selectable marker

PENANDA GENA
UNTUK TANAMAN
Gen penanda
• Umumnya diturunkan dari sumber bakteti
atau taaman dan dapat dibagi menjadi 2 tipe :
(1) selectable marker, (2) screenable marker.
Selectable marker adalah penanda yang
memungkinkan seleksi sel transforman atau
eksplan tanaman, dengan kemampuan
mereka dapat tumbuh dalam media yang
mengandung antibiotik atau herbisida.
Selectable marker yang sering digunakan
adalah kanamisin atau hygromycin. Disamping
untuk seleksi transforman marker demikian
dapat digunakan untuk mengikuti warisan gen
asing dalam populasi tanaman terpisah
Screenable marker, seperti CAT, produkproduk gen penyandi memiliki aktivitas enzim
yang dapat dengan mudah diuji, yang
memungkinkan tidak hanya untuk deteksi
transforman tetapi juga untuk estimasi/
pendugaan tingkat ekspresi gen asing dalam
jaringan tanaman trasgenik.
Marker-marker seperti GUS, luciferase atau Bgalaktosidase memungkinkan screening aktivitas
enzim dengan pewarnaan histokimia atau uji
fluorimetrik sel individu dan dapat digunakan
untuk studi sel spesifik ,demikian pula ekspresi
gen yang diregulasi perkembangan. Secara rutin
gen penanda telah dihubungkan dengan
promoter yang diturunkan dari pathogen
tanaman, T DNA A. tumefaciens atau virus
tanaman. Dengan cara ini diharapkan promoter
demikian berfungsi secara baik di dalam semua
sel tanaman.
Tanaman dengan pendaran warna
• Gen yang mengkode kemampuan
menghasilkan warna pada E. coli adalah GUS
(beta-glucuronidase)
• Kemampuan berpendar pada kunang-kunang
dikode oleh LUC (luciferase)
• Pada ubur-ubur dikode oleh GFP (green
fluorescent protein).
Gen GUS
• GUS (beta-glucuronidase) merupakan enzim yang
ditemukan pada bakteri Escherichia coli K-12
• Menghasilkan warna jika diinkubasikan dengan sebuah
substrat . substrat yang biasa digunakan adalah 5bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide (X-Gluc).
• GUS banyak digunakan sebagai marker (penanda) atau
reporter (pelapor) suatu gen melalui teknik
promoter:GUS fusion system pada tanaman.
• Alasannya sederhana, karena pada tanaman normal
(wild type) tidak ditemukan adanya aktivitas GUS.
• Tujuan dari teknik ini adalah untuk menganalisa
aktivitas promoter suatu gen pada organ atau jaringan
yang berbeda. Karena ekspresi suatu gen tergantung
promoternya
Gus Fussion System
• pada tanaman normal (wild type) tidak ditemukan
adanya aktivitas GUS.
• untuk menganalisa aktivitas promoter suatu gen
pada organ atau jaringan yang berbeda. Karena
ekspresi suatu gen tergantung promoternya
• Untuk mendapatkan ekspresi gen pada tanaman,
maka konstruksi promoter: GUS fusion harus
ditransfromasikan terlebih dahulu dan baru dapat
dianalisa pada generasi selanjutnya. Setelah
mendapatkan tanaman transgenik, maka analisa
eskpresi gen melalui GUS assay akan sangat mudah
dilakukan dengan prosedur yang sederhana
Ekspresi Gus
• Penampakan ekspresi GUS tersebut menunjukkan
pola ekspresi suatu gen yang bertanggung jawab
pada proses di suatu organ atau jaringan tertentu
• Contoh RIP1 (Rice Immature Pollen 1), gen penting
untuk kematangan pollen (serbuk sari) dan
germinasi, memiliki pola ekspresi GUS pada bagian
spesifik bunga yaitu anther (kepala putik) dan hanya
terekspresi pada fase akhir vakuolasi dan fase
pematangan pollen
Pemakaian gen GUS pada padi
Gambar 1. Pola ekspresi promoter RIP1:GUS. An: anther; O: ovary; Pa: palea
Luciferase dan Cahayanya
• Enzim yang bisa memendarkan cahaya.
• Diperoleh dari kunang-kunang ( pada
abdomen)
• Pada bagian ini, enzim luciferase
menggunakan luciferin sebagai substrat
untuk merangsang pemancaran cahaya.
• Cahaya yang dihasilkan memiliki panjang
gelombang antara 510 sampai 670
nanometer dengan warna pucat kekuningan
sampai hijau kemerahan.
• Reaksi sangat efisien karena dari
total reaksi, 96% diubah menjadi
cahaya.
• Keberhasilan isolasi gen (kloning)
luciferase dari kunang-kunang Photinus
pyralis pada awal 1980-an oleh
Helinski dan Marlene
• Sama halnya dengan GUS, luciferase
juga digunakan untuk analisa ekspresi
gen atau sebagai reporter.
• Luciferase menghasilkan cahaya
dengan cara mengoksidasi luciferin dan
pada umumnya bersifat ATPdependent .
Lanjutan …..
• Penggunaan luciferase sebagai reporter
gen memiliki keunggulan di antaranya
luciferin (substrat) yang dipakai
bersifat water soluble (larut dalam air)
sehingga dapat dengan mudah masuk ke
dalam sel.
• Selain itu, luciferase bisa melangsungkan
reaksinya di dalam sel hidup karena
produk reaksinya tidak bersifat toxic
(beracun) bagi makhluk hidup.
Lanjutan ………
• untuk menyeleksi mutan yang berkaitan dengan
stress (cekaman) lingkungan. Sistem ini dibuat
dengan menggunakan promoter RD29A (promoter
spesifik untuk stress lingkungan)
• untuk membuat konstruksi RD29A promoter: LUC
fusion
• Dilanjutkan dengan transformasi pada tanaman
(Arabidopsis) dan seleksi seedling (semaian) mutan
dalam plate atau petridish.
• Teknik ini cukup efektif dan efisien karena seleksi
mutan bisa dilakukan pada fase seedling, setelah
perlakuan stress.
Reaksi luminesence oleh luciferase
• Luciferin yang digunakan sebagai substrat memiliki
konsentrasi 1 mM dan dimasukkan pada botol sprayer yang
terlindung dari cahaya (lindungi dengan aluminium foil).
Sedangkan perangkat sistem pengambilan gambar terdiri dari
detektor (kamera CCD), pengontrol detektor dan komputer.
• Kamera diletakkan di ruang atau kotak gelap (dark chamber)
dengan ukuran 40 x 40 x 55 cm (panjang x lebar x tinggi).
Kotak gelap diletakkan terpisah dengan pengontrol detektor.
Sampel terlebih dahulu harus disemprot dengan luciferin
(substrat) secara merata, kira-kira 4-5 kali semprotan. Dengan
cepat sampel diletakkan pada tempat sampel (sample stage)
yang berjarak 30 cm dari lensa kamera. Biarkan selama 5
menit sebelum pengambilan gambar ekspresi luciferase.
Setelah mengatur fokus pada sampel, maka pengambilan
gambar bisa segera dilakukan dan langsung bisa diproses di
komputer.
Contoh hasil pemotretan Luciferin
Ekspresi luminescence RD29A-LUC pada seedling Arabidopsis
(Cold/dingin ; ABA/osmotik ; NaCl / Ggaram ) / D,E,F
terekspresi
Tingkat ekspresi luciferase
•
•
•
•
Warna putih-merah menunjukkan ekspresi tertinggi.
Warna kuning-hijau menunjukkan ekspresi sedang
Biru-hitam menunjukkan ekspresi terendah.
Untuk itu jika terlalu banyak ekspresi yang positif,
maka sebaiknya dipilih ekspresi tertinggi yaitu warna
putih. Dengan teknik ini, beribu-ribu tanaman
transgenik bisa dapat segera diketahui dan
dipisahkan dari tanaman non transgenik dalam
waktu yang sangat singkat.
GFP dan pendaran hijau
• GFP (green fluorescent protein) merupakan sifat
luminescence dengan pendaran warna hijau.
• Dari ubur-ubur Aequorea victoria
• Dilakukan pertama kali oleh ilmuwan Jepang Osamu
Shimomura pada tahun 1960-an , dilanjutkan oleh Douglas
Prasher
• Keberhasilan kloning tersebut dilanjutkan dengan aplikasi
GFP pada dua sistem organisme prokaryotik (bersel tunggal)
dan eukaryotik (multi sel/organisme tingkat tinggi)/
Escherichia coli dan nematoda (cacing gelang) yaitu
Caenorhabditis elegans.
• Hasilnya sangat memuaskan. Ekspresi GFP cukup stabil pada
kedua sistem tersebut
Penggunaan pd.
onion epidermal cells
• B1K1 + GFP
• BIK1 adalah protein kinase yang bertanggung jawab terhadap
resistensi dari infeksi serangan jamur Botrytis cinerea
• Ekspresi BIK1 terletak pada plasma membran sel (membran
sesuai perannya sebagai gen resisten jamur).
• GFP yang digunakan sebagai kontrol terekspresi pada
sitoplasma dan nukleus
• (Hal ini berkaitan dengan proses infeksi dari kebanyakan
jamur yaitu melalui perusakan dinding sel dan membran sel ).
Ekspresi pendaran warna hijau
• Ekspresi BIK1 terletak
pada plasma membran
sel (membran sesuai
perannya sebagai gen
resisten jamur).
• GFP yang digunakan
sebagai kontrol
terekspresi pada
sitoplasma dan nukleus
KESIMPULAN
• Ketiga teknik yang telah dijelaskan di atas,
masing-masing memiliki beberapa
keistimewaan.
• GUS, LUC dan GFP fusion system telah
memberikan inspirasi dengan kemudahannya
dalam mendeteksi ekspresi suatu gen.
• Aplikasinya pada tanaman sangat mudah
(dalam mengeksplorasi fungsi suatu gen).