STATUS PERKEMBANGAN PERBAIKAN SIFAT GENETIK PADI

STATUS PERKEMBANGAN PERBAIKAN SIFAT GENETIK
PADI MENGGUNAKAN TRANSFORMASI
AGROBACTERIUM
Syamsidah Rahmawati
Pusat Penelitian LIPI, jl. Raya Bogor Km 46, Cibinong
Dipresentasikan :
WIJIYONO
Mikrobiologi
Mahasiswa Sekolah Pasca Sarjana
Universitas Sumatera Utara
Latar belakang
 Produktivitas beras
rendah
 Tidak seimbang antara
produksi beras
dengan konsumen
Produks gen:
-nutrisi padi
(golden rice)
-tahan kering
Terobosan baru
Tehnik transfer gen
langsung
Tehnik transfer gen
Secara tak langsung
Perbaikan genetik padi
Dengan menggunakan
Agrobacterium tumifacien
Peran mikroba
tanah
Bakteri Agrobacterium tumifacien
• Kemampuan menstranfer potongan DNA (T-DNA) ke genom
tanaman
• Komponen genetik
Gen virulen kromosom (kromosomal virulence (chv)
Kelompok gen virulen (vir) yang terdapat pada plasmid Ti
• Daerah T-DNA dibatasi : LB (left border), RB (right border yang
merupakan gen Bakteri
• Gen T-DNA : Gen ia aH, gen ia aM, dan ipt
enzim
Mekanisme integrasi T-DNA dalam genom Tanaman
(Inland (1996), Sheng dan Citovsky (1996), de la Riva et al.(1998)
Hoekema et al (1984)
T-DNA dapat ditransfer meskipun terletak pada plasmid yang berbeda
(plasmid ganda) binnary vektor.
Faktor yang mempengaruhi transformasi Agrobacterium
• Genotip dan jaringan tanaman/eksplan
(Azhakanandam et al (2000) : keberhasilan
transformasi agrobacterium sangat tergantung pada
genotip tanaman.
Jaringan yang baik : jaringan yang memberikan
respon yang baik terhadap kultur jaringan.
Strain Agrobacterium dan Plasmid/vektor
Adanya penggunaan A. tumifaciens strain
biasa
(LBA) 4404) dikombinasikan dengan vektor super
biner dengan gen ekstra gen virB, C dan G sangat
efektif untuk menstranfer padi.
• Strain Agrobacterium dan Plasmid/vektor
- Adanya penggunaan A. tumifaciens strain
biassa (LBA) 4404) dikombinasikan dengan
vektor super biner dengan gen ekstra gen virB,
C dan G sangat efektif untuk menstranfer padi.
- Berpengaruh terhadap efisiensi transformasi
- Kelemahannya terbatas pada inang yang
diinfeksi
Asetosiringon dan Ph
• Senyawa fenolik yang berperanan dalam
mekanisme transfer gen
• Kondisi Ph berpengaruh terhadap gen vir. Gen
vir dapat diekspresiksn pada pH 5 -8 .
• Ph 5,2 adalah Ph yang paling baik untuk
digunakan dalam transfer genetik.
Antibiotik untuk eliminasi Agrobakterium
• Setelah diko-kultivasi kalus direndam dalam
larutan antibiotik : untuk menghindari
berkembangnya bakteri Agrobakterium
• Dilanjutkan penggunaan antibiotik pada media
regenerasi ( Yara et al.2001 )
Kondisi infeksi dan kokultur
• Bakteri yang digunakan untuk infeksi sel tanaman adalah
bakteri yang sedang tumbuh aktif ( fase logaritma
)
• Sebelum inokulasi bakteri ditumbuhkan pada media yang
mengandung asetosiringon
Media induksi, Ko-kultivasi, regenerasi
• Media induksi N6 sedangkan media regenerasi
adalah MS ( hiei et al.1994;Rashid et al.1996;Toki
1997; Yara et al. 2001; cao et al.2004).
• Toki 1997 : Penambahan casamino acids dan prolin
dapat
meningkatkan
kemampuan
regenerasi
tanaman dan dapat menghasilkan tanaman trasgenik
dalam waktu 2 bulan sejak induksi.
Bahan Penyeleksi
• Higromisin(hpt), fostinotrisin (bar) (Hiei et
al.1994;rashid et al. 2003; Saharan et al. 2004; Jin et
al, 2004).
• Kanamisin (nptII) atau G418 tapi penggunaannya
sangat terbatas karena dapat menghambat
pertumbuhan sel ( Azhakanandam et al. 2000)
Ekspresi dan Stabilitas Gen
• Penyisipan gen ke genom tanaman harus
dapat diekspresikan.
• Espresikan gen dapat ditingkatkan dengan
penambahan
enhancer
dikombinasikan
dengan penggunaan promoter yang kuat atau
promoter spesifik.
Stabilitas Gen
• Gen yang telah terintegrasi pada genom tanaman,
maka gen tersebut akan stabil diwariskan ke generasi
berikutnya.
• Hiei dan Komari (1996) melaporkan trasgen stabil
diwariskan hingga generasi ke 4.
• Wu et al.(2002) melaporkan trasgen stabil diwariskan
hingga generasi ke 6.
• Rashid et al (1996)
melaporkan kegagalan
mengekspresikan gen disebabkan karena ada
pebungkaman gen.
Prospek
• Tanaman padi yang mengandung gen :
Tahan penggerek batang
Penyakit blas
Hawar daun
Kekeringan, salinitas dan herbisida
• Tanaman padi dengan daya hasil tinggi, kandungan
zat besi dan vitamin A yang tinggi
Tabel1.
Beberapa gen yang telah diintroduksi ke dalam tanaman menggunakan transformasi
Agrobacterium
Gen
Asal
Promotor
S.Sasaran
Varitas
Pustaka
crylAb,crylAc
B. Thuriengiensis
Ubi,CaMV35S,Bras
sicaBp10
Tahan PBK dan
PBP
Nipponbare(Japoni
ca)’
Cheng et al.(1998)
Ferritin
Kedelai
GluB-1
Padi mengandung
zat besi dan zink
Indica (IR68144)
Goto et al (1999);
Vasconcelos et
al.(2003)
Psy,lyc,crt1
Bunga daffodil
Bakteri Erwinia
uredovora
Gt1,35s CaMV
Padi mengandung Pro
Vitamin A
Japonica(TP309)
Yeetal (2000)
rhLF(lactoferrin)
Manusia
Ubiquitin jagung
Padi mengandungg
lactoferin
Javanica(rojolele)
Rahmawati dan slamet
ledin (2004)
Ech42, nag 70,glue48
Trichoderma atriviride
Act1
Tahan Rhizoctonia
solani dan magnaphore
grisea
Ishikarishiroge(japonica)
Mei et al.9200020
Crylb-crylaa hybrid
Bt
Ubiquiin jagung
Tahan pbk
Japonica(rojolele0
Rahmawati dan slamet
Loedin (2004)
VHb dan EPsps
Bakteri vitreoscilla dan
slmonella typhimurium
Pistilspesifik dari
kentang da CaMV35S
Hasil tinggi dan tahan
herbisida
Japonica(Xius
11,Qiufeng,youfeng,
dan Hanfeng)
Cao et al.(2004)
Chitinasel
Padi
CaMV
Tahan jamur penyebab
blas Magnaporthe
grisea dan Rhizoctonia
Solani
Indica(vaidehi,tulsi)
Nishizawa et al.(2002)
Hva1
Barley
Promtor terinduksi
ABA, promotor
konstitutive actin 1 padi
Osmoprotektan
Indica(Basmati0
Rohila et al.(2002)
otsA-otsB
Bakteri E coli
Promotor terinduksi
ABA dan stres,rbcS
Tahan salinitas dan
kekeringan
indica9PB-1)
Gang et al.(2002)
Kesimpulan
• Transformasi agrobacterium telah berhasl dilakukan
pada berbagai kultivar padi japonica, indica dan
javanica
• Keberhasilan trasformasi ditentukan oleh :pemilihan
genotip, jaringan tanaman, umur eksplan, strain
agrobacterium, vektor, konsentrasi asetosiringon dan
Ph, kerapatan sel bakteri, lama dan suhu kokultivasi,
antibiotik, bahan penyeleksi, komposisi media kultur .
• Peningkatan efisiensi transformasi disebabkan : penggunaan
asetosiringon dan bahan pemadat yang tinggi, pengeringan
kalus secara perlahan atau penambahan antinekrotik pasca
ko kultivasi .
•
Peningkatan ekspresi gen : pemilihan promoter, penggunaan
kodon yang sesuai, penambahan enhancer
• Gen tunggal dan poligenik telah berhasil diintroduksikan ke
dalam tanaman padi dalam upaya perbaikan mutu genetik padi
• Kemampuan transformasi Agrobakterium
tanaman transgenik dengan salinan tunggal.
menghasilkan