hasil - IPB Repository

HASIL
Produk Amplifikasi dan Perunutan Nukleotida Berdasarkan Gen Leptin dan
Gen Miostatin
Hasil amplifikasi gen leptin menggunakan pasangan primer forward L5
dan reverse L6 menunjukkan ukuran 234 pb (Gambar 5a), dan amplifikasi gen
miostatin menggunakan pasangan primer forward AF56 dan reverse AF74
menghasilkan produk dengan ukuran 580 pb (Gambar 5b). Sampel yang berhasil
teramplifikasi berjumlah sembilan sampel, yaitu tiga sampel berasal dari populasi
sapi aceh dan enam sampel berasal dari populasi sapi madura.
M 1
2
3 4
5
6
7 8 9
M 1
2
3 4
5
6
7 8 9
580 pb
234 pb
(a)
(b)
Gambar 5 Produk amplifikasi gen leptin daerah ekson 2 (a) dan gen miostatin (b).
M:Penanda, 1:sapi aceh (Kml_BosA11), 2:sapi aceh (Kml_BosA12),
3:sapi aceh (Kml_BosA13), 4:sapi madura (AF14), 5:sapi madura
(AF26), 6:sapi madura (AF38), 7:sapi madura (AF32), 8:sapi madura
(AF41), 9:sapi madura (AF29).
Perunutan nukleotida gen leptin setelah disejajarkan menunjukkan ukuran
sebesar 176 pb. Sisa nukleotida yang tidak berhasil disejajarkan merupakan
primer reverse dan nukleotida setelahnya. Nukleotida yang tidak berhasil
disejajarkan disebabkan oleh faktor efisiensi bahan kimia yang digunakan pada
tahap amplifikasi sehingga menghasilkan duplikasi pada elektroferogram. Primer
reverse merupakan salah satu faktor yang menentukan keberhasilan amplifikasi.
Pada posisi awal runutan nukleotida ditemukan primer forward sesuai dengan
daerah yang ditargetkan. Posisi primer forward berada pada -151 nt dari kodon
awal ATG. Posisi kodon awal ATG pada gen leptin terletak pada ekson 2. Posisi
kodon awal pada penelitian ini ditemukan sesuai dengan posisi pada urutan
referensi dari data GenBank, yaitu B. indicus haplotipe GCATC dengan no asesi
FJ626855.1 (Gambar 6). Perunutan nukleotida gen miostatin setelah disejajarkan
dengan urutan referensi dari GenBank menunjukkan ukuran sebesar 523 pb. Sisa
nukleotida dari hasil amplifikasi merupakan primer forward sebesar 23 pb dan
nukleotida setelahnya sebesar 38 pb.
Gambar 6 Posisi kodon awal (ATG) pada daerah ekson 2 gen leptin berdasarkan
B. indicus (No. akses FJ626855.1).
Haplotipe Gen Leptin pada Sapi Aceh dan Sapi Madura
Urutan nukleotida gen leptin sepanjang 176 pb yang disejajarkan dengan
urutan referensi dari data GenBank menunjukkan polimorfisme. Polimorfisme
tersebut membedakan sapi aceh dan sapi madura dengan B. indicus haplotipe
ATGCT, B. indicus haplotipe GCATC, B. taurus, B. frontalis, dan sapi hibridisasi
B. indicus x B. taurus dari data GenBank. Secara umum gen leptin terdiri atas dua
haplotipe, yaitu haplotipe ATGCT dan haplotipe GCATC. Perbedaan haplotipe
pada gen leptin didasarkan pada lima titik mutasi. Pada penelitian ini perbedaan
haplotipe hanya ditemukan pada tiga titik mutasi, yaitu pada posisi 32 nt, 87 nt,
dan 89 nt (Lampiran 1). Perbandingan urutan nukleotida antara sapi aceh dengan
B. indicus haplotipe ATGCT menunjukkan empat perbedaan, tiga perbedaan di
antaranya membedakan antara sapi aceh dengan B. indicus haplotipe ATGCT.
Sapi aceh mengikuti pola haplotipe GCATC (Gambar 7a). Pada hasil perunutan
nukleotida pada sapi madura menunjukkan perbedaan haplotipe antar sampel.
Sapi madura mempunyai dua haplotipe, yaitu haplotipe ATGCT dan haplotipe
GCATC. Urutan nukleotida sampel sapi madura (AF14) mengikuti pola haplotipe
ATGCT, sedangkan runutan nukleotida sampel sapi madura lainnya mengikuti
pola haplotipe GCATC (Gambar 7b).
(a)
(b)
Gambar 7 Posisi tiga titik mutasi pada penelitian ini menunjukkan perbedaan
haplotipe: (a) Haplotipe GCATC pada sapi aceh, (b) Haplotipe
ATGCT dan haplotipe GCATC pada sapi madura.
Keragaman Gen Leptin dan Perubahan Asam Amino
Pada gen leptin daerah ekson 2 antara sapi aceh dan sapi madura dengan
B. indicus haplotipe ATGCT, B. indicus haplotipe GCATC, B. taurus, dan sapi
hibridisasi B. indicus x B. taurus dari data GenBank ditemukan 12 varian. Tiga
varian membedakan antara sapi aceh, sapi madura, dan runutan referensi dari data
GenBank berdasarkan haplotipe, delapan polimorfisme hanya dimiliki oleh sapi
hibridisasi antara B. indicus dengan B. taurus, dan satu polimorfisme ditemukan
pada dua sampel sapi aceh dan satu sampel sapi madura (Gambar 8).
Perubahan satu basa nukleotida pada dua sampel sapi aceh dan satu sampel
sapi madura ditemukan pada posisi - 91 nt dari kodon awal ATG. Pada posisi
tersebut dua sampel sapi aceh dan satu sampel sapi madura mempunyai basa T,
sedangkan satu sampel sapi aceh, lima sampel sapi madura, dan populasi lainnya
dari data GenBank mempunyai basa C (Gambar 8). Tiga basa nukleotida yang
membedakan antara haplotipe ATGCT dengan haplotipe GCATC ditemukan pada
posisi -63 nt, -65 nt, dan -120 nt. Pada posisi -63 nt mengalami perubahan basa A
menjadi basa G. Pada posisi -65 nt mengalami perubahan basa T menjadi basa C.
Pada posisi -120 nt ditemukan perubahan basa G menjadi basa A. Mutasi yang
terjadi pada posisi sebelum kodon awal ATG tidak ditranskripsikan ke dalam
asam amino.
Gambar 8 Keragaman gen leptin daerah ekson 2 pada sapi aceh dan sapi madura
Keragaman Gen Miostatin pada Sapi Aceh dan Sapi Madura
Keragaman gen miostatin pada ruas promotor setelah diurutkan antara sapi
aceh dan sapi madura dengan B. taurus dari data GenBank menunjukkan 10
perbedaan. Tiga perbedaan ditemukan pada sapi aceh dan sapi madura, yaitu
perubahan basa T→C pada posisi 494 nt, C→T pada posisi 508 nt, dan A→G
pada posisi 575 nt. Tujuh perbedaan ditemukan pada sapi madura, sedangkan
urutan nukleotida pada sapi aceh mempunyai kesamaan dengan B. taurus. Mutasi
yang membedakan antara sapi madura dengan sapi aceh dan B. taurus adalah
perubahan basa T menjadi basa C pada posisi 499 nt. Selain itu, enam mutasi
lainnya tidak hanya membedakan antara sapi madura dengan sapi aceh tetapi juga
membedakan antar sampel sapi madura, yaitu perubahan basa C→T pada posisi
350 nt, perubahan basa G→A pada posisi 423 nt, perubahan basa A→G pada
posisi 456 nt, perubahan basa C→G pada posisi 459 nt, perubahan basa A→G
pada posisi 490 nt, dan satu delesi basa T ditemukan pada sampel sapi madura
pada posisi 560 nt (Gambar 9).
Gambar 9 Keragaman gen miostatin daerah promotor pada sapi aceh dan sapi
madura
Analisis Filogeni Berdasarkan Gen Leptin
Rekonstruksi pohon filogeni gen leptin berdasarkan persamaan dan
perbedaan haplotipe. Gen leptin mempunyai dua kelompok haplotipe secara
umum, yaitu haplotipe ATGCT dan haplotipe GCATC. Haplotipe dibedakan
berdasarkan lima titik mutasi. Pada penelitian ini perbedaan haplotipe sepanjang
nukleotida yang telah diurutkan hanya ditemukan tiga titik mutasi. Pada pohon
filogeni sapi aceh berada pada percabangan haplotipe GCATC, sedangkan sapi
madura mempunyai dua kelompok percabangan, yaitu percabangan haplotipe
AGCAT dan haplotipe ATGCT (Gambar 10). Urutan haplotipe sapi aceh
mengikuti pola GCATC sehingga pada pohon filogeni sapi aceh berada pada satu
kelompok dengan B. indicus haplotipe GCATC dari data GenBank (No. Asesi
FJ626855.1). Sapi madura mempunyai pola haplotipe ATGCT berada pada satu
kelompok dengan B. indicus haplotipe ATGCT (No. Asesi FJ626856.1),
sedangkan sapi madura mempunyai pola
haplotipe GCATC
berada pada
kelompok B. indicus haplotipe GCATC (No. Asesi FJ626855.1). Percabangan
antara sapi madura dengan B. indicus haplotipe ATGCT menunjukkan nilai
bootstrap sebesar 89% berdasarkan nukleotida. Nilai bootstrap di atas (≥50%)
menunjukkan kekuatan percabangan (Robust) yang mendukung pengelompokan
sapi madura dengan B. indicus haplotipe ATGCT (No. Asesi FJ626856.1). Selain
sapi madura, jenis sapi lainnya yang mempunyai kemiripan urutan nukleotida
dengan B. indicus haplotipe ATGCT adalah B. frontalis (EU642566.1), tetapi titik
mutasi posisi -64 nt pada B. frontalis berbeda dengan B. indicus haplotipe
ATGCT, sehingga pada percabangan filogeni B. frontalis menunjukkan
sistergroup dari kelompok sapi madura dan B. indicus haplotipe ATGCT.
Gambar 10
Rekonstruksi pohon filogeni gen leptin berdasarkan nukleotida
menggunakan metode Neighbour-Joining (NJ), model Kimura-2Parameter, dan butsrap pengulangan 1000x.
Topologi pohon filogeni berdasarkan gen leptin tidak menunjukkan
percabangan yang berbeda antara kelompok sapi aceh dan sapi madura dengan
kelompok Bos taurus. Pola haplotipe B. taurus GCATC berada pada percabangan
yang sama dengan sapi aceh dan sapi madura haplotipe GCATC. Sampel sapi
aceh (Kml_BosA11 dan Kml_BosA13) dan sapi madura (AF38) menunjukkan
percabangan khusus di dalam kelompok B. indicus haplotipe GCATC pada pohon
filogeni. Percabangan tersebut menunjukkan nilai bootstrap sebesar 63%.
Pengelompokan
tersebut
membentuk
percabangan
tersendiri
mempunyai
perbedaan pada satu nukleotida.
Pengelompokan sapi aceh dan sapi madura dengan sapi hibridisasi antara
B. indicus dengan B. taurus tidak pada satu percabangan yang sama. Sapi B.
indicus X B. taurus mempunyai kesamaan haplotipe dengan B. indicus haplotipe
GCATC (No. Asesi FJ626855.1), tetapi sapi hibridisasi tersebut mengalami
mutasi di delapan posisi nukleotida. Perbedaan posisi nukleotida antara sapi hibrid
dengan sapi aceh dan sapi madura haplotipe GCATC menyebabkan percabangan
pada pohon filogeni terpisah antara
kelompok sapi aceh dan sapi madura
haplotipe GCATC dengan kelompok sapi B. indicus X B. taurus.
Analisis Filogeni Berdasarkan Gen Miostatin
Topologi pohon filogeni berdasarkan gen miostatin memisahkan sapi aceh
dengan sapi madura (Gambar 11). Pemisahan kelompok sapi aceh dengan sapi
madura disebabkan oleh tujuh variasi nukleotida. Kelompok sapi aceh berada
pada satu percabangan dengan B. taurus dari data GenBank (No. akses
AF348479.1). Pada pohon filogeni percabangan sapi madura antar sampel yang
digunakan menunjukkan perbedaan pengelompokan. Sampel sapi madura (AF38,
AF14, AF26, dan AF41) mengelompok pada percabangan yang sama. Cabang
pohon filogeni pada kelompok sapi madura (AF38, AF14, AF26, dan AF41)
didukung dengan nilai bootstrap sebesar 94%. Sapi madura (AF29) dan sapi
madura (AF32) terpisah dari percabangan pertama. Perbedaan cabang antara sapi
madura (AF38, AF14, AF26, dan AF41) dengan sapi madura (AF29) dan sapi
madura (AF32) disebabkan tiga variasi nukleotida. Percabangan sapi madura
(AF32) terpisah dari kelompok sapi madura lainnya. Perbedaan cabang antara sapi
madura (AF32) terpisah dengan sapi madura lainnya disebabkan adanya dua
variasi nukleotida. Pengelompokan sapi madura tersebut didukung dengan nilai
bootstrap sebesar 72%.
Pada penelitian ini Ovis aries (DQ530260.1) digunakan sebagai outgroup
untuk membedakan cabang pengelompokan sapi aceh dengan sapi madura. Ovis
aries mempunyai karakter nukleotida gen Leptin yang sangat berbeda dengan sapi
aceh dengan sapi madura, sehingga percabangan O. aries pada pohon filogeni
tidak masuk ke dalam ingrup. Percabangan O. aries yang berbeda dari ingroup
(Sapi aceh dan sapi madura) disebabkan adanya 40 variasi nukleotida.
Gambar 11 Rekonstruksi pohon filogeni gen miostatin menggunakan metode
Neighbour-Joining (NJ) berdasarkan model Kimura-2-Parameter
dengan butsrap pengulangan 1000x.