pengaruh pemberian antioksidan dan prolin terhadap kualitas

Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner 2001
PENGARUH PEMBERIAN ANTIOKSIDAN DAN PROLIN TERHADAP
KUALITAS SPERMATOZOA SAPI SETELAH PEMBEKUAN
(The Effect Of Antioksidant And Prolin On The Quality Of Frozen Bull Spermatozoa)
T. SUGIARTI, P. SITUMORANG, E. TRIWULANINGSIH, D. A. KUSUMANINGRUM, dan A. LUBIS.
Balai Penelitian Ternak, PO Box 221, Bogor 16002
ABSTRACT
An experiment was conducted at Research Institute for Animal Production (RIAP) Ciawi to determine the
effect of antioxidant and prolin on the viability of bull sperm after freezing. Semen was collected from two
mature bulls once a week by mean of Artificial Vagina (AV). Immediately the semen was diluted in Tris-citrat
containing 20% v/v egg yolk as P0; P0+vit E (P1); P0+vit C (P2);P0+ prolin (P3); P3+vit E(P4); and P3+Vit C
(P5). Procedures of cooling, addition of glicerol and freezing semen were done according to standard
procedures of the reproductive fisiology RIAP’s laboratory. The parameters observed were % Motility (%M),
% Livability (% H), and % Intact Apical Ridge (% TAU) in fresh semen, after dillution and freezing. The
results showed that prolin significantly (P<0.05) affected %M after diluted. Furthermore, the addition of
antioxidant and prolin did not significantly affect the post-thawed semen quality. The decreasing of %M and
%H before and after freezing was lower in prolin treatment (P<0,05) than that of non-prolin treatment.
Antioksidant of Vit E and Vit C did not siginifanctly affect the decrease on the sperm quality before and after
freezing for % M, % H and % TAU.
Keys words: Antioksidant, proline, sperm
ABSTRAK
Penelitian pengaruh penambahan antioksidan dan prolin terhadap kualitas spermatozoa setelah
pembekuan telah dilakukan di Balai Penelitian Ternak, Ciawi. Semen ditampung dari dua ekor sapi FH jantan
dewasa setiap minggu sekali dengan menggunakan vagina buatan. Selanjutnya semen diencerkan dengan
pengencer tris-citrat yang mengandung kuning telur 20% (P0), P0+vit E (P1); P0+vit C (P2); P0+prolin (P3);
P3+vit E (P4) dan P3+vit C (P5). Pendinginan, penambahan gliserol dan pembekuan sperma dilakukan sesuai
prosedur yang sudah baku digunakan di laboratorium fisiologi reproduksi Balitnak. Parameter yang diamati
meliputi persentase motilitas (%M), persentase yang hidup (%H) dan tudung akrosom yang utuh (%TAU) pada
semen segar, setelah diencerkan dan setelah pembekuan. Hasil penelitian menunjukkan penambahan prolin
berpengaruh nyata (P<0,05) pada %M, antioksidan berpengaruh nyata (P<0,05) pada %H setelah pengenceran.
Kualitas semen setelah dibekukan tidak dipengaruhi secara nyata oleh penambahan antioksidan dan prolin.
Kata kunci: Prolin, Antioxidant, sperma
1
Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner 2001
PENDAHULUAN
Penggunaan semen beku untuk pelaksanaan Inseminasi Buatan (IB) pada sapi perah telah
dilakukan secara intensif dengan tujuan meningkatkan populasi dan produksi ternak, akan tetapi
tingkat kebuntingan yang diperoleh di lapangan sangat bervariasi dan secara umumnya masih
dikatakan rendah. Hal ini berhubungan dengan kualitas semen yang digunakan. Semen yang
dibekukan pada temperatur -196º C aktifitas spermatozoanya akan menurun karena sebahagian
besar (30%) spermatozoa akan mati selama proses pendinginan dan pembekuan (GOLDMAN et al.,
1991). Selanjutnya HAMMERSTEDT (1993) melaporkan bahwa selama proses pendinginan dan
pembekuan spermatozoa tidak mampu mensintesa enersi maupun memperbaiki sel-selnya yang
rusak, dan spermatozoa yang masih hidup juga sangat sensitif terhadap lingkungan luar, dan
akibatnya tingkat fertilitasnya jadi rendah (PARKS dan GRAHAM, 1992)
Keterbatasan daya hidup spermatozoa selain disebabkan oleh cold shock juga disebabkan oleh
terjadinya defisit energi dan kerusakan membran sel sebagai hasil reaksi peroksida lemak
(SITUMORANG et al., 2000). Vitamin C dan vitamin E merupakan antioksidan alam, berperan untuk
menurunkan kepekaan membran plasma spermatozoa terhadap peroksidasi lipid. Sebagai
antioksidan, asam askorbat (vitamin C) digolongkan sebagai pereduksi karena mempunyai potensial
redoksi yang rendah, akan tetapi efektif dalam melawan agen oksidasi. Vitamin E merupakan
antioksidan alam yang dapat mencegah terjadinya oksidasi terhadap asam lemak tidak jenuh
(GAMMAN dan SHERRINGTON, 1981). BECONI et al. (1993) melaporkan vitamin E mampu
melindungi spermatozoa sapi selama pembekuan dan pencairan kembali. Lebih lanjut dijelaskan
penambahan 1 mg ∝ tokoferol asetat/ml pengencer yang mengandung 0,2 M tris; 0,06 M sitrat; 0,13
glisin; 0,06 M fruktosa; 20% kuning telur dan 7% gliserol dengan pH 6,6 dapat menurunkan
kerentanan membran plasma terhadap peroksida lipid dibandingkan kontrol.
Prolin merupakan asam amino yang tinggi konsentrasinya dalam saluran testis (SETCHELL et
al., 1993), merupakan salah satu komponen yang diketahui sebagai larutan yang kompatibel,
terakumulasi sebagai respon terhadap stress dalam berbagai sel hidup baik pada sel tanaman
maupun hewan. Prolin juga melindungi sel dari kerusakan akibat tekanan osmotik, kerusakan panas
karena denaturasi enzim-enzim dan pembekuan (SANCHEZ et al., 1992). Lebih lanjut dinyatakan
prolin adalah derivat dari glutamat yang tinggi konsentrasinya dalam cairan luminal dalam kaput
epididimis. Bila ditambahkan prolin ke dalam pengencer untuk pembekuan semen akan
meningkatkan persentase motil secara signifikan segera setelah thawing dan selama inkubasi lebih
dari 9 jam pada suhu tubuh. Oleh karena itu penambahan antioksidan (vitamin C dan E) dan prolin
dalam pengencer diharapkan dapat meningkatkan daya hidup spermatozoa setelah pembekuan.
MATERI DAN METODE
Duaekor sapi jantan dikandangkan secara individu pada kandang dengan ukuran 3x3 m. Pakan
hijauan berupa rumput gajah dan air minum diberikan secara ad libitum sedangkan konsentrat
komersial diberikan 8 kg/ekor/hari sebagai suplemen. Semen ditampung satu kali seminggu dengan
menggunakan vagina buatan.
Secepatnya setelah penampungan, semen dibawa ke laboratorium reproduksi Balitnak
dievaluasi dan diencerkan dalam larutan pengencer Tris-Citrat buffer (Tabel 1). Jarak waktu antara
penampungan semen sampai pengenceran tidak lebih dari 15 menit. Pengenceran dilakukan pada
suhu 35°C menggunakan pengencer tris-citrat bagian A. Perlakuan yang diberikan adalah P0=
tanpa prolin dan antioksidan (Kontrol); P1=P0+vit E (1mg/ml); P2=P0+vit C (0,88mg/ml);
2
Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner 2001
P3=P0+prolin (30 µg/ml); P4=P3+vit E; P5=P3+vit C. Hingga mendapatkan total konsentasi
spermatozoa hidup 100 juta/ml.
Tabel 1. Komposisi larutan pengencer untuk semen beku
Bahan
Tris (Hydroxymethhyl amino methan), g
Bagian A
Bagian B
2,452
2,452
Asam sitrat, g
1,32
1,32
Fruktosa, g
1,00
1,00
Kuning telur, ml
20,0
20,0
Glycerol, ml
2,40
12,4
Penicilin G, iu/ml
1000
1000
Streptomycyn, mg/ml
0,5
0,5
Aquabides, ml
80
80
Semen yang telah diencerkan kemudian diturunkan suhunya secara perlahan-lahan
menggunakan mesin pendingin. Waktu yang diperlukan untuk menurunkan suhu dari 35oC ke 5oC
kurang lebih 45-60 menit. Pengencer B ditambahkan dalam tiga kali penambahan dengan volume
yang sama yaitu pada temperatur 15oC, 10oC dan 5oC sehingga total volume pengencer bagian A
sama dengan pengencer bagian B.
Semen diekuilibrasikan pada suhu 5oC selama 3 jam sebelum pembekuan. Dua jam setelah
suhu 5oC, semen dimasukkan kedalam straw yang terlebih dahulu didinginkan pada suhu yang
sama, kemudian ditutup menggunakan serbuk polipinil. Straw disusun pada rak pendingin dibiarkan
selama satu jam sebelum dibekukan. Pembekuan dilakukan didalam uap nitrogen dengan cara
meletakkan rak yang berisi straw berjarak 5 cm diatas permukaan nitrogen cair selama 10 menit,
kemudian dimasukkan kedalam nitrogen cair.
Parameter yang diamati adalah persentase motil dari sperma (%M), persentase sperma hidup
(%H) dan persentase tudung akrosom sperma utuh (%TAU), masing-masing untuk semen setelah
diencerkan dan dibekukan.
Seluruh data yang diperoleh dianalisis secara statistik dengan General Linear Models dari SAS.
Hasil yang berbeda nyata dilanjutkan dengan uji jarak Duncan dari SAS.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil pengamatan kualitas semen segar yang dikoleksi dari seluruh periode penampungan
secara umum kualitasnya baik dan memenuhi syarat untuk dilakukan pengenceran dan pembekuan.
Konsentrasi spermatozoa rata-rata 1,76x109/cc; volume 7,1 cc, persentase hidup (% H) 81,7±4,41%,
warna cream, konsistensi agak kental, dengan persentasi TAU 81,4% yang masih berada diatas
persentase minimal (75%) yang direkomendasikan untuk diberikan perlakuan pengenceran
(SOEBADI, 1980).
3
Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner 2001
Kualitas Semen Setelah Pengenceran
Secara umum kualitas semen setelah pengenceran mengalami penurunan dibanding semen
segar, yaitu terjadi penurunan %M, %H dan penurunan % TAU. Kualitas semen sesudah
pengenceran disajikan dalam Tabel 2.
Hasil analisis statistik menunjukkan penambahan prolin berpengaruh nyata (P<0,05) terhadap
%M, penambahan prolin menghasilkan %M lebih tinggi dibandingkan tanpa prolin (68,1 vs 65,0%).
Sementara itu penambahan antioksidan tidak berpengaruh nyata terhadap %M. Hasil yang diperoleh
selaras dengan yang diperoleh SITUMORANG et al. (2000) dengan menggunakan prolin 15, 30 dan
60 mM dalam semen cair, yaitu menunjukkan %M motil yang lebih tinggi pada penyimpanan 7 dan
13 hari.
Tabel 2. Pengaruh prolin dan antioksidan terhadap kualitas semen sapi sesudah pengenceran (n=9)
Perlakuan
Parameter (%)
Tanpa
Motilitas (M)
Spermatozoa hidup (H)
Tudung
(TAU)
Akrosom
Utuh
+Prolin
Tanpa antioksidan
65.00
68,33
66,67a
Vitamin E
65,56
68,44
67,50a
Vitamin C
64,44
67,78
66,11a
b
a
Rata-rata
Tanpa antioksidan
65,00
73,66
68,51
77,11
75,39ab
Vitamin E
75,66
77,11
76,39a
Vitamin C
71,44
73,33
72,39b
a
a
Rata-rata
Tanpa antioksidan
73,59
71,56
75,85
70,44
71,00a
Vitamin E
69,44
67,11
68,28a
Vitamin C
65,56
62,89
64,22a
Rata-rata
a,b
Rata-rata
Prolin
Antioksidan (n=9)
68,85
a
66,82
a
Superskrip yang berbeda pada kolom dan baris yang sama berbeda nyata (P<0,05)
Penambahan prolin dalam pengencer juga menunjukkan Persentase sperma hidup (%H) yang
lebih baik dibandingkan tanpa prolin (75,85 vs 73,59%) meskipun tidak berbeda nyata. Perbedaan
%H dipengaruhi oleh penambahan antioksidan secara nyata (P<0,05). Penambahan antioksidan Vit
E (P<0,05) lebih tinggi secara nyata (P<0,05) dibandingkan penambahan Vit C (76,39 vs 72,39%)
tetapi tidak berbeda nyata dibandingkan tanpa penambahan antioksidan (75,39%). Hal ini
menunjukkan kemampuan antioksidan vit E dalam mempertahankan %H spermatozoa selama
proses pengenceran dibandingkan penambahan vit C. Meskipun kedua macam vitamin tersebut
dapat memberikan perlindungan terhadap membran plasma spermatozoa dengan cara menurunkan
kepekaan membran plasma terhadap peroksida lipid, tetapi sifat kelarutan berbeda yaitu vitamin E
sifatnya larut dalam lemak dan tak larut dalam air, sedangkan vitamin C kebalikannya (BECONI et
al. 1993).
4
Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner 2001
Pengaruh prolin dan tanpa antioksidan terhadap persen TAU (%TAU) menunjukkan tendensi
yang lebih baik meskipun tidak berbeda nyata secara statistik.
Kualitas semen setelah pembekuan
Secara umum kualitas semen setelah pembekuan mengalami penurunan apabila dibanding
semen segar dan setelah diencerkan. Kualitas semen setelah pembekuan disajikan pada Tabel 3.
Hasil analisis statistik setelah dilakukan pembekuan spermatozoa menunjukkan %M, %H dan
% TAU tidak berbeda nyata, berarti penambahan prolin, antioksidan vitamin E dan vitamin C belum
mampu mempertahankan kualitas sperma setelah pembekuan dibandingkan dengan kontrol.
Kecenderungan kurang efektifnya penambahan antioksidan vit E terhadap kualitas spermatozoa sapi
yang dibekukan dapat juga diakibatkan karena sifat dan daya kerja tokoferol yang khas. PARKS dan
GRAHAM (1992) menjelaskan efek yang kecil dari antioksidan dalam melindungi akrosom karena
tidak adanya sekat pada membran plasma yang menutupi akrosom yang rusak. Pendapat ini
diperkuat oleh BECONI et al. (1993) yang menyatakan bahwa pada semen dengan kualitas bagus
penambahan antioksidan akan mempertahankan kualitas semen yang dibekukan, tetapi tidak
demikian halnya pada semen kualitas jelek karena proses peroksidasi yang sudah terjadi tidak dapat
dihentikan dengan pemberian antioksidan.
Tabel 3. Pengaruh prolin dan antioksidan terhadap kualitas sperma sapi sesudah dibekukan
Perlakuan
Parameter (%)
Motil (M)
Rata-rata
Hidup (H)
Rata-rata
Tudung Akrosom
Utuh (TAU)
Rata-rata
a,b
Antioksidan (n=9)
Tanpa antioksidan
Vitamin E
Vitamin C
Tanpa antioksidan
Vitamin E
Vitamin C
Tanpa antioksidan
Vitamin E
Vitamin C
Prolin (n=9)
Tanpa
43,89
42,22
43,89
43,33a
57,44
58,89
59,33
58,56a
42,67
45,44
45,78
44,63a
Rata-rata
+Prolin
43,89
41,67
40,55
42,04a
56,78
54,89
53,89
55,19 a
42,11
41,11
41,33
41,52a
43,89a
41,94a
42,22a
57,11a
56,89a
56,61a
42,39a
43,28a
43,55a
Superskrip yang berbeda pada kolom dan baris yang sama berbeda nyata (P<0,05)
Hasil yang diperoleh tidak sesuai dengan hasil yang diperoleh SANCHEZ et al. (1992) yang
menyatakan bahwa prolin adalah derivat dari glutamat yang tinggi konsentrasinya dalam cairan
luminal dalam kaput epididimis. Bila ditambahkan dalam cairan pengencer untuk pembekuan
sperma, prolin meningkatkan persentase motil secara signifikan segera setelah thawing dan selama
inkubasi lebih dari 9 jam pada suhu tubuh.
Masalah ini merupakan akibat dari proses pembekuan semen yang berkisar pada fenomena
cold schok terhadap sel spermatozoa dan perubahan interseluler yang berhubungan dengan
pembentukan kristal–kristal es (TOELIHERE,1993). Selain itu kualitas dari semen yang dibekukan
pada temperatur –196oC akan menurun aktifitas spermatozoanya karena sebagian besar (30%)
spermatozoa akan mati selama proses pendinginan (GOLDMAN et al., 1991)
5
Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner 2001
Penurunan Kualitas Semen
Kualitas semen menurun secara signifikan (P<0,05) pada setiap perlakuan baik pada % M,%
H, dan %TAU. Persentase penurunan kualitas semen sebelum sampai sesudah thawing disajikan
pada Tabel 4.
Tabel 4. Pengaruh prolin, antioksidan terhadap penurunan kualitas sperma
Perlakuan
Parameter (%)
Antioksidan (n=9)
Tanpa prolin
+Prolin
Motil (M)
Tanpa antioksidan
21,11
24,44
22,78a
Vitamin E
23,33
27,78
25,56a
Vitamin C
20,56
27,22
23,89a
b
a
Rata-rata
Hidup (H)
Tanpa antioksidan
21,67
16,22
26,48
20,33
18,28a
Vitamin E
16,77
22,22
19,50a
Vitamin C
12,11
19,44
15,78a
b
a
Tanpa antioksidan
15,04
28,89
20,67
28,44
28,67a
Vitamin E
24,56
27,33
25,94a
Vitamin C
20,44
23,56
22,00a
a
a
Rata-rata
Tudung
AkrosomUtuh (TAU)
Rata-rata
a,b
Rata-rata
Prolin (n=9)
24,63
26,44
Superskrip yang berbeda pada kolom dan baris yang sama berbeda nyata (P<0,05)
Penurunan nilai %M terendah dicapai oleh perlakuan tanpa prolin yang berbeda nyata (P<0,05)
dibandingkan dengan penambahan prolin (21,67 vs 26,48). Penurunan kualitas %M antara tanpa
prolin, vit E atau vit Ctidak menunjukkan perbedaan nyata (P>0,05), penurunan terendah pada
perlakuan tanpa antioksidan, diikuti perlakuan vit C dan vit E masing-masing 22,78; 23,89, dan
25,56.
Penambahan prolin berpengaruh nyata terhadap %H, penurunan nilai %H terendah dicapai
oleh perlakuan tanpa prolin (P<0,05) dibanding dengan prolin (15,04 vs 20,67). Penambahan
antioksidan tidak menunjukkan perbedaan nyata terhadap penurunan kualitas baik %M, %H dan
%TAU sebelum dan sesudah pembekuan. Penurunan kualitas TAU tidak berbeda nyata pada
perlakuan prolin maupun penambahan antioksidan.
6
Persen
Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner 2001
30
25
20
15
10
5
0
%M
%H
%TAU
Penurunan Kualitas
P- 0
Prolin
A-0
A-vit E
A-vit C
Gambar 1. Penurunan kualitas spermatozoa sapi sebelum dan sesudah thawing
Penambahan prolin berpengaruh nyata (P<0,05) terhadap penurunan %M dan %H,
penambahan prolin tidak menghasilkan penurunan %M dan %H yang lebih baik apabila
dibandingkan tanpa penambahan prolin (Gambar 1). Penambahan antioksidan tidak memberikan
pengaruh nyata baik pada %M, %H ataupun %TAU, hal ini mungkin disebabkan telah terjadi
kerusakan akibat reaksi peroksidasi yang tidak dapat dihentikan dengan penambahan antioksidan
(BECONI et al., 1993)
KESIMPULAN
Penambahan prolin setelah pengenceran sperma memperbaiki %M dan %H secara nyata, tetapi
tidak mampu mempertahankan motilitas sperma setelah pembekuan. Persentase TAU tidak
dipengaruhi penambahan prolin.
Penambahan vitamin E cenderung lebih baik dibandingkan penambahan vitamin C terhadap
%M dan %H dari sperma setelah pengenceran, tetapi antioksidan tidak efektif melindungi
spermatozoa setelah pembekuan.
Penambahan prolin tidak mampu menekan penurunan kualitas sperma, sedangkan penambahan
antioksidan vitamin C cenderung mengurangi penurunan kualitas sperma.
DAFTAR PUSTAKA
BECONI, M.T., C.R. FRANCIA, N.G. MORA and M.A. AFRANCHIRO. 1993. Effect of natural antioksidant on
frozen bovine semen preservation.
GAMMAN, P.M. and K.B. SHERRINGTON. 1981. Pengantar Ilmu Pangan Nutrisi dan Mikrobiologi. Edisi 2.
Gadjah Mada University Press. Yogyakarta.
7
Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner 2001
GOLDMAN. E.F, JE. ELLINGTON, FB FARREL and R.H. FOOTE 1991: Use of fresh and frozen thawed bull sperm
in vitro. Theriogenology 35; 204.
HAMMERSTEDT, R.H l993; Maintenance of bioenergetic balance in sperm and prevention of lipid
peroxidation.A review of the effects on design and storage preservation system. Reprod.Fert.Div;5; 675690.
PARKS J.E and J.K GRAHAM 1992; Effects of cryopreservation procedures on sperm membranes.
Theriogenology 38: 209–222.
SETCHELL, B.P., L.G. SANCHEZ-PARTIDA and A. CHAIRUSSYUKUR. 1993. Epididimis constituen and related
substances in the storage of spermatozoa: Review. Reproduction and Fertility Development. 5. 601-612.
SANCHEZ-PARTIDA, L.G. MAWELL W.M.C., PALEG, L.G. and SETCHELL, B.P. 1992. Proline and glicine
butanine in cryorotective diluents for ram spermatozoa. Reprod. Fertile Dev. 4. 113-118.
SITUMORANG P, E.TRIWULANINGSIH, A.LUBIS,W.CAROLINE, T.SUGIARTI 2000:Pengaruh Proline,Carnitine
terhadap daya Hidup Spermatozoa yang Disimpan Dalam Suhu 5oC.
SOEBADI P.1980: Ilmu reproduksi Hewan.Fakultas Kedokteran Veteriner Jurusan Reproduksi. IPB Bogor.
TOELIHERE, M.R. 1981. Fisiologi Reproduksi Pada Ternak. Angkasa. Bandung.
TOELIHERE, M.R. 1993. Inseminasi Buatan Pada Ternak. Angkasa. Bandung.
8