over ekspresi gen Sucrose

OPTIMASI TRANSFORMASI GENETIKA
MELALUI AGROBACTERIUM PADA TANAMAN PADI
[ OPTIMIZATION OF AGROBACTERIUM-MEDIATED
GENETIC TRANSFORMATION IN RICE ]
Oleh
Muhammad Hazmi1), Netty Ermawati2), dan Bambang Sugiharto3)
1)
Laboratorium Kultur Jaringan, Fakultas Pertanian UM Jember
2)
Laboratorium Biosain, Politeknik Jember
3)
Laboratorium Biologi Molekul, Laboratorium Biologi Dasar, FMIPA Universitas Jember
Penulis korespondensi. Email : [email protected]
ABSTRAK
Keberhasilan transformasi genetika pada tanaman padi sangat dipengaruhi oleh karakternya yang bersifat
recalsitrant, terutama padi jenis indica yang banyak ditanam oleh petani di Indonesia. Oleh karena itu, optimasi
metode selalu diperlukan sebelum melakukan transformasi genetika pada tanaman padi. Transformasi gen GUS
sering digunakan sebagai sarana optimasi metode transformasi sebelum melakukan overekspresi gen yang
sesungguhnya. Penelitian ini bertujuan untuk memastikan bahwa komponen transformasi gen melalui
Agrobacterium tumefaciens dapat bekerja secara efektif pada tanaman padi. Penelitian dilaksanakan di
Laboratorium Biosain Politeknik Jember dari bulan Maret sampai dengan Desember 2013. Konstruk gen GUS
diperoleh dari Laboratorium Biologi Molekuler Universitas Jember. Padi yang digunakan adalah varietas Inpari 20
dari BPTP Malang dan CV Dongjin dari Korea Selatan sebanyak 20 biji dari setiap verietas. Hasil penelitian
menunjukkan bahwa transformasi gen GUS melalui Agrobacterium tumefaciens berhasil menginfeksi eksplan.
Eksplan yang diinfeksi tumbuh pada media seleksi antibiotik higromisin sampai umur 65 hari setelah infeksi. Hasil
uji GUS menunjukkan bahwa gen GUS tidak terekspresi pada tanaman Padi. Hal ini menunjukkan bahwa ada
kemungkinan DNA promoter dan plasmit pCAMBIA tidak kompatibel pada tanaman padi. Agrobacterium
tumefaciens dapat digunakan untuk transformasi genetika pada tanaman padi, tetapi perlu DNA promoter dan
plasmit yang kompatibel.
Kata kunci: Optimasi, transformasi, gen GUS, Agrobacterium tumefaciens, dan padi.
ABSTRACT
Genetic transformation in rice is strongly influenced by recalsitrant character, especially indica rice is
widely planted by Indonesian farmers. Therefore, the optimization of genetic transformation always required before
transforming gene in rice. GUS gene transformation is often used as a optimization of transformation before
performing actual gene. This study aims to ensure that the components of Agrobacterium-mediated transformation
can work effectively in rice. The experiment was conducted at the Biosain Laboratory of the Jember Polytechnic
from March to December 2013. GUS gene construct was obtained from the Molecular Biology Laboratory of
Jember University. Rice varieties used are Inpari 20 of BPTP Malang and CV Dongjin of South Korea as much as
20 seeds from each. The results showed that the GUS gene transformation is implemented successfully infect
explants. Infected explants can grow on the antibiotic hygromycin selection media until 65 days after infection. The
GUS assay showed that GUS gene is not expressed in rice. This suggests that there is a possibility of promoter
DNA and plasmit pCAMBIA not compatible on rice. Agrobacterium tumefaciens can be used for genetic
transformation in rice, but need the compatibility of DNA promoter and plasmit.
Keywords : Optimization , transformation , GUS gene , Agrobacterium tumefaciens, and rice .
PENDAHULUAN
Peningkatan produksi padi dapat dilakukan
dengan memperluas area tanam dan meningkatkan
produktivitasnya. Upaya peningkatan produktivitas
padi sudah banyak dilakukan melalui pemuliaan
tanaman dengan persilangan. Transformasi genetika
dengan menyisipkan gen yang berhubungan dengan
peningkatan kinerja biosintesis pati (starch) dan atau
Agritrop Jurnal Ilmu-Ilmu Pertanian
sukrosa merupakan alternatif cara meningkatkan
produktivitas padi yang perlu dipelajari secara intensif.
Kinerja jaringan fotosintetik tanaman Padi
dalam biosintesis pati sangat mungkin dapat
ditingkatkan dengan menyisipkan gen tertentu, seperti
gen sucrose-phosphate synthase (SPS). Sucrosephosphate synthase adalah enzima yang menjadi
katalisator pembentukan sukrosa pada tanaman.
Sugiharto dkk. (1997) berhasil mengisolasi gen
(cDNA) sucrose-phosphate synthase (SPS) dari
1
jaringan fotosintetik tanaman tebu (SoSPS1).
Penyisipan gen SoSPS1 dapat meningkatkan sistesis
sukrosa pada tanam tebu, tomat, dan tembakau.
Keberhasilan penyisipan gen SoSPS1 pada
tanaman Padi sangat dipengaruhi oleh karakternya
yang bersifat recalsitrant, terutama padi jenis indica
yang banyak ditanam oleh petani di Indonesia. Padi
jenis indica sulit diregenerasikan secara kultur
jaringan, sehingga tingkat efisiensi transformasi
genetikanya selalu lebih rendah dibandingkan dengan
padi jenis javanica atau japonica (Sahoo dkk., 2011).
Efisiensi transformasi Padi IRAT 112 (indica) lebih
rendah
dibandingkan
Rojolele
(javanica)
(Mulyaningsih dkk., 2009). Oleh karena itu, optimasi
metode transformasi selalu diperlukan sebelum
melakukan transformasi genetika pada tanaman Padi
(Hazmi dkk., 2011). Transformasi gen GUS sering
digunakan
sebagai
sarana
optimasi
metode
transformasi sebelum melakukan overekspresi gen
yang sesungguhnya.
METODE PENELITIAN
Tempat dan Waktu Pelaksanaan Penelitian
Transformasi gen GUS dan analisis
molekuler dilaksanakan di Laboratorium Biosain
Politeknik Negeri Jember. Konstruk plasmid dan
kalibrasinya dilaksanakan di Laboratorium Biologi
Molekuler Laboratorium Biologi Dasar Fakultas
Matematika Ilmu Pasti Alam Universitas Jember.
Penelitian kalibrasi metode transformasi genetika
melalui Agrobacterium tumefaciens dan analisisnya ini
dilaksanakan mulai bulan Maret sampai dengan
Desember 2013.
Alat dan Bahan yang Digunakan
Peralatan yang digunakan adalah alat-alat
standar untuk Laboratorium Kultur Jaringan Tanaman
dan Biologi Molekuler. Bahan yang digunakan adalah
bahan standar untuk kultur jaringan tanaman dan
transformasi genetika. Benih padi yang digunakan
adalah varietas INPARI 20 dari BPTP Malang dan CV
Dongjin dari Korea Selatan.
Pelaksanaan Penelitian
Persiapan eksplan
Persiapan dimulai dari pengadaan benih padi
dan pembuatan medium kultur untuk transformasi gen
GUS. Eksplan yang digunakan adalah biji padi yang
dikecambahkan. Pengecambahan dilakukan dengan
menginkubasi biji padi steril pada medium kultul in
vitro. Benih yang berkecambah saja (kelihatan
radikulanya) yang digunakan sebagai eksplan.
Persiapan Agrobacterium tumefaciens
Satu koloni dari Agrobacterium tumefaciens
strain GV3101::pCAMBIA (koleksi Laboratorium
Biologi Molekuer Biologi Dasar FMIPA UNEJ) yang
mengandung konstruk gen GUS ditumbuhkan pada 5
ml media yeast extract dan peptone (YEP) cair
(Sambrook dkk., 1989) yang mengandung 50 ppm
2 Agritrop Jurnal Ilmu-Ilmu Pertanian
kanamisin. Kultur Agrobacterium tumefaciens sebagai
starter diinkubasi sekitar 12 jam yang diletakkan di
dalam shaker inkubator dengan kecepatan putaran 85
rpm pada suhu 28oC. Kultur starter Agrobacterium
tumefaciens sebanyak 1 ml dikultur kembali di dalam
media YEP cair 50 ml dan inkubasi di dalam shaker
dengan kecepatan putaran 85 rpm pada suhu 28oC
sekitar 6 jam. Kultur Agrobacterium tumefaciens
dipanen, terlebih dahulu diukur kerapatan optik
bakterinya dengan alat spektrofotometer, dituang ke
dalam tube 50 ml, kemudian disentrifuse dengan
kecepatan 5.000 rpm selama 10 menit pada suhu 4oC.
Larutan media YEP dibuang dan pelet dilarutkan ke
dalam media MS cair ditambah 100 ppm
asetosiringon.
Tra n sfo r ma si G en GU S da n GU S A ssa y
Transformasi
dilakukan
dengan
menggunakan Agrobacterium tumefaciens strain
GV3101::pCAMBIA memuat gen GUS yang
dikendalikan oleh DNA promoter CaMV35S (Toyobo,
Inc.). Konstruk T-DNA gen GUS dari plasmit
pCAMBIA disajikan pada Gambar 1. Infeksi
dilakukan terhadap 20 eksplan per varietas Padi dan
GUS assay dilakukan terhadap 2 eksplan yang
diinfeksi yang diambil secara acak. Analisis GUS
mengikuti prosedur histochemical oleh Jefferson dkk.
(1987) dengan beberapa perubahan. Sampel dicuci
satu kali dengan 0.1 M potassium phosphate buffer
(pH 7.0), kemudian diinkubasi dengan buffer yang
berisi 2 % methanol, 0.3% Triton X-100, 0.5 mM
potassium
ferricyanide,
0.5
mM
potassium
ferrocyanide dan 0.5 mg ml-1 5-bromo-4-chloro-3indolyl-β-D-glucoronide pada suhu 37oC satu malam.
Gambar 1. Konstruk T-DNA gen GUS dari palsmid
pCAMBIA.
Inokulasi dan kokultivasi
Eksplan diinokulasi dengan perendaman ke
dalam media MS cair yang mengandung
Agrobacterium
tumefaciens
strain
GV3101::pCAMBIA selama 15 menit sambil
digoyang perlahan dengan kerapatan optik bakteri 1
(OD600=1). Eksplan yang telah diinfeksi disaring dan
dicuci dengan MS cair, lalu dikering anginkan di
dalam Laminar Air Flow Cabinet (LAFC), dikultur
pada media MS padat dengan 100 ppm asetosiringon
dan dikokultivasi di dalam gelap selama 3 sampai
dengan 4 hari pada suhu 28oC.
Skrining putatif eksplan transforman
Eksplan hasil kokultivasi dicuci 3 kali dengan
media MS cair yang mengandung 500 ppm sefotaksim,
dikering anginkan di dalam LAFC. Eksplan dikultur
pada media MS padat yang mengandung 500 ppm
sefotaksim dalam ruang gelap selama satu minggu
untuk mengeliminasi Agrobacterium tumefaciens.
Setelah satu minggu dipindah lagi dalam media MS
ditambah 100 ppm higromisin, dan
500 ppm
sefotaksim untuk seleksi antibiotika, kemudian
diinkubasi dalam ruang gelap selama 21 hari.
Regenerasi eksplan menjadi planlet
Eksplan putatif transforman diregenerasikan
pada media MS padat yang mengandung 2 mg/l IAA,
antibiotik hgromisin dan sefotaksim dengan
konsentrasi yang sama dengan pada media seleksi.
Kultur selama 2 sampai 4 minggu dengan penyinaran
24 jam (intensitas 2000 lux). Tunas yang tumbuh
diduga transgenik disubkultur lagi sampai terbentuk
akar.
Analisis PCR
Analisis PCR dilaksanakan sebanyak 30
siklus, pada 98oC selama 10 detik, 55oC selama 30
detik, 72oC selama 1 menit, diikuti dengan 5 menit
terakhir untuk extension terakhir pada suhu 72oC.
Amplikasi DNA dianalis dengan menggunakan 1%
agarose gel electrophoresis dan photographed. DNA
yang teramplifikasi dengan PCR dielektroforesis
dalam agarose 1%. Cheking PCR Kit (intron)
dilaksanakan dengan formulasi:
 DNA Plasmid (pActin dan pCAMBIA : 2 l
 2 x PCR Reactions
: 10 l
 ddH2O
: 8 l
20 l
 PCR Program: Intron, Anneling 58C, 10 mnt.
 Primer utk pActin: (Hpt II), Hygromycin
 Primer untuk pCambia
Apabila terlihat ada band DNA dengan ukuran sesuai
dengan primer yang digunakan (Hpt II), maka gen
GUS berada di dalam konstruk, sehingga dapat
digunakan untuk transformasi.
Gambar 2. Hasil Kultur Agrobacterium tumefaciens
strain GV3101::pCAMBIA .
Gambar 3. Hasil konfirmasi PCR terhadap gen GUS
dalam konstruk pCAMBIA.
Eksplan Transformasi Gen GUS
Hasil inkubasi benih Padi varietas Inpari 20
koleksi BPTP Malang dan CV Dongjin menunjukkah
bahwa benih padi dari kedua varietas ini dapat
berkecambah (Gambar 4). Radikula dari biji padi
Inpari 20 terlihat lebih dominan pertumbuhannya.
Kalus juga terbentu pada sebagian besar biji padi. Hal
ini menunjukan bahwa benih padi dari kedua varietas
dapat digunakan sebagai eksplan transformasi gen
GUS.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Kultur
Agrobacterium
tumefaciens
GV3101::pCAMBIA
Hasil kultur bakteri menunjukkan bahwa
Agrobacterium
tumefaciens
strain
GV3101::pCAMBIA dapat tumbuh dengan baik. Hal
ini menunjukan bahwa Agrobacterium tumefaciens
strain GV3101::pCAMBIA dapat melakukan aktivitas
biologisnya (Gambar 2). Hasil konfirmasi PCR
terhadap keberadaan gen GUS dalam konstruk
pCAMBIA menunjukkan bahwa gen GUS masih
berada di dalam konstruk (Gambar 3).
3 Agritrop Jurnal Ilmu-Ilmu Pertanian
Gambar 4. Eksplan transformasi gen GUS.
GUS assay
Hasil Uji GUS terhadap 2 eksplan yang
dinfeksi dari setiap varietas padi yang diambil secara
acak, belum menunjukkan adanya spot biru sebagai
indikasi bahwa gen GUS terekspresi (Gambar 5). Hal
ini
kemungkinan
terjadi
karena
kurangnya
kompatibilitas plasmid yang digunakan (pCAMBIA)
terhadap padi sebagai tanaman monokotil yang bersifat
recalsitrant, sehingga ekspresi gen GUS tidak stabil.
Kondisi optimum yang dapat menjaga kestabilan
ekspresi gen merupakan hal tersulit untuk diperoleh
dalam transformasi genetika melalui Agrobacterium
tumefaciens (Ombori dkk., 2013). Hal ini terlihat
bahwa sisa eksplan yang dikultur pada media MS
dapat tumbuh baik bahkan mampu bertahan pada
seleksi antibiotik. Transformasi genetika berikutnya
perlu memperhatikan penggunaan plasmid lain yang
diketahui memiliki kemungkinan kompatibilitasnya
terhadap tanaman Padi lebih baik.
Gambar 7. Pertumbuhan padi sebagai tanaman kontrol
pada media MS tanpa antibiotik pada umur 65 HSI.
KESIMPULAN
Gambar 5. Hasil uji GUS terhadap planlet padi hadil
transformasi gen GUS (Tidak terlihat spot biru).
Kultur Planlet Hasil Transformasi Genetika
Hasil kultur in vitro menunjukkan bahwa
eksplan yang sudah diinfeksi dapat tumbuh pada
media seleksi antibiotik higromisin (Gambar 6)
meskipun pertumbuhannya tidak sebagus tanaman
kontrol (Gambar 7). Hal ini menunjukkan bahwa
konstruk gen GUS kemungkinan besar berhasil
ditransformsi oleh T-DNA Agrobacterium tumefaciens
kedalam sel eksplan, tetapi tidak terekspresi secara
sempurna. Hal ini kemungkinan besar menyebabkan
hasil uji GUS tidak dapat menunjukkan spot biru.
Apabila konstruk gen GUS tidak berhasil
ditransformasi, maka eksplan yang diinfeksi tidak akan
dapat tumbuh pada media yang mengandung antibiotik
higromisin sampai berumur 45 hari setelah infeksi
(HSI).
Gambar 6. Pertumbuhan planlet pada media seleksi
antibiotik pada umur 65 HSI.
4 Agritrop Jurnal Ilmu-Ilmu Pertanian
Hasil penelitian menunjukkan bahwa
transformasi gen GUS melalui Agrobacterium
tumefaciens yang dilaksanakan berhasil menginfeksi
eksplan. Eksplan yang diinfeksi dapat tumbuh pada
media seleksi antibiotik higromisin sampai umur 65
hari setelah infeksi. Hasil uji GUS menunjukkan
bahwa plasmid DNA promoter yang terdapat dalam
konstruk plasmid pCAMBIA belum mampu
mengekspresikan gen GUS secara stabil pada jaringan
tanaman padi. Hal ini kemungkinan disebabkan oleh
DNA promoter dan plasmid yang digunakan belum
kompatibel dengan tanaman padi. Perlu melakukan
transformasi gen GUS kembali dengan beberapa
perbaikan agar penggunaan metode transformasi
genetika melalui Agrobacterium tumefaciens lebih
akurat.
UCAPAN TERIMA KASIH
Peneliti menyampaikan terima kasih kepada:
Dit Litabmas Dirjen Dikti Depdikbud RI yang telah
membiayai penelitian ini, Kopertis Wilayah VII
Surabaya, LPPM UM Jember, Lab Biosain Politeknik
Jember, Lab Biologi Molekuler Biologi Dasar FMIPA
UNEJ, Lab Kultur Jaringan FP UM Jember, Reviewer,
peserta seminar hasil penelitian, dan semua pihak yang
telah membantu pelaksanaan penelitian ini.
DAFTAR PUSTAKA
Hazmi M., Iskandar, dan B. Sugiharto, 2011.
Transformasi
gena
sucrose-phosphate
synthase tebu melalui Agrobacterium
tumefaciens pada tanaman padi (Oryza
sativa L.). Agritech 13 (1): 15-26.
Jefferson, R.A. 1987. Assaying chimeric genes in
plants: The gus gene fusion system. Plant
Mol. Biol. Rep. 5: 287-405.
Mulyaningsih E.S., R. Hermawan, I. H. SlametLoedin. 2009. Genetic Transformation of
Transcription Factor (35S-oshox4) Gene into
Rice Genome and Transformant Analysis of
hpt Geneby PCR and Hygromycin Resistance
Test. Biodiversitas 10 (2): 63-69.
5 Agritrop Jurnal Ilmu-Ilmu Pertanian
Ombori O., J.V.O. Muoma, and J. Machuka. 2013.
Agrobacterium-mediated
genetic
transformation of selected tropical inbred and
hybrid maize (Zea mays L.) lines. Plant Cell
Tiss Organ Cult 113:11–23.
Sahoo K.K., A.K. Tripathi, A. Pareek, S.K. Sopory,
and S.L. Singla-Pareek. 2011. An improved
protocol for efficient transformation and
regeneration of diverse indica rice cultivars.
Plant Methods 7:49.
Sambrook J., E.F. Fritsh, and T. Maniatis, 1969.
Moleculer Cloning a laboratory Manual.
Cold Spring Harbor Laboratory Press.
America.
Sugiharto B., Sakakibara H., Sumadi, and Sugiyama
T., 1997. Differential expression of two genes
for sucrose phosphate synthase in sugar cane:
Molecular cloning of the cDNAs and
comparative analysis of gene expression.
Plant Cell Physiol. 38:961-965.