR
Uji resistensi tembakau populasi T1 terhadap higromisin
Hasil PCR dengan primer UbiQF dan CspR2
5
9
11
13
14
16
DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
Larutan stok Murashige dan Skoog (MS)
Media LB (Lauria Bertani)
Media YEP (yeast extract pepton)
22
23
24
1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Cekaman lingkungan seperti salinitas, kekeringan, dingin dan panas
merupakan faktor pembatas pertumbuhan dan perkembangan tanaman. Indonesia
diprediksi pada tahun 2060 terjadi peningkatan suhu lingkungan 70-99% (Bastiti
& Naylor 2009). Peningkatan panas menyebabkan evapotranspirasi meningkat
sehingga menyebabkan cekaman ikutan seperti kekeringan dan salin (Taiz &
Zeiger 2002). Cekaman panas dapat menurunkan produksi hasil panen hingga
70%. Peningkatan suhu dapat terjadi di dalam tanah dan udara baik pada siang
maupun malam (Acquaah 2007).
Tanaman mempunyai respon berbeda terhadap cekaman panas. Toleransi
tanaman terhadap cekaman panas berbeda, seperti tembakau dan jagung
mempunyai titik kritis pada 49-51ºC selama 10 menit, dan tanaman tomat pada
suhu 45ºC Selama 10 menit (Nguyen 2008). Cekaman panas menyebabkan proses
fotosintesis dan metabolisme sel terganggu hingga saat terjadi cekaman akut
menyebabkan kematian sel (Carmer et al. 2011). Pada tingkat molekul, cekaman
panas menyebabkan terganggunya proses translasi.
Cekaman panas menyebabkan kesalahan melipat pada RNA dan protein.
RNA mempunyai struktur utas tunggal sehingga mempunyai fleksibilitas tinggi.
Cekaman panas menginduksi kesalahan melipat RNA sehingga menghambat
efisiensi penerjemahan mRNA (Chaikam & Karlson 2009). Cekaman panas
mengakibatkan ujung 5’mRNA di daerah Shine Dalgarno mudah melipat
(Chowdhury et al. 2006). Cekaman panas juga menyebabkan kesalahan dalam self
splicing dan pelipatan RNA (Herschlag 1995; Kang et al. 2013).
Banyak bakteri mempunyai kemampuan adaptasi yang luas pada kondisi
cekaman panas. Bakteri ini mempunyai kemampuan untuk melindungi RNA
dengan protein RNA-Chaperone. RNA-chaperone mempunyai banyak jenisnya
seperti SptA (Splicing-deficient group-I-intron), NCp7 (Nucleocapsid protein),
La protein, Hfq protein dan Cold Shock Protein (Csp) (Schroeder et al. 2004).
Secara alami, keberadaan Csp berlimpah pada semua organisme bakteri,
virus, hewan dan tanaman (Schroeder et al. 2004). Gen Csp telah ditemukan pada
Bacillus subtilis (Willimsky et al. 1992), Escherichia coli (Yamanaka et al. 1999),
gandum (Nakaminami et al. 2004), dan Arabidopsis thaliana (Kim et al. 2009;
Park et al. 2009). Gen Csp mampu diekspresikan pada kondisi panas dan dingin
(Castiglioni et al. 2008). Secara in vitro protein CspB dari B. caldolyticus dan
B. subtilis masing-masing mempunyai suhu Tm 76,9 dan 53,6˚C (Perl et al.
2000). Gen Csp telah berhasil diintroduksikan ke dalam genom A. thaliana, padi
dan jagung yang menghasilkan tanaman transgenik yang mampu bertahan
terhadap cekaman dingin, panas, dan kekeringan (Castiglioni et al. 2008). Protein
BsCspB dan WCsp ditemukan di sitoplasma, retikulum endoplasma (ER) dan
intisel (Castiglioni et al. 2008 & Nakaminami et al. 2004).
Saat ini, gen CspB dari B. thuringensis telah berhasil disisipkan kedalam
pCambia 1300int di bawah kendali promoter Ubiquitin membentuk plasmid
pCambia1300int-BtCspB. Plasmid pCambia1300int-BtCspB ini telah berhasil
dimasukkan kedalam Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (Santoso et al, data
2
tidak dipublikasikan). Untuk menguji peranan gen BtCspB dalam toleransi
tanaman terhadap cekaman panas, maka gen ini diintroduksikan ke dalam genom
Nicotiana tabaccum.
Tanaman A. thaliana, N. tabaccum, N. bentamiana, dan Oryza sativa sub
spesies japonica untuk merupakan tanaman yang digunakan sebagai tanaman
model untuk transformasi genetik. Keberhasilan transformasi genetik tembakau
telah digunakan untuk berbagai tujuan seperti mengungkap regulasi sistem biologi
tanaman (Langbecker et al. 2004), bioremediasi untuk merkuri (He et al. 2001)
dan tanaman model untuk pengujian cekaman biotik (Waigmann et al. 2000) dan
abiotik (Rizhsky et al. 2002).
Eksplan yang digunakan untuk transformasi genetik dapat berupa daun
muda (Jones 1996; Su et al. 2012) dan suspensi sel (An 1985; Mayo et al. 2006).
Setiap bagian tanaman mempunyai sifat totipotensi untuk menjadi tanaman utuh
(Quiroz-Figueroa et al. 2006). Tembakau sebagai tanaman model mempunyai
kelebihan yaitu mudah dibiakkan secara in vitro, cepat tumbuh dan merupakan
inang alami bagi A. tumefaciens (Mayo et al. 2006).
Agrobacterium tumefaciens mempunyai kemampuan mentransfrer T-DNA
ke dalam genom tanaman. Secara alami, A. tumefaciens menyebabkan tumor
tanaman dikarenakan pada bagian T-DNA terdapat gen penyandi auksin dan
sitokinin (Wood et al. 2001). Banyak tanaman yang menggunakan A. tumefaciens
untuk transformasi genetik seperti Pinus taeda L (Wei 2001), tembakau (Mayo et
al. 2006), A. thaliana (Zhang et al. 2006), padi (Nishimura et al. 2006; Hiei &
Komari 2008), jagung (Ishida et al. 2007), dan bunga matahari (Manabella &
Chan 2009).
Tujuan penelitian
Penelitian ini
bertujuan
untuk mendapatkan tanaman tembakau
transgenik yang mengandung gen BtCspB di bawah kendali promoter Ubiquitin.
2 TINJAUAN PUSTAKA
Protein yang Terinduksi Panas
Organisme memiliki mekanisme ketahanan terhadap cekaman panas
dengan mengekspresikan gen spesifik seperti protein chaperone seperti HSP
(Heat shock protein) (HSP100, HSP90, HSP70, HSP60 dan small HSPs (sHSPs)
(Shanker & Venkateswarlu 2011) dan RNA-chaperone (Schroeder et al. 2004)
yang terdapat di semua organism. Pada tanaman tembakau, gen yang ekspresinya
terinduksi oleh panas adalah gen penyandi thioredoxin peroxidase, dan ascorbate
peroxidase (Rizsky et al. 2002), glycinebetaine, isoprene, omega-3 fatty acid
desaturase (LeFAD7) (Shanker & Venkateswarlu 2011), phytochrome-interacting
factor 4 (PIF4) dan small auxin up RNA (SAUR) pada Arabidopsis (Franklin et
al. 2011). Gen SbDREB2A dan ZmDREB2A diinduksi pada kondisi kekeringan,
salinitas, dingin dan panas, OsDREB2B diinduksi pada kondisi dingin dan panas,
DvDREB2A diinduksi pada kondisi kekeringan panas dan dingin dan gen
CarNAC5 diinduksi oleh kekeringan dan panas (Shanker & Venkateswarlu 2011).
Cekaman panas berdampak negatif pada RNA yang menyebabkan
kesalahan melipat (Holcik & Sonenberg 2005). Pada kondisi in vitro, 90-100%
RNA mengalami inaktivasi karena kesalahan melipat. Pada phage T4 kesalahan
melipat juga dialami oleh gen thymidylate synthase (td) pada pembentukan
pre-mRNA (Schroeder et al. 2004). Sel mempunyai sistem pertahanan yang
diakibatkan oleh kesalahan melipat RNA yaitu melalui protein RNA-chaperone.
Protein chaperone membantu RNA untuk melepaskan kesalahan melipat
sehingga RNA melipat dengan benar. SptA (Splicing-deficient group-I-intron),
NCp7 (Nucleocapsid protein), La protein, Hfq protein dan Cold Shock Protein
(Csp) merupakan jenis protein yang mempunyai aktivitas RNA-chaperone
(Schroeder et al. 2004). RNA-chaperone menjalankan fungsinya tidak
membutuhkan ATP (Adenosine Triphospate) (Castiglioni et al. 2008).
CSP merupakan salah satu protein yang mempunyai aktifitas
RNA-chaperone. Protein ini mempunyai selektifitas rendah sehingga semua jenis
RNA dapat berinteraksi. Protein Csp mempunyai peranan penting dalam proses
transkripsi, translasi dan pembentukan ribosom (Castiglioni et al. 2008).
Gen Csp terdapat di semua organisme dan virus. Gen Csp telah berhasil
diidentifikasi pada berbagai organisme seperti B. subtilis (Willimsky et al. 1992),
E. coli (Yamanaka et al. 1999), gandum (Nakaminami et al. 200), dan A. thaliana
(Kim et al. 2009; Park et al. 2009). Daerah CSD (Cold shock domain) B. subtilis
mempunyai panjang 200 bp yang menyandikan 67 asam amino dengan berat
molekul 7,37 kDa (Willimsky et al. 1992).
Perl et al. (2000) dan Castiglioni et al. (2008), telah membuktikan bahwa,
protein CSP B. subtilis mampu bekerja pada berbagai kondisi lingkungan ekstrim.
Secara in vitro Csp dari B. caldolyticus dan B. subtilis mampu bertahan pada
kondisi dingin dan panas dengan suhu Tm masing-masing 76,9ºC dan 53,6˚C
(Perl et al. 2000). Introduksi gen Csp telah berhasil pada A. thaliana, padi dan
jagung yang menghasilkan tanaman transgenik yang mampu bertahan hidup
terhadap cekaman dingin, panas, dan kekeringan (Castiglioni et al. 2008). Protein
4
BsCspB berlokasi di sitoplasma, retikulum endoplasma (ER) dan inti sel
(Castiglioni et al. 2008 & Nakaminami et al. 2006).
Transformasi Diperantarai Agrobacterium tumefaciens
Konsorsium genom A. thumefaciens telah berhasil melakukan perunutan
genom penuh A. tumefaciens C58 (Wood et al. 2001 dan Goodner et al. 2001).
A. tumefaciens berkerabat dengan Sinorhizobium meliloti dan Mesorhizobium loti
(Wood et al. 2001). Keseluruhan genom A. tumefaciens yang berukuran 567 Mbp
mengandung 5400 gen dengan dengan 64% gen fungsional putatif, dan 24%
merupakan gen baru (Goodner et al. 2001). Regulasi dan interaksi antar protein
berjalan dengan dinamis untuk T-DNA tersisip kedalam genom tanaman inang
(Goodner et al. 2001).
Transfer T-DNA ke dalam tanaman inang merupakan proses yang
kompleks. Proses transfer T-DNA dimulai dari terinduksinya gen-gen vir oleh
senyawa fenolik yang mengaktifkan vir A, sehingga menyebabkan terjadinya
fosforilasi kemudian mengaktifkan protein virG. Gen vir D, E dan F diaktifkan
oleh protein virG. VirD1 betugas memotong T-DNA kemudian virD2 menempel
pada bagian 5’ yang membawanya menuju sitosol sel inang (Ciftci 2012). T-DNA
dalam sitosol membentuk protein kompleks virE2-VIP1 (Dafny-Yelin et al.
2008). Kompleks protein virE2 berinteraksi dengan leucine zip (bZIP) dan
bertindak sebagai adaptor sehingga dapat berinteraksi dengan kromatin. Kompleks
virE2 dilepaskan protein virF untuk teritegrasi ke dalam genom inang (DafnyYelin et al. 2008). T-DNA dintegrasikan acak pada daerah untai ganda
pemotongan DNA (DSB) (Tzfira et al. 2004).
Kultur In Vitro Tembakau
Keberhasilan transformasi tembakau ditunjang dengan kestabilan kultur
in vitro tembakau. Setiap bagian tembakau mempunyai sifat totipotensi untuk
menjadi tembakau utuh (Quiroz-Figueroa et al. 2006). Media dasar MS (Murasige
dan Skoog 1962) dengan kombinasi auksin dan sitokinin berhasil digunakan
untuk regenerasi tembakau in vitro. Keberhasilan regenerasi dapat digunakan
untuk mendapatkan tembakau transgenik dengan gen-gen tertentu.
Tembakau transgenik dapat dihasilkan dari berbagai eksplan seperti
potongan daun (Jones 1996; Su et al. 2012) dan suspesi sel (An 1985; Mayo et al.
2006). Eksplan tersebut ditumbuhkan pada media in vitro untuk menghasilkan
tanaman transgenik. Media regenerasi sering berfungsi juga sebagai media seleksi
dengan penambahan agen seleksi. Agen seleksi disesuaikan dengan gen ketahanan
terhadap antibiotik yang terdapat di T-DNA (Rahmawati 2003), seperti
hpt (hygromycin phosphotransferase), pmi (phosphomannose-isomerase),
nptII (neomycin phosphotransferase), bar (phosphoinothricin acetyl transferase)
(Hiei & Komari 2008). Antibiotik yang digunakan ini bersifat racun bagi eksplan
non transgenik sehingga tunas yang dihasilkan dari eksplan yang hidup
merupakan tunas transgenik putatif. Perolehan tanaman transgenik yang
mengandung gen penanda seleksi menjadi faktor penting untuk mendapatkan
tanaman transgenik yang mengandung gen sasaran (Miki & McHugh 2004).
3 BAHAN DAN METODE
Bahan Penelitian
Tanaman
tembakau
cv
Samsun
yang
diperoleh
dari
Prof. Dr. Ir. Suharsono, DEA (Institut Pertanian Bogor, Bogor) digunakan sebagai
tanaman yang ditransformasi. Agrobacterium tumefaciens LBA4404 yang
mengandung pCambia1300Int-BtCspB digunakan sebagai perantara untuk
transformasi genetik tembakau. Selain mengandung Csp, plasmid ini juga
mengandung gen penanda seleksi hptII (Gambar 1) (Santoso et al, data tidak
dipublikasikan).
Primer CspF: 5’-ACG TTA GCA GCT
TGT GGT C -3’ dan
CspR1:3’-GCG GTA CCT TAC GCT TCT TTA GTA ACG TTA GCA-5’
digunakan untuk verifikasi gen BtcspB di dalam A. thumefaciens LBA4404.
Primer UbiQF: 5’-TGA TGG CCC TGC CTT CAT ACG-3’ dan CspR2: 3’-ACG
TTA GCA GCT TGT GGT C-5’ digunakan untuk menganalisis integrasi gen
BtCspB di dalam tanaman tembakaau transgenik. Posisi primer CspF dan CspR1
adalah di kedua ujung gen Csp yang berukuran 200 pb dan posisi primer UbiQF
dan CspR2 berada di ujung promoter Ubiquitin dan gen Csp yang berukuran 287
pb di daerah T-DNA. Posisi keempat primer tersebut disajikan pada gambar 1.
Gambar 1. Peta daerah T-DNA pada plasmid pCambia 1300int-BtCspB (Santoso et al,
data tidak dipublikasikan). RB = right border; Nos-T = terminator napoline
sythase; Csp = Cold Shock Protein; Ubi-P = Promoter ubiquitin; CaMV-P =
Promoter CaMV; CaMV-T= terminator CaMV.
Penelitan ini menggunakan media dasar MS (Murashige & Skoog 1962,
Lampiran 1) yang digunakan untuk kultur in vitro tanaman, LB (Lampiran 2)
digunakan untuk kultur E. coli dan YEP (Lampiran 3) digunakan untuk kultur A.
thumefaciens.
Metode Penelitian
Penelitian ini terdiri atas dua tahap yaitu: 1) perakitan tembakau transgenik
menggunakan potongan daun sebagai eksplan, dan 2) analisis tembakau
transgenik. Perakitan tembakau transgenik putatif menggunakan dua perlakuan
lama perendaman eksplan dengan A. tumefaciens yaitu 30 dan 20 menit. Analisis
tembakau transgenik meliputi analisis integrasi transgenik digenom tanaman
dengan PCR dan analisis pewarisan gen hptII untuk mengetahui keturunan
tembakau transgenik BtCspB.
6
Konfirmasi gen BtCspB menggunakan analisis PCR koloni
Amplifikasi gen BtCspB di dalam koloni A. tumefaciens LBA 4404
pCambia1300int- BtCspB menggunakan primer CspF dan CspR1. Komposisi
PCR terdiri atas 1 koloni tunggal, 1x buffer PCR, 10 mM dNTP mix, 25 pmol
setiap primer UbiQF dan CspR, dan 1 unit Taq polymerase (Generay Biotech) dan
ddH2O hingga volume total reaksi 20 µl. PCR dilakukan di dalam mesin thermal
cycler (MJ Research Tetrad) dengan program PCR yang terdiri atas denaturasi
94°C selama 30 detik, penempelan 63°C selama 15 detik, pemanjangan 72°C
selama 30 detik dengan 20 siklus. Hasil amplifikasi PCR yang dimigrasikan di
gel agarose di dalam larutan penyangga 1×TAE (40 mM Tris, 20 mM asam asetat,
dan 1 mM EDTA) selama 30 menit kemudian direndam dalam larutan EtBr
(Etidium Bromida) selama 10 menit dibilas dengan H2O dan diamati di bawah
lampu UV.
Konfirmasi gen BtCspB menggunakan enzim ristriksi
Satu koloni E. coli yang mengandung pCambia1300Int-BtCspB
ditumbuhkan di dalam 5 ml media LB (Lauria Bertani, Lampiran 2) cair yang
mengandung 30 mg/l kanamisin pada suhu 37ºC selama 12 jam pada shaker
dengan kecepatan 150 rpm. Plasmid diisolasi dengan menggunakan metode alkali
(Sambrook et al. 2003). pCambia1300int-BtCspB dipotong dengan enzim restriksi
BamHI dan KpnI. Komposisi reaksi pemotongan pCambia 1300intr-BtCspB
terdiri atas 200 ng DNA plasmid, 1x buffer BamHI, 1x buffer KpnI, 10 unit
BamHI dan 10 unit KpnI dalam 50 µl volume total. Reaksi pemotongan diinkubasi
di suhu 37 ºC selama 3 jam. Hasil pemotongan dimigrasikan di gel agarose di
dalam larutan penyangga 1×TAE selama 30 menit kemudian direndam di dalam
larutan EtBr (Etidium Bromida) selama 10 menit, dibilas dengan H2O dan
diamati di bawah lampu UV.
Persiapan bahan tanam dan Agrobacterium tumefaciens
Biji tembakau cv Samsun disterilisasi dengan 5% NaOCl selama 1 menit
kemudian dicuci dengan air steril. Biji ditumbuhkan pada media Murashige &
Skoog (1962) selama 10 minggu. Daun dipotong dengan ukuran 5 x 10 mm,
kemudian dipre-kultur selama 1 jam di media prekultur (MS mengandung 1 mg/l
BAP, 0,1 mg/l IAA dan 300 µM asetosiringon). Potongan daun ini digunakan
sebagai eksplan.
Koloni tunggal A. tumefaciens LBA 4404 yang mengandung
pCambia1300intr-BtCspB ditumbuhkan di dalam 5 ml media YEP (yeast extract
pepton, Lampiran 3) yang mengandung 50 mg/l kanamisin dan 30 mg/l
rifampisin, kemudian dikocok di shaker pada kecepatan 150 rpm pada suhu 28ºC
selama 2 hari. Bakteri disegarkan dengan menumbuhkan 5 µl suspensi bakteri di
dalam 50 ml media dengan kondisi yang sama hingga OD600=0,5.
Inokulasi, kokultivasi, seleksi dan regenerasi
Inokulasi dilaksanakan dengan merendam eksplan tembakau dalam
suspensi A. tumefaciens selama 30 menit atau 20 menit. Setelah inokulasi eksplan
diletakkan di atas kertas saring hingga kering, kemudian eksplan ditanam di
7
media kokultivasi (MS yang mengandung 1 mg/l BAP, 0,1 mg/l IAA dan 300 µM
asetosiringon) dan diinkubasi pada kondisi gelap selama 3 hari.
Eksplan dari media kokultivasi dicuci dengan media MS kemudian
ditanam pada media induksi kalus yang juga merupakan media seleksi yaitu MS
yang mengandung 1 mg/l BAP, 0,1 mg/l IAA, 20 mg/l higromisin B, 100 mg/l
vancomisin dan 400 mg/l cefotaksim. Kalus yang tumbuh kemudian dipindahkan
ke media regenerasi yaitu MS tanpa ZPT (Zat pengatur tumbuh) yang
mengandung 50 mg/l higromisin dan 250 mg/l cefotaksim. Tunas yang muncul
dipisahkan dari kalus dan ditanam pada media perakaran yaitu MS yang
mengandung 50 mg/l higromisin. Tunas yang berakar dipindahkan ke media tanah
di dalam pot dan ditempatkan di rumah kaca.
Analisis molekuler tembakau transgenik To dengan PCR
DNA total diisolasi dari daun tanaman in vitro yang berumur 10 minggu
dengan metode Dellaporta et al. (1983). DNA dilarutkan dalam ddH2O.
Konsentrasi DNA diukur dengan menggunakan Thermo scientific NanoDrop
2000. DNA diencerkan hingga konsentrasinya 100 ng/µl yang digunakan untuk
analisis molekuler dengan PCR.
Amplifikasi DNA transgen dilakukan dengan PCR menggunakan primer
UbiQF dan CspR2. Amplifikasi DNA aktin dengan PCR untuk mengetahui
adanya DNA total tanaman dilakukan dengan primer aktin F: 5’-CCT CTT AAC
CCG AAG GCT AA-3’; aktin R: 5’-GAA GGT TGG AAA AGG ACT TC-3’
(Salkol et al. 2007).
Komposisi PCR untuk mengetahui integrasi promoter Ubiquitin dan gen
BtCspB terdiri atas 500 ng DNA total, 1x buffer PCR, 10 mM dNTP mix, 25 pmol
setiap primer UbiQF dan CspR2, 1 unit Taq polymerase (Generay Biotech)
ditambah ddH2O hingga volume total reaksi 20 µl. PCR dilakukan di dalam mesin
thermal cycler (MJ Research Tetrad) dengan program PCR yang terdiri atas
denaturasi 94°C selama 30 detik, penempelan 55°C selama 15 detik, pemanjangan
72°C selama 30 detik dengan 20 siklus.
Komposisi reaksi PCR untuk gen aktin terdiri atas 500 ng DNA total, 1x
buffer PCR, 10 mM dNTP mix, 25 pmol setiap primer aktinF dan aktinR, 1 unit
taq polymerase (Generay Biotech) dan ditambahi ddH2O hingga volume total 20
µl. PCR dilakukan di dalam mesin thermal cycler (MJ Research Tetrad) dengan
program PCR yang terdiri atas denaturasi 94°C selama 30 detik, penempelan 60°C
selama 30 detik, pemanjangan 72°C selama 30 detik dengan 30 siklus. Hasil
amplifikasi PCR dimigrasikan di gel agarose di dalam larutan penyangga 1×TAE
selama 30 menit kemudian direndam dalam larutan EtBr (Etidium Bromida)
selama 10 menit dibilas dengan H2O dan diamati di bawah lampu UV.
Analisis pewarisan gen hpt ke generasi T1
Tembakau transgenik To yang ditumbuhkn di rumah kaca dibuat
menyerbuk sendiri dengan melakukan isolasi. Biji yang dihasilkan dari tembakau
transgenik To adalah biji T1. Biji tembakau transgenik T1 disterilisasi dengan
perendaman di dalam 5% NaOCl selama 1 menit kemudian dicuci dengan 30%
ethanol (v/v) selanjutnya dengan air steril. Biji kemudian disebar pada media MS
8
yang mengandung 50 mg/l higromisin selama 21 hari, kemudian kecambah yang
hidup dan mati dihitung. Kecambah yang hidup adalah yang resisten higromisin
dan yang mati adalah yang sensitif. Analisis khi-kuadrat (chi-square) dilakukan
untuk menentukan rasio kecambah resisten dan kecambah sensitif.
Analisis molekuler tembakau transgenik T1 dengan PCR
DNA total diisolasi dari kecambah tembakau in vitro yang berumur 5
minggu dengan metode Dellaporta et al. (1983). DNA dilarutkan dalam ddH2O.
DNA diencerkan 1/10 (v/v) dari DNA total kemudian dilakukan analisis
molekuler dengan PCR. Analisis integrasi gen Csp dibawah promoter Ubiquitin
dilakukan seperti pada tanaman To.
4 HASIL DAN PEMBAHASAN
Transformasi genetik tembakau L Samsun
Untuk memastikan bahwa A. tumefaciens yang akan digunakan untuk
menginokulasi potongan daun tembakau mengandung gen BtCspB, maka PCR
dilakukan terhadap koloni bakteri ini (Gambar 2A) dengan menggunakan primer
CspF dan CspR1. Hasil PCR menunjukkan bahwa A. tumefaciens mengandung
gen Csp (Gambar 2B). Hasil ini dikonfirmasi dengan memotong plasmid
pCambia1300Int-BtCspB yang diisolasi dari koloni tersebut dengan enzim
restriksi BamHI dan KpnI. Pemotongan plasmid menggunakan kedua enzim
tersebut menghasilkan fragmen berukuran 200 pb (Gambar 2C) sesuai dengan
yang diperkirakan. Hasil ini menunjukkan bahwa A. tumefaciens mengandung
plasmid pCambia1300Int-BtCspB dan dapat digunakan untuk mengintroduksikan
gen BtCspB ke dalam tanaman tembakau.
M 1
2
M
1
200 bp
(A)
(B)
(C)
Gambar 2. Konfirmasi keberadaan gen BtCspB di dalam A. tumefaciens. A= Biakan
A. tumefaciens di media YEP padat. B= Hasil PCR koloni, M= marker
1 kb plus, 1= A. tumefaciens yang mengandung pCambia1300Int,
2= A. tumefaciens yang mengandung pCambia1300Int-BtCspB. C= hasil
pemotongan pCambia1300Int-BtCspB dengan enzim restriksi BamHI dan
KpnI, M= 1 kb plus, 1= pCambia1300Int-BtCspB yang dipotong BamHI
dan KpnI.
Transformasi genetik tembakau kultivar Samsun dilakukan dengan
menggunakan eksplan yang berupa potongan daun. Potongan daun yang telah
diinokulasi dengan A. tumefaciens ditanam pada media penginduksi kalus yang
sekaligus berfungsi sebagai media seleksi. Pada media induksi kalus yang
mengandung 20 mg/l higromisin (atau seleksi I), dari 40 eksplan yang diinokulasi
dengan waktu perendaman 30 menit menghasilkan 27 eksplan (atau 67,5%) yang
tumbuh membentuk kalus. Hasil ini tidak berbeda dengan eksplan yang direndam
20 menit yang menghasilkan 28 eksplan (atau 70%) yang membentuk kalus. Pada
media yang sama, semua eksplan yang sebelumnya tidak diinokulasi oleh
A. tumefaciens tidak membentuk kalus dan mengalami kematian pada minggu
10
ketiga (Tabel 1). Hal ini menunjukkan bahwa 20 mg/l higromisin dapat digunakan
untuk membedakan kalus transgenik dan non-transgenik.
Tabel 1. Jumlah eksplan yang membentuk kalus di media seleksi
Jumlah eksplan yang membentuk kalus yang
hidup di
Jumlah
Perlakuan*
eksplan
Seleksi I
Seleksi II
(20 mg/l higromisin)
(50 mg/l higromisin)
Diinokulasi 30 menit
40
27 (67,5%)
23 (57,5%)
Diinokulasi 20 menit
40
28 (70%)
26 (65%)
Tidak diinokulasi
20
0
0
Tidak diinokulasi**
20
20
20 (100%)
*diinokulasi dengan A. tumefaciens
** ditumbuhkan pada media non seleksi
Untuk memastikan bahwa kalus yang hidup di media induksi kalus yang
juga berfungsi sebagai media seleksi I adalah transgenik, maka kalus tersebut
dipindahkan ke media seleksi II yang juga berfungsi untuk regenerasi. Pada media
regenerasi yang mengandung 50 mg/l higromisin, 23 dari 27 kalus (atau 57%)
yang dihasilkan dari perlakuan perendaman 30 menit dapat bertahan hidup. Dari
28 kalus yang diperoleh dari perlakuan perendaman 20 menit, 26 kalus (atau
65%) dapat bertahan hidup pada seleksi yang sama (Tabel 1). Hal ini
menunjukkan bahwa waktu perendaman 20 menit sudah mencukupi untuk
melakukan transformasi pada tembakau. Seleksi bertingkat ini dimaksudkan untuk
mendapatkan tanaman transgenik yang jumlahnya banyak dan sudah digunakan
pada penelitian sebelumnya (Dewanti et al. 2011; Anggraito 2012; Eskundari
2012; Hannum 2012).
Konsentrasi 50 mg/l higromisin biasa digunakan untuk menyeleksi
tanaman transgenik yang mengandung gen penanda seleksi hptII (Anggraito 2012;
Su et al 2012). Berdasarkan jumlah kalus yang resisten terhadap higromisin
di media seleksi II yang mengandung 50 mg/l higromisin, efisiensi transformasi
dalam penelitian ini adalah 57,5% dengan perlakuan perendaman 30 menit
sedangkan dengan perlakuan perendaman 20 menit adalah 65%. Efisiensi
transformasi pada penelitian ini lebih rendah daripada efisiensi transformasi pada
penelitian lain. Anggraito (2012) dan Hannum (2012) memperoleh efisiensi
transformasi masing-masing 82% dan 79% pada tembakau. Walaupun demikian,
efisiensi transformasi pada penelitian ini lebih tinggi daripada yang diperoleh
Eskundari (2012) yang hanya mendapatkan 16%.
Kalus yang hidup di media seleksi II, setelah 5 minggu beregenerasi
membentuk tunas transgenik. Tunas ini kemudian dipisahkan dari kalus dan
ditumbuhkan di media yang sama untuk menginduksi pembentukan akar. Setelah
akar terbentuk dan tinggi tunas mencapai lebih dari 5 cm, tanaman transgenik ini
dipindahkan ke media tanah di dalam pot. Tanaman transgenik ini disebut dengan
tanaman transgenik generasi To. Tanaman ini dibiarkan melakukan penyerbukan
sendiri untuk menghasilkan biji T1 (Gambar 3). Penelitian ini menghasilkan 48
tanaman tembakau transgenik yang berhasil diaklimatisasi yang terdiri dari 27
11
tanaman tembakau dari perlakuan perendaman 20 menit dan
tembakau dari perlakuan perendaman 30 menit.
(A)
(C)
21 tanaman
(B)
(D)
Gambar 3. Perakitan tanaman tembakau transgenik yang mengandung gen BtCspB.
A= eksplan di media seleksi I, B= Kalus yang beregenerasi membentuk
tunas transgenik, C= Tunas transgenik di media pengakaran, D= Tanaman
tembakau transgenik To.
Dari 26 kalus yang berasal dari perendaman 20 menit yang resisten di
media seleksi II yang juga merupakan media regenerasi, 16 kalus (61,5%) yang
membentuk tunas dengan rataan tunas yang terbentuk tiap kalus adalah 5. Dari
perlakuan perendaman 30 menit, 19 dari 23 kalus (82,6 %) yang resisten
higromisin menghasilkan tunas dengan rataan tunas tiap kalus adalah 3. Pada
media yang sama, semua eksplan yang tidak diinokulasi yang ditumbuhkan pada
media non seleksi mampu membentuk kalus dan tunas (Tabel 2). Hal ini
menunjukkan bahwa eksplan yang digunakan dapat tumbuh dan berkembang
dengan baik. Selain itu, kombinasi media dasar MS dan ZPT (1 mg/l BAP dan 0,1
mg/l IAA) dapat digunakan untuk menghasilkan tanaman tembakau in vitro.
Regenerasi dari kalus menjadi tunas sangat tergantung dari medianya.
Zat pengatur tumbuh sangat berpengaruh terhadap proses regenerasi ini.
Kombinasi sitokinin dan auksin sangat menentukan keberhasilan regenerasi.
Selain itu, agen seleksi yang berupa antibiotik dapat menghambat proses
regenerasi, sehingga pada beberapa penelitian, proses regenerasi dilakukan pada
media yang tidak mengandung antibiotik (Kyozuka dan Shimamoto 1991). Pada
penelitian ini efisiensi regenerasi tembakau non transgenik di media yang tidak
12
mengandung antibiotik mencapai 100%, sedangkan pada tembakau transgenik
yang diregenerasikan di media yang mengandung antibiotik efisiensi regenerasi
antara 61,5% dan 82,6%.
Tabel 2. Jumlah tunas yang dihasilkan dari kalus yang resisten higromisin di media
regenerasi yang mengandung 50 mg/l higromisin
Perlakuan*
Jumlah
kalus
Diinokulasi 30 menit
23
Diinokulasi 20 menit
26
Tidak diinokulasi**
20
*diinokulasi dengan A. tumefaciens
** ditumbuhkan pada media non seleksi
Jumlah kalus
bertunas
Jumlah
tunas
Rataan tunas
tiap kalus
19 (82,6%)
16 (61,5%)
20 (100%)
51
74
100
3
5
10
Analisis molekuler tanaman transgenik To dengan PCR
Analisis molekular dengan PCR dilakukan terhadap 39 tembakau transgenik
putatif yang berhasil tumbuh menjadi tanaman dewasa. Analisis molekuler pada
penelitian ini bertujuan untuk mengetahui adanya integrasi gen BtCspB di bawah
kendali promoter ubiquitin. Oleh sebab itu, PCR dilakukan dengan menggunakan
primer yang mengamplifikasi daerah antara promoter (UbiQF) dan BtCspB
(CspR) yang berukuran 278 pb. Primer yang dapat mengamplifikasi sebagian dari
gen aktin yang berukuran sekitar 600 pb, digunakan sebagai kontrol adanya DNA
yang bagus di setiap tanaman yang dianalisis.
Analisis PCR dengan primer UbiQF dan CspR2 terhadap 39 tembakau
transgenik putatif menunjukkan bahwa 18 tembakau dari perendaman 30 menit
dan 21 tembakau dari perendaman 20 menit, mengandung fragmen berukuran
sekitar 278 pb yang merupakan DNA dari transgen antara UbiQ dan CspR2
(Tabel 3). Hasil amplifikasi dengan PCR dari 8 tanaman transgenik yang diambil
secara acak disajikan pada Gambar 4. Hasil PCR dari DNA tanaman
non-transgenik tidak menunjukkan amplifikasi yang berukuran 287 pb. Hasil PCR
terhadap PCR DNA tembakau transgenik sesuai dengan PCR plasmid
pCambia1300int-BtCspB yang berukuran 287 pb (Gambar 4). Gen aktin
merupakan house keeping gene sehingga dapat digunakan sebagai kontrol internal
PCR. Primer aktinF dan aktinR mampu mengamplifikasi 9 tembakau yang terdiri
dari 1 tembakau non transgenik dan 8 tembakau transgenik putatif yang diambil
secara acak yang menghasilkan amplikon yang berukuran 600 pb (Gambar 4).
Hal ini menunjukkan bahwa seluruh DNA dari tanaman yang dianalisis adalah
baik dan amplikon yang berukuran sekitar 278 bp adalah fragmen yang
mengandung promoter ubiquitin dan gen BtCspB.
Uji tantang yang sifatnya destruktif lebih baik dilakukan terhadap populasi
yang berukuran besar dan seragam. Karena jumlah tanaman transgenik generasi
To sedikit, maka uji tantang terhadap panas tidak dilakukan pada generasi To. Uji
tantang ini ditujukan untuk mengetahui pengaruh ekpresi gen Csp terhadap
cekaman panas.
13
Tabel 3. Hasil PCR dengan primer UbiQF dan CspR2 pada tanaman tembakau To
Keberadaan Amplikon
287 pb
Ada/Tidak
Genotipe
Genotipe
Inokulasi 30 menit
Non-transgenik
Plasmid
P1U1 1.1
P1U1 3.1
P1U1 3.5
P1U1 3.7
P1U3 2.2
P1U3 2.3
P1U3 9.1
P1U4 1.3
P1U4 1.4
P1U4 1.5
P1U4 2.2
P1U4 2.6
P1U4 2.6
P1U4 4.1
P1U4 6.3
P1U4 5.2
P1U4 5.4
P1U4 5.3
Nt
Inokulasi 20 menit
Tidak
Ada
Ada
Ada
Ada
Ada
Ada
Ada
Ada
Ada
Ada
Ada
Ada
Ada
Ada
Ada
Ada
Ada
Ada
Ada
P
1
2
Keberadaan Amplikon
287 pb
Ada/Tidak
3
P2U1 1.2
P2U2 1.2
P2U2 6.2
P2U3 1.3
P2U3 2.2
P2U3 7.1
P2U3 3.4
P2U3 3.5
P2U3 5.1
P2U3 5.5
P2U3 5.6
P2U3 5.7
P2U3 5.10
P2U3 10.1
P2U3 7.2
P2U3 9.2
P2U3 9.6
P2U4 6.2
P2U3 10.1
P2U1 1.7
P2U2 1.5
4
5
6
Ada
Ada
Ada
Ada
Ada
Ada
Ada
Ada
Ada
Ada
Ada
Ada
Ada
Ada
Ada
Ada
Ada
Ada
Ada
Ada
Ada
7
8
M
600 pb
287 pb
Gambar 4. Hasil PCR dengan primer UbiQF dan CspR2, dan aktinF dan aktinR. M=
marker, Nt= N. tabaccum non-transgenik, P= plasmid pCambia1300IntBtCspB, 1-4= tanaman transgenik yang dihasilkan dari inokulasi 30 menit,
5-8= tanaman transgenik yang dihasilkan dari inokulasi 20 menit.
14
Pada umumnya tanaman To adalah heterozigot sehingga jika melakukan
penyerbukan sendiri maka tidak semua keturunannya adalah transgenik. Hanya
75% dari populasi keturunannya yang transgenik dan 25% non-transgenik. Dari
75% yang transgenik, hanya 25% populasi tanaman yang transgenik homozigot.
Untuk menguji homosigositas generasi T1, biji dari setiap tanaman T1
dikumpulkan secara terpisah, dan ditumbuhkan di media yang mengandung agen
seleksi higromisin. Populasi yang tidak mengandung tanaman yang sensitif
terhadap higromisin adalah populasi homosigot dan tetua dari populasi tersebut
adalah homosigot.
Analisis pewarisan gen hpt ke generasi T1
Tanaman transgenik To selanjutnya dipelihara dalam pot di dalam rumah
kaca hingga menghasilkan biji tembakau. Buah tembakau yang masak fisiologis
dipanen dari tanaman To untuk mendapatkan biji tanaman T1. Pada konsentrasi
50 mg/L higromisin biji non transgenik mampu berkecambah namun tidak mampu
tumbuh lebih lanjut. Pada umur 3 minggu setelah tanam, kecambah non
transgenik dapat dibedakan dengan jelas dari kecambah transgenik. Kecambah
non transgenik hanya mempunyai daun kotiledon dan mengalami klorosis. Pada
umur yang sama (3 minggu) kecambah transgenik mampu tumbuh membentuk
daun selain daun kotiledon (Gambar 5). Hal ini menunjukkan bahwa 50 mg/l
higromisin dapat digunakan untuk menyeleksi antara kecambah tembakau
transgenik dan non transgenik.
(A)
(B)
Gambar 5. Uji resistensi tembakau populasi T1 terhadap higromisin. A= kecambah non
transgenik, B = kecambah tembakau transgenik T1. Tanda panah
menunjukkan tembakau yang rentan higromisin. Tanda panah menunjukan
kecambah tembakau non transgenik pada generasi T1.
Konsentrasi 50 mg/l higromisin juga telah digunakan oleh Bhatti & He
(2009) dan Anggraito (2012) untuk menyeleksi tembakau dan Toki et al. (2006)
dan Rachmawati et al. (2004) untuk menyeleksi padi transgenik T1. Higromisin
merupakan antibiotik yang sangat beracun bagi tanaman dengan cara
penghambatan tRNA untuk menempel pada ribosom. Tanaman yang mengandung
gen hpt mempunyai kemampuan untuk menghasilkan protein HPT yang
menyebabkan fosforilasi pada higromisin sehingga antibiotik ini tidak bersifat
racun (McCoy et al. 2011).
15
Analisis pewarisan gen hpt dilakukan terhadap 10 genotipe tembakau
transgenik To yang diambil secara acak. Hasil penelitian menunjukkan bahwa
semua genotipe yang dianalisis menghasilkan keturunan dengan perbandingan 3
resisten dan 1 sensitif terhadap higromisin (Tabel 4). Hasil ini menunjukkan
bahwa tanaman transgenik mengandung satu gen hpt fungsional yang diwariskan
dengan mengikuti hukum mendel .
Tabel 4. Jumlah tembakau yang resisten dan sensitif terhadap higromisin dari
generasi T1 dengan pola segregasi gen hpt.
Jumlah tanaman generasi T1
Genotipe
Total
P1U4 1.2
P1U4 1.4
P1U4 6.1
P1U4 6.2
157
32
288
161
P2U1 1.2
P2U11.4
P2U21.3
P2U4 3.9
P2U3 4.5
P2U4 5.2
168
128
109
80
84
167
Resisten
higromisin
Sensitif
higromisin
Perendaman 30 menit
120
37
27
5
223
65
130
31
Perendaman 20 menit
129
39
100
28
80
29
57
23
70
14
123
44
X2
Rasio
X2(1:0,5)= 3,84
Jumlah gen
hpt
0,17
1,5
0,91
2,83
3:1
3:1
3:1
3:1
1
1
1
1
0,29
0,67
0,15
0,6
3,11
0,16
3:1
3:1
3:1
3:1
3:1
3:1
1
1
1
1
1
1
Karena gen hpt difusikan dengan gen BtCspB pada daerah T-DNA maka
gen ini diwariskan bersama-sama ke generasi berikutnya sehingga jumlah gen
BtCspB yang terintegrasi di generasi T1 tembakau transgenik adalah satu salinan.
Hasil segregasi T1 tembakau transgenik sesuai dengan Anggraito (2012).
Toki et al. (2006) menunjukkan bahwa terdapat kesesuaian antara hasil estimasi
salinan gen berdasarkan analisis segregasi dengan Southern blot di padi transgenik
T1.
Untuk mengkonfirmasi bahwa tanaman tembakau T1 mengandung gen
BtCspB dibawah kendali promoter Ubiquitin, analisis PCR dengan primer UbiQF
dan CspR2 dilakukan terhadap keturunan dari 10 genotipe yang masing-masing
genotipe terdiri dari 2 kecambah yang resisten terhadap higromisin yang diambil
secara acak. Hasil PCR menunjukkan bahwa 10 genotipe menghasilkan amplikon
yang berukuran 287 pb. Hasil amplifikasi ini sesuai dengan amplifikasi
menggunakan plasmid pCambia1300int-BtCspB sebagai cetakan yang
menghasilkan amplikon 287 pb. PCR yang sama terhadap tembakau non
transforman T1 tidak menghasilkan amplikon (Gambar 5).
16
M
Nt P 1
2
3
4
5 6
7 8
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
287 pb
Gambar 4. Hasil PCR dengan primer UbiQF dan CspR2. M= marker, Nt= tembakau
non-transgenik, P= plasmid pCambia1300Int-BtCspB, 1 dan 2=
genotipe P1U4 1.2; 3 dan 4= genotipe P1U4 1.4; 5 dan 6= genotipe
P1U4 6.1; 7 dan 8= genotipe P1U4 6.2; 9 dan 10= genotipe P2U1 1.2;
11 dan 12= genotipe P2U11.4; 13 dan 14= genotipe P2U21.3; 15 dan
16= genotipe P2U4 3.9; 17 dan 18= genotipe P2U3 4.5; 19 dan 20=
genotipe P2U4 5.2.
5 SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Transformasi genetik tembakau cv Samsun dengan gen BtCspB penyandi
protein cold shock protein diperantarai A. tumefacies telah menghasilkan
tembakau transgenik. Gen BtCspB dibawah kendali promoter Ubiquitin telah
terintegrasi di dalam genom tembakau transgenik dan diwariskan kepada generasi
T1.
Saran
Tanaman transgenik homosigot dapat diperoleh dari tanaman generasi T1
atau generasi T2. Uji tantang tanaman transgenik terhadap cekaman abiotik
khususnya perlakuan panas dapat dilakukan dengan menggunakan biji transgenik
yang dihasilkan dari tanaman transgenik homozigot. Oleh sebab itu, tanaman
tembakau transgenik homozigot harus diperoleh.
DAFTAR PUSTAKA
Acquaah, G. 2007. Principle of plant genetic and breeding. Blackwell Publishing Ltd.
Oxford. UK.
An G. 1985. High efficiency transformation of cultured tobacco cell. Plant Physiol
79:568-570.
Anggraito YU. 2012. Transformasi genetik Nicotiana benthamiana L. dan kedelai dengan
gen MaMt2 penyandi metallothionein tipe II dari Melastoma malabathricum L
[Disertasi]. Institut Pertanian Bogor. Bogor.
Bastiti DS, Naylor RL. 2009. Historical warming of future food insecurity with
unprecedented seasional heat. Science 323 (5911):240-244.
Batti KH dan He C. 2009. Agrobacterium mediated tobacco transformation with rice fae
gene and segregation analysis of T1 generation. Pak. J. Bot., 41(1):403-412.
Carmer GR, Urano K, Delrot S, Pezzoti M, Shinozaki K. 2011. Effects of abiotic stres on
plants: a systems biology perspective. BMC Plant Biol. 11 (163):
1-14.
Castigolini P, Warner D, Bansen RJ, Anstrom DC, Harrison J, Stoeker M, Abad M,
Kumar G, Salvador S D’Oridine R et al. 2008. Bacterial RNA chaperones confer
abiotic stress tolerance in plants and improved grain yield in maize under waterlimited conditions. Plant Physiol. 147 (2):446-455.
Chaikam V, Karlson DT. 2009. Comparison of structure. function and regulation of plant
cold shock domain proteins to bacterial and animal cold shock domain proteins.
BMP Report 43(1):1-8.
Chowdhury S, Maris C, Allain FHT, Narberhaus F. 2006. Molecular basis for
temperature sensing by an RNA thermometer. EMBO J. 26:2487–2497.
Ciftci YO. 2012. Transgenic Plant Advances and Limitation. InTech. Rejeka. Kroasia.
Cramer, G.R., Urano, K., S, Delrot, M. Pezzoti dan K. Shinozaki. 2011. Effects of
Abiotic Stres on Plants: a Systems Biology Perspective. BMC Plant Biol.: 11 (163):
1-14.
Dafny-Yelin M, Leny A, Tzfira T. 2008. The on going sanga of Agrobacterium-host
interactions. Trends Plants Sci. 13(3):102-105.
Dellaporta SL, Wood J, Hicks JB. 1983. A plant DNA mini preparation Plant Mol. Biol.
Reporter 1(4):19-21.
Dewanti P, Islahuddin M, Okviandari P, Waluyo S, Saputra BA, Wardiyati T, Sugiharto
B. 2011. Efisiensi transformasi tomat (Lycopersicon esculentum) dengan gen
SoSPS1 menggunakan Agrobacterium tumefaciens. Berk. Penel. Hayati 4(C). 73-78.
Eskundari RD. 2012. Transformasi genetik tanaman tembakau oleh Gen LFY kakao
(TcLFY) menggunakan Agrobacterium tumefaciens [Tesis]. Institut Pertanian
Bogor. Bogor.
Fraklin KA, Lee SH, Patel D, Kumar SV, Spartz AK, Gu C, Ye S, Yu P, Breen G, Cohen
JD, Wingge PA, Gray WM. 2011. Phytochrome-interacting factor 4 (PIF4)
regulates auxin biosynthesis at high temperature. PNAS 108 (50):1-5.
Glick BR, Pasternak JJ. 2010. Molecular Biotechnology, Principles and Aplication of
Recombinan DNA. ASM Press. Washington, D.C. USA.
Goodner B, Hinkle G, Gattung S, Miller N, Blanchard M, Qurollo B, Goldman BS, Cao
Y, Asekenazi M, Halling C et al. 2001. Genome sequence of the plant pathogen
and biotechnology agent Agrobacterium tumefaciens C58. Science 294
(5550):2323-2328.
Hannum S. 2012. Isolasi, pengklonan dan analisis ekspresi gen penyandi Copper-Zinc
superoxide dismutase (Cu/Zn-SOD) dari Melastoma malabathrricum L. [disertasi].
Institut Pertanian Bogor. Bogor.
19
He YK, Sun JG, Feng XZ, Czako M, Marton L. 2001. Differential mercury volatilization
by tobacco organs expressing a modified bacterial merA gene. Cell Res. 11:231–
236.
Herschlag D. 1995. RNA Chaperones and the RNA folding problem. Biol Chem. 270
(36):20871–20874.
Hiei Y, Komari T. 2006. Improved protocols for transformation of indica rice mediated
by Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell, Tiss. Org. Cult. 85:271–283.
Hiei Y, Komari T. 2008. Agrobacterium-mediated transformation of rice using immature
embryos or calli induced from mature seed. Nature Protocols 3(5):824-834.
Holcik M, Sonenberg. 2005. Translational control in stress and apoptosis. Nature Rev.
Mollec. Cell Biol. 6: 318–327
Ishida Y, Hiei Y, Komari T. 2007. Agrobacterium-mediated transformation of maize.
Nature Protocol 2:1614-1621.
Jones H. 1996. Plant gene transfer and expression protocols. Methods Molec Biol 49:3948.
Kang H, Park SJ, Kwak KJ. 2013. Plant RNA chaperones in stress response. Trends
Plant Sci.18(2):100-107.
Kim MH, Sasaki K, Imai R. 2009. Cold shock domain protein 3 regulates freezing
tolerance in Arabidopsis thaliana. Biol. Chem. 284:23454–23460.
Kyozuka J, Shimamoto K. 1991. Transformation and regeneration of rice protoplast.
Plant Tiss. Cult. Manual:1-17.
Langbecker CL, Ye GN, Broyles DL, Duggan LL, Xu CW, Hajdukiewicz PT, Armstrong
CL, Staub JM. 2004. High-frequency transformation of undeveloped plastids in
tobacco suspension cells. Plant Physiol. 135:139-146.
Manabella PA, Chan RL. 2009.Transient transformation of sunflower leaf discs via an
Agrobacterium-mediated method: applications for gene expression and silencing
studies. Nature Protocol 4: 1699-1707.
Mayo KJ, Gonzalez BJ, Mason HS. 2006. genetic transformation of tobacco NT1 cell
with Agrobacterium tumefaciens. Nature Protocol 1(3): 1105-1111.
McCoy LS, Xie Y, Tor Y. 2011. Antibiotics that target protein synthesis. Wiley
Interdisciplinary 2(2):209-232.
Miki B, McHugh S. 2004. Selectable marker genes in transgenic plants: applications,
alternatives and biosafety. J. Biotechnol. 107:193-232.
Murashige T , Skoog F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with
tobacco tissue cultures. Physiol Plant 15: 473-497.
Nakaminami K, Karlson DT, Imai. 2006. Functional conservation of cold shock domains
in bacteria and higher plants. PNAS 103:10122–10127.
Nguyen, N.V. 2008. Global Climate Changes and Rice Food Security. International Rice
Commission. Italia. .
Nishimura A, Aichi I, Matsuoka M. 2006. A protocol for Agrobacterium-mediated
transformation in rice. Nature Protocols 1: 2796-2802.
Park SJ, Kwak KJ, Oh TR, Kim YO, Kang H.2009. Cold shock domain proteins affect
seed germination and growth of Arabidopsis thaliana under abiotic stress
conditions. Plant Cell Physiol 50(4):869–878.
Perl D, Mueller U, Heinemann U, Schmid FX. 2000. Two esposed amino acid residues
confer thermostability on a cold shock protein. Nature Structural Biol. 7(5):380383.
Quiros-Fiqueroa FR, Rojas-Herrera, Galaz-Avalos, Loyola-Vargas. 2006. Embryo
production through somatic embryogenesis can be used to study cell differentiation
in plants. Plant Cell Tiss. Org. Cult 86: 285-301.
20
Rachmawati, D, Hosaka T, Inoue E, Anzai H. 2004. Agrobacterium-mediated
transformation of Javanica rice cv. Rojolele. Biosci. Biotechnol. Biochem
68(6):1193-1200.
Rahmawati S. 2003. Gen penyeleksi alternatif untuk transformasi tanaman.
Buletin AgroBio 6(1):26-33.
Rizhsky L, Liang H, Mittler R. 2002. The combined effect of drought stres and heat
shock on gene expression in tobacco. Plant Physiol. 130:1143-1151.
Shanker AK, Venkateswarlu, 2011. Abiotic stress respone in plant – physiological,
biochemical and genetic prespective. InTech. Rejeka. Kroasia.
Salkol A, Kwiatkowska A, Jerzmanowski A dan Prymakowska-Bosak M. 2007. Upregulation of stress-inducible genes in tobacco and arabidopsis cells in response to
abiotic stresses and ABA treatment correlates with dynamic changes in histone H3
and H4 modifications. Planta 227: 245–254.
Schroeder R, Barta A, Semrad K. 2004. Strategies for RNA folding and assembly. Nature
Rev. Mol. Cell Biol. 5: 908-919.
Su G, Park S, Lee S, Murai N.2012. Low co-cultivation temperature at 20˚C resulted in
the reproducible maximum increase in both the fresh weight yield and stable
expression of gus activity after Agrobacterium tumefaciens-mediated
transformation of tobacco leaf disks. Amer. J. Plant Sci. 3:537-545.
Taiz L, Zeiger, E. 2002. Plant Physiology, 3rd . Sinauer Associates. Sunderland. UK.
Toki S, Hara N, Ono K, Onodera H, Tagiri A, Oka S, Tanaka H. 2006. Early infection of
scutellum tissue with agrobacterium allows high-speed transformation of rice.
Plant J 47:969–976.
Tzfira T, Li J, Laroix B, Citovsky V. 2004. AgrobacteriumT-DNA integration: molecules
and models. Trends Gen 20 (8):375-383.
Waigmann E, Chen M, Bachmair R, Ghoshroy S, Citovsky V. 2000. Regulation of
plasmodesmal transport by phosporilation of tobacco mosaic virus cell-to-cell
movement protein. EMBO J 19:4875-4884.
Wei T. 2001. Agrobacterium-mediated transformation and assessment of factors
influencing transgene expression in loblolly pine (Pinus taedaL.). Cell Res.
11(3):237-243.
Willimsky G, Bang H, Fischer G, Marahiel MA. 1992. Characterization of CspB. a
Bacillus subtilis inducible cold shock gene affecting cell viability at low
tempteratures. J. Bacteriol 174:6326-35.
Wood DW, Setubal JC, Kaul R, Monks DE, Kitajima JP, Okura VK, Zhou Y, Chen L,
Wood GE et al. 2001. The Genome of the natural genetic engineer Agrobacterium
tumefaciens C58. Science 294 (5550):2317-2323.
Yamanaka K. 1999. Cold shock response in Escherichia coli. J. Mol. Microbiol.
Biotechnol 1(2):193-202.
Zupan J, Ward F Zambryski P. 2002. Inter-kingdom DNA transfer decoded. Nature
Biotechnol. 20:129-131.
21
Lampiran 1. Larutan Stok Murashige and Skoog (MS)
Komposisi
Jumlah (mg/L)
Stok larutan Makro
NH4NO3
KNO3
CaCl2.2H2O
MgSO4.7H2O
KH2PO4
1650
1900
440
370
170
Stok larutan Mikro
KI
H3BO3
MnSO4.4H2O
ZnSO4.7H2O
Na2MoO4.2H2O
CuSO4.5H2O
CoCl2.6H2O
0,83
6,2
22,3
8,6
0,25
0,025
0,025
Stok larutan Besi
FeSO4.7H2O
Na2EDTA.2H2O
27,8
37,3
Stok larutan Vitamin dan myo-inositol
Myo-inositol
Nicotinic acid
Pyridoxine HCl
Thiamine HCl
Glycine
100
0,5
0,5
0,1
22
Lampiran 2. Media LB (Lauria Bertani)
Komposisi
Pepton
Khamir
NaCl
Jumlah (g/l)
10
10
5
23
Lampiran 3. Media YEP (yeast extract pepton)
Komposisi
Pepton
Khamir
Tripton
NaCl
Jumlah (g/l)
10
10
10
5
24
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Blora, 18 September 1987. Penulis merupakan anak
ketiga dari empat bersaudara dari pasangan Djasman dan Suyatminah, Spd.
Pendidikan Sarjana ditempuh di Jurusan Agronomi Fakultas Pertanian,
Universitas Jember dari tahun 2005 hingga tahun 2009. Tahun 2010 penulis
melanjutkan pendidikan di Sekolah Pascasarjana IPB pada Program Studi
Multidisiplin Bioteknologi.