9 II. MATERI DAN METODE 2.1 Waktu dan Tempat Penelitian

II. MATERI DAN METODE
2.1 Waktu dan Tempat Penelitian
Tempat pengambilan sampel daun jati (Tectona grandis Linn. f.) dilakukan di
enam desa yaitu tiga desa di Kecamatan Grokgak dan tiga desa di Kecamatan Seririt
(Tabel 1). Ektraksi DNA dan PCR akan dilakukan di Laboratorium Bioteknologi
Jurusan Agroekoteknologi Fakultas Pertanian Universitas Udayana dari bulan
Oktober 2011 – Januari 2012.
2.2 Alat dan Bahan Penelitian
Bahan yang digunakan sebagai sampel adalah daun jati (Tectona grandis
Linn. f.). Bahan-bahan yang digunakan untuk ektraksi dan visualisasi DNA adalah
buffer ekstraksi yang mengandung 2% CTAB (Cetiltrimetilamonium bromida), 100
mM Tris-HCl pH 8, 1,4 M NaCl, 50 mM EDTA (ethylendiaminetetra-acetic acid),
dan 0,2% β-merkaptoetanol, aquades, buffer TAE (Tris-acetate-EDTA), kloroform
isoamilalkohol (KIA) 24:1, isopropanol dingin, ethanol 70%, RNAse-A, loading
buffer, ethidium bromide 0,05%, untuk elektroforesis hasil ekstraksi DNA digunakan
1% gel agarosa dan elektroforesis produk PCR digunakan 4% gel agarosa. Untuk
PCR bahan yang digunakan adalah DNA cetakan Taq polymerase, buffer PCR,
MgCl2, primer, air steril (H20), gliserol dan dNTP.
9
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah kamera digital,
timbangan analitik, mortar dan pestle, vortex, microcentrifuge, autoclave, water bath,
oven, pipet mikro, microtube, microwave, spatula, mesin PCR (MyGenie-Korea), unit
elektrophoresis (GelMate 2000), UV-Transluminator (Biorad-Jerman), mistar, dan
alat tulis.
Tabel 1. Lokasi Pengambilan Sampel Daun Jati (Tectona grandis Linn. f.)
No
1.
Populasi
Kecamatan
Desa
-
Desa Tinge – tinge
Jumlah
Sampel
5
Posisi
ALT : 133 FT
S : 08˚12.048’
Gerokgak
E : 114˚51.134’
-
Desa Pengulon
5
ALT : 133 FT
S : 08˚11.875’
E : 114˚49.343’
-
Desa
5
ALT : 118 FT
S : 08˚12.110’
CelukanBawang
E : 114˚51.395’
2.
Kecamatan Seririt
-
Desa Uma Anyar
5
ALT : 301 FT
S : 08˚11.080’
E : 114˚55.500’
-
Desa Kalisada
5
ALT : 166 FT
S : 08˚11.929’
E : 114˚52.543’
-
Desa Tanguisia
5
ALT : 121 FT
S : 08˚11.758’
E : 114˚56.774’
TOTAL SAMPEL
30
10
2.3 Pelaksanaan Penelitian
Pelaksanaan penelitian terdiri dari dua tahap yaitu persiapan bahan dan
prosedur kerja. Adapun pelaksanaan masing-masing tahapan tersebut adalah sebagai
berikut.
2.3.1. Persiapan Bahan
Daun yang diambil adalah daun yang masih berwarna hijau segar. Kemudian
daun dipotong sebesar 3x3 cm. Setelah itu daun dicuci dengan air mengalir,
dikeringkan dengan mengggunakan kertas tissue. Selanjutnya daun ditimbang hingga
mencapai berat sekitar 0,2 g.
2.3.2. Prosedur Kerja
2.3.2.1. Isolasi DNA
Isolasi DNA dilakukan dengan menggunakan metode CTAB yang
dikembangkan oleh Doyle dan Doyle (1990). Isolasi DNA dimulai dengan
menggerus 0,2 g daun sampai halus di dalam mortar, kemudian ditambahkan 1 ml
buffer
ekstraksi
yang
telah
mengandung
0,2%
ß-mercaptoetanol
dengan
menggunakan mikropipet kemudian dilakukan penggerusan kembali hingga daun
benar-benar halus disertai dengan penambahan 1 ml buffer ekstraksi kemudian
dimasukkan kedalam tabung.
11
Tabung diinkubasi pada suhu 65ºC didalam water bath selama 45-60 menit
disertai dengan membolak-balik tabung setiap 10 menit. Selanjutnya disentrifugasi
pada kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit. Supernatan dipindahkan ke tabung baru
dan ditambahkan 1x volume kloroform: isoamilalkohol (24:1). Kemudian divortex,
dan disentrifugasi pada kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit.
Fase cair bagian atas (supernatan) dipindahkan ke tabung baru disertai dengan
penambahan isopropanol dingin kemudian dibolak-balik sampai DNA terpresipitasi
yang ditandai dengan munculnya benang-benang putih. Selanjutnya diinkubasi
selama satu malam pada suhu -20oC.
Setelah inkubasi, dilakukan sentrifugasi selama 5 menit pada kecepatan
12.000 rpm. Larutan isopropanol dibuang, pellet DNA dicuci dengan 500 l ethanol
70% dan disentrifugasi selama 5 menit. Kemudian ethanol dibuang secara hati-hati,
dan DNA dikeringkan dengan membalik tabung di atas kertas tissue.
Untuk melarutkan pellet DNA ditambahkan 100 l aquadest steril dengan
menggunakan pipet mikro, dan ditambah RNAse (konsentrasi akhir 10 µg/ml) dan
diinkubasi pada suhu 37oC selama 30 menit. Selanjutnya disimpan sebagai stok pada
suhu -20oC.
12
2.3.2.2 Elektroforesis dan Penentuan Konsentrasi DNA
Elektroforesis dilakukan untuk melihat hasil isolasi DNA. Jumlah DNA hasil
isolasi ditentukan dengan elektroforesis pada gel agarosa 1% dalam buffer TAE.
Agarosa 0,5 gram ditambahkan dengan 50 ml buffer TAE 1X kemudian dimasukkan
kedalam tabung erlemenyer, dan dipanaskan dalam microwave ± selama 1 menit
sampai gel terlihat benar-benar bening. Gel dituang kedalam cetakan kemudian
didiamkan pada suhu kamar hingga gel mengental, selanjutnya gel dimasukkan ke
dalam tangki elektroforesis yang telah berisi buffer TAE. Sebanyak 3 μl DNA
genomik dari hasil isolasi dicampur dengan 1 μl loading dye di atas kertas parafilm,
lalu dimasukkan ke dalam parit gel agarosa. Mesin elektroforesis dialiri listrik pada
tegangan 100 volt selama 60 menit. Pewarnaan dilakukan dengan cara merendam gel
dalam ethidium bromide selama 30-45 menit. Pengamatan DNA dilakukan di bawah
lampu UV dan dilakukan pemotretan.
2.3.2.3. Amplifikasi DNA Mikrosatelit dengan Polymerase Chain
Reaction (PCR)
Proses amplifikasi DNA adalah proses perbanyakan DNA secara enzimatis.
Total keselurahan siklus pada proses amplifikasi DNA dengan PCR adalah 35 siklus
yang didalamnya terdapat tiga proses, yaitu (1) proses denaturasi DNA pada suhu
940C selama 1-5 menit, (2) proses penempelan DNA (annealing) pada suhu 50-550C
selama 3 menit (tergantung primer yang digunakan) dan (3) proses ekstensi
(pemanjangan) pada suhu 720C selama 2 menit serta satu siklus pemanjangan akhir
13
pada suhu 720C selama 7 menit. Pada suhu tinggi pita ganda tersebut berpisah
menjadi dua utas tunggal. Apabila pita ganda DNA telah terpisah, maka pada tahap
kedua terjadi penempelan primer pada kedua ujung DNA sebagai titik awal
pembacaan dan perbanyakan basa-basa DNA. Selanjutnya dilakukan proses
pemanjangan dan pembentukan utas DNA yang baru (ekstensi).
Reaksi PCR mikrosatelit DNA dilakukan dalam volume reaksi 20 µl yang
mengandung: 2 µl DNA genomik, 2 µl buffer reaksi PCR, 2 µl MgCl2, 2 µl dNTP, 2
µl forward primer, 2 µl reverse primer, 0,2 µl Taq DNA polymerase, 1 µl gliserol dan
H2O. Dalam penelitian ini menggunakan tiga primer yaitu CIRAD1TeakH10,
CIRAD1TeakF05 dan CIRAD3TeakBO2 yang dapat dilihat pada tabel berikut :
Tabel 2. Nama Primer, Urutan Basa, Motif Repeat dan Ukuran Produk Mikrosatelit
Primer (Verhaegen et al., 2005).
Nama primer
CIRAD1TeakH10
CIRAD3TeakB02
CIRAD1TeakF05
(TC)16
Ukuran
produk (pb)
225–273
(TC)11GC(TC)4(N)62(AC)7
216–252
(GA)20GT(GA)3
249–279
Urutan basa
F: 5-CGATACCTGCGATGCGAAGC-3
R:5-CGTTGAATACCCGATGGAGA-3
F: 5-ATGAAGACAAGCCTGGTAGCC-3
R:5-GGAAGACTGGGGAATAACACG-3
F: 5-CTTCTGCAACCCTTTTTCAC-3
R: 5-AGCCATATCTTCCTTTCTCT-3
Motif repeat
14
2.3.2.4 Elektroforesis Produk PCR
Pengamatan hasil PCR dilakukan dengan elekroforesis pada 4% gel agarosa
(Sambrook et al., 1989). Sebanyak 6 µl produk PCR dielektroforesis selama 60
menit dan diwarnai dengan ethidium bromide dan diamati pada lampu uv. Untuk
menentukan ukuran produk PCR digunakan DNA ladder 100 pb.
2.4 Analisis Data
2.4.1 Penentuan Ukuran Fragment DNA
Setelah dilakukan visualisasi fragment DNA, dilakukan penentuan ukuran
masing-masing
fragment DNA hasil PCR dengan kertas semilog. Dalam kertas
semilog ukuran pb diplot sebagai sumbu y sedangkan jarak DNA hingga sumur gel
diplot sebagai sumbu x. Pertama, diukur jarak migrasi DNA ladder hingga sumuran
gel menggunakan penggaris. Selanjutnya diukur jarak migrasi masing-masing
fragment DNA hasil PCR, kemudian ditarik garis lurus yang memotong garis antara
sumbu x dan sumbu y sehingga akan didapat ukuran sebenarnya dari fragment DNA
tersebut.
2.4.2 Penentuan Hubungan Kekerabatan
Pita-pita DNA yang telah diketahui ukurannya kemudian di-scoring. Pita
DNA diberi skor A jika ada dan skor T jika tidak ada. Selanjutnya hasil scoring
dianalisis dengan software MEGA versi 5.05. Dilakukan analisis cluster dengan
Neighbor-Joining Tree Method.
15
2.4.3 Menghitung Nilai Heterosigositas
Analisis keragaman genetik dari tanaman jati (Tectona grandis Linn. f.)
dihitung berdasarkan rumus (Nei, 1987). Frekuensi masing-masing alel setiap lokus
mikrosatelit dihitung berdasarkan rumus Nei (1987) :
Xi = (2nii + Σnij) / (2n)
Keterangan : j ≠ 1
Xi = frekuensi alel ke-i
nij = jumlah individu untuk genotip AiAj
nii = jumlah individu untuk genotip AiAi
n = jumlah sampel
Derajat heterozigositas (ĥ) dihitung berdasarkan frekuensi alel pada tiap lokus
DNA mikrosatelit dengan rumus Nei (1987) sebagai berikut:
ĥ = 2n (1-Σxi2) / (2n-1)
Keterangan :
xi = frekuensi alel Lokus ke-i
n = jumlah sampel
ĥ = heterozigositas lokus
16
Ragam heterozigositas (Vsl(ĥ)) diantara individu dalam satu kesatuan
frekuensi alel populasi pada tiap lokus DNA mikrosatelit dapat dihitung dengan
rumus sebagai berikut :
2
2n ( 2n  1)
Vsl(ĥ) =
{2(2n-2) {Σxi3 – (Σxi2)2}+Σxi2-(Σxi2)2}
dan standar error (SE) diperoleh dari akar ragam heterozigositas. Rerata
heterozigositas (Ĥ) dari semua lokus DNA mikrosatelit yang diuji (r) dihitung dengan
rumus sebagai berikut :
Ĥ = Σ ĥj / r
Keterangan :
ĥj = derajat heterozigositas untuk lokus ke-j
r = jumlah lokus yang diuji
Ĥ = rataan heterozigositas
17