TRANSFORMASI GEN SUCROSE PHOSPHATE SYNTHASE

METODE TRANSFORMASI GEN
SUCROSE PHOSPHATE SYNTHASE
(SoSPS1) TEBU UNTUK MENINGKATKAN
SINTESA SUKROSA PADA DAUN
TEMBAKAU
LITA RASIMA
RATNA KARTIKAWATI
APRINO CAHYO ABADI
Pendahuluan
• Biosintesis sukrosa dipengaruhi
kinerja enzim Sucrose phosphate
synthase (SPS)
• Tanaman tembakau ditransformasi
dengan cDNA SPS tebu dengan
pKYS pada Agrobacterium
• Tujuan : untuk mengetahui aktivitas
SPS kandungan sukrosa daun pada
tembakau transgenik
Apa itu?
• SPS adalah salah satu enzim yang berperan
dalam sintesis sukrosa selain SS dan Inv
• Transformasi adalah perubahan
• Agrobacterium adalah bakteri yang
mengandung plasmid pKYS yang
digunakan untuk mensisipi cDNA SPS
tebu
• CaMV adalah sekuen RNA sebagai primer
• Sukrosa adalah produk akhir dalam proses
fotosintesis yang dapat digunakan untuk
pertumbuhan dan perkembangan
Konstruksi gen SPS pada pBI 121
tanpa gen GUS dan posisi macam
primer (P1,2,3,4) yang digunakan dalam
analisis PCR
P3
600 kb
P1
Nos- NPT II NOS- Pro
NOSSPS tebu
Pro (Kan R) Ter CaMV
Ter
P4
700 kb
P2
Tranformasi DNA pKYS pada
Agrobacterium
• Menggunakan Agrobacterium tumefaciens
strain LB4404
• Agrobacterium dikonstruk dengan metode
An et. al. (1985)
• Agrobacterium transforman dianalsis untuk
mengetahui keberadaan pKYS dengan
PCR dari sekuen gen Sosps 1 sbb:
– P1:5’GATTCTGATACAGTTGGCCA3’(forward
primer)
– P2:5’TCCTGCCTTGTGTGCTCGTGAT3’(reverse
primer)
• Hasil analisis PCR ternyata Agrobacterium
transforman telah membawa gen SPS tebu.
Transformasi Tembakau dengan
Agrobacterium transforman
• Daun tembakau steril diinfeksi dgn
Agrobacterium transfoman pada media MS
cair
• Kemudian diinkubasi selanjutnya di kokultivasi dan kemudian dicuci dengan
media MS yang mengandung cefotaxime
untuk mematikan Agrobacterium.
• Setelah itu diregenerasi pada media MS
padat yang mengandung kanamisin dan
cefotaxime
Analisis keberadaan SPS pada
daun tembakau dengan PCR
• Analisis PCR untuk mengetahui keberadaan gen
SPS tebu pada daun tembakau dengan cara:
– Predenaturation, Denaturation, Annelaing dan Extension
• Primer yang digunakana didesain berdasarkan
sekuen CaMV untuk forward primer dan sekuen
SPS untuk reverse primer.
– P3:5’GGACCTAACAGAACTCGCCG3’(forard primer)
– P4:5’CACCTCCTCGACGAAGTAGTG3’(reverse
primer)
• Berdasarkan primer tsb diperoleh 3 galur yang
mengandung SPS tebu.
• Hal ini menunjukkan gen SPS telah dapat
terintegrasi pada kromosom tembakau melalui
Agrobacterium.
Analsis protein dan aktivitas SPS
pada tembakau transgenik
• Kemampuan mensintesis sukrosa
ditentukan oleh jumlah protein dan
aktivitas enzim SPS
• Besar kecilnya jumlah protein ditentukan
ekspresi dan juga jumlah kopi gen dalam
tanaman.
• Melalui Western blot maka menggunakan
antibodi SPS1 tebu didapatkan beberapa
galur tembakau dapat mengekspresikan
gen SPS tebu
Korelasi aktivitas SPS dan
kandungan sukrosa
• Untuk membandingkan digunakan
tembakau wild type sebagai kontrol.
• Ternyata galur tembakau transgenik yang
dapat mengekspresikan gen SPS tebu
terjadi peningkatan kandungan sukrose
• Tapi juga terdapat yang tidak berbeda
nyata dengan wild type hal ini karena
diduga terjadi peningkatan aktivitas enzim
yang menghidrolisis sukrose pada
tembakau transgenik tsb.
Kegunaan selanjutnya apa sih??
• Untuk mengetahui ketepatan
konstruksi cDNA SPS pada pKYS
yang dibuat dan pengaruhnya
terhadap aktivitas SPS dan
kandungan sukrosa daun
• Keberhasilan penelitan in selanjutnya
digunakan untuk pengembangan
tanaman tebu transgenik yang
mempunyai kemampuan sintesis
sukrosa lebih besar
Berdasarkan Penelitan yang dilakukan:
Miswar,Bambang Sugiharto, Joedoro
Soedarsono dan Sukarji
Moeljopawiro