JKK, Tahun 2014, Volume 3(3), halaman 30-35 ISSN 2303-1077 UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN, TOTAL FENOL DAN TOKSISITAS DARI EKSTRAK DAUN DAN BATANG LAKUM (Cayratia trifolia (L) Domin) Rumayati1*, Nora Idiawati1, Lia Destiarti1 Program Studi Kimia, Fakultas MIPA, Universitas Tanjungpura, Jl. Prof. Dr. H. Hadari Nawawi, *email: [email protected] 1 ABSTRAK Lakum (Cayratia trifolia) merupakan salah satu tumbuhan yang berpotensi sebagai antioksidan alami. Oleh karena itu, penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas antioksidan, kandungan total fenol dan aktivitas toksisitas ekstrak metanol, fraksi n-heksana, fraksi kloroform dan fraksi metanol daun dan batang lakum. Uji aktivitas antioksidan menggunakan metode DPPH (2,2-difenil-1-pikril-hidrazil), uji kandungan total fenol menggunakan metode Folin-Ciocalteu dan uji toksisitas menggunakan metode Brine Shrimp Lethality Test. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa % rendemen tertinggi yaitu pada fraksi metanol daun 25,617%. Hasil skrining fitokimia menunjukkan bahwa ekstrak dan fraksi metanol daun dan batang mengandung senyawa alkaloid, flavonoid, polifenol dan steroid. Fraksi n-heksana dan kloroform daun dan batang mengandung senyawa polifenol dan steroid. Aktivitas antioksidan terdapat pada fraksi metanol batang lakum memilki dengan nilai IC50 60 ppm dan kandungan total fenol tertinggi yaitu sebesar 57,7 μg/mL. Uji toksisitas menunjukkan bahwa fraksi kloroform dan metanol batang memiliki aktivitas toksisitas yang tertinggi dengan nilai LC50 91,7 ppm. Hal ini mengindikasikan bahwa fraksi metanol bersifat aktif sebagai antioksidan dan fraksi kloroform batang bersifat aktif sebagai antikanker. Kata kunci : antiokisdan, Cayratia trifolia, lakum, skrining fitokimia, total fenol, toksisitas steroid, sterol, polifenol, flavonoid, glikosida (Karthik et al., 2010 dan Patil et a., 2000). Adanya penelitian sebelumnya dari beberapa bagian tumbuhan lakum dan species Cayratia maka diduga daun dan batang lakum juga berpotensi sebagai antioksidan dan antikanker. Namun, sampai saat ini belum ada referensi tentang kandungan total fenol, uji toksisitas dan aktivitas antioksidan dari daun dan batang lakum. Oleh karena itu perlu dilakukan pengujian skrining fitokimia, penentuan total fenol, aktivitas antioksidan, dan uji toksisitas dari ekstrak dan fraksi daun dan batang lakum. PENDAHULUAN Lakum (Cayratia trifolia) merupakan salah satu tumbuhan tropis yang termasuk ke dalam keluarga Vitaceae dan termasuk jenis tanaman liar yang mudah dijumpai di hutan, terutama di kawasan tepi sungai. Bagian tumbuhan lakum yang sering digunakan oleh masyarakat yaitu bagian buah, batang dan daun. Daun lakum, secara empiris, telah digunakan oleh masyarakat untuk minuman herbal bagi wanita yang habis melahirkan dan obat bisul. Lakum memiliki family yang sama dengan daun anggur ungu (Vitis vinifera L). Penelitian terhadap tumbuhan lakum telah dilakukan oleh beberapa peneliti yaitu lakum mengandung senyawa flavonoid, tannin, saponin, triterpenoid, antrakuinon dan alkaloid yang berpotensi sebagai antioksidan (Kumar et al., 2012, Perumal et al., 2012, Widhiana, dkk, 2012). Gupta et al. (2012), melaporkan bahwa ekstrak petroleum eter daun Cayratia trifolia (Linn) memiliki potensi sebagai antiinflamasi. Penelitian golongan senyawa kimia daun dan batang 7 spesies Cayratia spp (C. anemonifolia, C. auriculata, C. carnosa, C. elongata, C. planicaulis, C. pedata dan C. trilobata) yaitu memiliki kandungan kimia karbohidrat, lignin, METODOLOGI PENELITIAN Alat dan Bahan Alat-alat yang akan digunakan pada penelitian adalah alat rotary evaporator, blender, kertas saring, botol vial, penangas air, neraca analitik, seperangkat alat gelas, corong pisah, pipet mikro dan spektrofotometer UV-VIS Genesys 6. Bahan-bahan yang akan digunakan pada penelitian adalah akuades (H2O), sampel, larva udang, asam klorida (HCl), asam sulfat (H2SO4), kloroform, besi (III) klorida (Fe3Cl), 2,2-difenil-1pikril-hidrazil (DPPH), metanol (CH3OH), natrium karbonat (Na2CO3), natrium hidroksida (NaOH), n-heksana (C6H14), dimetil sulfoksida (DMSO), 30 JKK, Tahun 2014, Volume 3(3), halaman 30-35 ISSN 2303-1077 pereaksi Wagner, pereaksi Mayer, pereaksi Lieberman-Burchard, asam tanat, reagen FolinCiocalteu dan Asam Askorbat (vitamin C). Penentuan kandungan total fenol (Bhaskar et al., 2011) Penentuan Kandungan total fenol dilakukan dengan metode Folin-Ciocalteu. Sebanyak 0,5 mL larutan ekstrak 0,05% dari ekstrak metanol, fraksi metanol, fraksi kloroform dan fraksi nheksana dan dicampurkan 0,75 mL reagen Folin-Ciocalteu 10% dan 2 mL Na2CO3 (2% w/v). Kemudian campuran dihomogenkan dengan alat vortek selama 15 detik dan dipanaskan pada suhu 45oC selama 15 menit. Absorbansi sampel diukur pada λmaks 720 nm menggunakan spektrofotometer UV-Vis. Kurva standar asam tanat ditetapkan dengan menggunakan persamaan regresi linier, yang menyatakan hubungan antara konsentrasi asam tanat (0, 20, 40, 60, 80, 100 ppm) yang dinyatakan sebagai sumbu X dengan besarnya absorbansi hasil reaksi asam tanat dengan pereaksi Folin-Ciocalteu yang dinyatakan sebagai sumbu Y. Prosedur Penelitian Preparasi Sampel Sampel tumbuhan lakum diperoleh dari Jalan Parit Husein I Kota Pontianak Kalimantan Barat dibersihkan dan dilakukan determinasi spesies di Herbarium Bogoriense Pusat Penelitian Biologi-LIPI Bogor. Selanjutnya dipisahkan antara batang dan daun, Kemudian sampel dikeringanginkan dan dihaluskan dengan menggunakan blender. Ekstraksi dan Partisi Sampel Serbuk daun lakum 1,4 Kg dan batang lakum 1,5 Kg yang telah kering dimaserasi dengan metanol selama 3x24 jam pada suhu kamar. Ekstrak kemudian disaring agar diperoleh filtrat yang terpisah dari residu. Ekstrak metanol kemudian dilakukan partisi menggunakan pelarut dengan tingkat kepolaran yang berbeda yaitu pelarut n-heksana dan pelarut kloroform selanjutnya dipekatkan menggunakan evaporator untuk memperoleh ekstrak pekat dari masing-masing fraksi. Uji aktivitas antioksidan dengan metode DPPH (Kekuda et al., 2009) Sebanyak 1 mL larutan dari ekstrak metanol dan masing-masing fraksi (metanol, kloroform dan n-heksana) dengan konsentrasi 50, 100, 150, 200, dan 250 µg/mL dicampurkan dengan 2 mL larutan DPPH 0,002%, kemudian campuran didiamkan selama 30 menit. selanjutnya serapannya diukur pada panjang gelombang 525 nm. Sebagai kontrol positif digunakan vitamin C (konsentrasi 2, 4, 6, 8 dan 10 ppm). Kekuatan inhibisinya dihitung menggunakan rumus : Analisis fitokimia Identifikasi kandungan kimia dalam ekstrak dilakukan terhadap senyawa senyawa (Harbone, 1987): a. Steroid/ triterpenoid Sebanyak 1 ml larutan ekstrak ditambah dengan pereaksi Lieberman-Burchard. Adanya senyawa steroid ditandai timbulnya warna hijau atau biru dan triterpenoid menimbulkan warna merah atau violet. % Inhibisi= x100% Uji toksisitas dengan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) (McLaughlin, 1998) b. Alkaloid Larutan ekstrak sebanyak 3 ml ditambah dengan 1 ml HCl 2 N, dan 6 ml air suling, kemudian panaskan selama 2 menit, dinginkan kemudian disaring. Filtrat diperiksa adanya senyawa alkaloid dengan pereaksi Dragendorff, Mayer dan Wagner a. Persiapan larva udang dan larutan induk Wadah disekat dua bagian, diisi dengan air laut sebanyak 1 liter. Telur Artemia salina dimasukkan pada bagian sekat yang tertutup dan sekat yang satu dibiarkan terbuka, kemudian diberi lampu diatas bagian yang terbuka untuk menarik udang Artemia salina menuju bagian yang terkena cahaya lampu sehingga terpisah dari cangkangnya. Telur-telur dari Artemia salina akan menetas menjadi larva dalam waktu 48 jam dan digunakan untuk uji toksisitas dari ekstrak metanol, fraksi nheksana, fraksi kloroform dan fraksi metanol daun dan batang lakum. Dibuat larutan induk 2000 ppm dengan melarutkan sebanyak sebanyak 0,5 g ekstrak metanol, fraksi n-heksana, fraksi kloroform dan c. Polifenol Larutan ekstrak ditambahkan 2 tetes pereaksi besi (III) klorida 1%. Senyawa fenol akan menghasilkan warna biru, hijau, merah, ungu atau hitam. d. Flavonoid Larutan ekstrak sebanyak 2 ml ditambah dengan sedikit serbuk magnesium dan 2 ml HCl 2N. Senyawa flavonoid akan menimbulkan warna jingga, kuning sampai merah. 31 JKK, Tahun 2014, Volume 3(3), halaman 30-35 ISSN 2303-1077 fraksi metanol daun dan batang lakum. Dilarutkan dalam 25 mL air laut, ditambah 3 tetes DMSO, kemudian diencerkan menjadi tiga macam konsentrasi yaitu 0, 10, 100, dan 1000 ppm. Hasil partisi ekstrak daun dan batang lakum diperoleh masing-masing tiga fraksi (Tabel 1) yaitu : Tabel 1 Rendemen Fraksi n-heksana, Kloroform dan Metanol Daun dan Batang Lakum Fraksi Massa % Rendemen Kental (gr) n-heksana daun 2,174 10,87% Kloroform daun 3,691 18,46% Metanol daun 5,123 25,62% n-heksana batang 2,026 6,75% Kloroform batang 3,791 12,64% Metanol batang 6,048 20,16% *massa awal fraksi daun : 20 gram *massa wal fraksi batang : 30 gram b. Uji toksisitas Sebanyak 10 ekor udang dimasukkan ke dalam masing-masing botol vial yang telah diisi larutan ekstrak metanol, fraksi n-heksana, fraksi kloroform dan fraksi metanol daun dan batang lakum dengan konsentrasi masing-masing 1000, 100 dan 10 ppm dalam tiga kali ulangan. Botol vial masing-masing berisi 5 mL (air laut, sampel dan 10 ekor udang), satu sebagai kontrol. Setelah 24 jam, diamati jumlah udang yang mati untuk tiap-tiap konsentrasi. Data hasil penelitian akan diolah dan disajikan dalam bentuk tabel dan grafik. Data dari uji toksisitas tersebut akan dianalisis dengan analisis probit menggunakan SPSS versi 20.0 untuk mengetahui harga LC50. Tabel 1 menunjukkan bahwa pada fraksi metanol daun dan batang lakum memiliki nilai rendemen tertinggi dibandingkan fraksi kloroform dan fraksi n-heksana. Hal ini dikarenakan pada saat proses maserasi sampel daun lakum memiliki luas permukaan yang lebih besar dibandingkan batang lakum dan Kandungan air pada daun tersebut lebih sedikit sehingga penyusutan berat pada daun lakum lebih kecil (Sudirman, 2011). HASIL DAN PEMBAHASAN Ekstraksi Ekstraksi daun dan batang lakum dilakukan dengan metode maserasi menggunakan pelarut metanol. Pelarut metanol dapat merusak dinding sel pada sampel sehingga senyawa yang bersifat polar ataupun non polar dapat terlarut dalam metanol. Selama proses terjadi proses difusi (Basset et al., 1994). Hasil maserasi daun dan batang lakum dengan pelarut metanol diperoleh rendemen sekitar 6,05% dan 3,35%. Uji Fitokmia Uji fitokimia dilakukan sebagai uji pendahuluan secara kualitatif untuk mengetahui kandungan kimia. Berikut adalah hasil skrining fitokimia pada berbagai fraksi pada tumbuhan lakum daun dan batang. Tabel 2 Hasil Skrining Fitokimia Daun dan Batang Lakum Sampel Uji Golongan Senyawa Alkaloid Flavonoid Polifenol Ekstrak metanol daun + + + Fraksi n-heksana daun + Fraksi kloroform daun + Fraksi metanol daun + + + Ekstrak metanol batang + + + Fraksi n-heksana batang + Fraksi kloroform batang + + Fraksi metanol batang + + + Ket :+ - Steroid + + + + + + + - = Terjadi perubahan warna = Tidak terjadi perubahan warna Hasil Tabel 2 menunjukkan bahwa hampir semua sampel mengandung golongan senyawa polifenol dan steroid. Golongan senyawa flavonoid hanya ada pada ekstrak dan fraksi metanol. Hal ini karena golongan senyawa flavonoid terdapat pada pelarut yang bersifat polar yaitu pada fraksi ekstrak dan fraksi metanol. Golongan senyawa alkaloid terdapat pada ekstrak metanol, fraksi metanol dan fraksi kloroform batang. Hasil skrining fitokimia ekstrak petroleum eter Cayratia trifolia (Linn) mengandung senyawa golongan flavonoid, steroid, tannin dan terpenoid (Kumar et al., 2012). Menurut Perumal et al., 2011, ekstrak etanol daun batang dan akar lakum 32 JKK, Tahun 2014, Volume 3(3), halaman 30-35 ISSN 2303-1077 mengandung golongan senyawa alkaloid, flavonoid, terpenoid, tannin, dan saponin. kandungan senyawa flavonoid yang berperan sebagai antioksidan (Kumalaningsih, 2010). Penentuan Kandungan Total Fenol Penentuan kandungan total fenol dengan metode Folin-Ciocalteu dilakukan berdasarkan kemampuan reagen Folin-Ciocalteu mengoksidasi gugus hidroksil (OH-) dari senyawa golongan fenol. Senyawa fenolik mereduksi fosfomolibdat fosfotungstat dalam Folin-Ciocalteu membentuk molibdenum yang berwarna biru. Tabel 4 Hasil Uji Aktivitas Antioksidan dengan Metode DPPH Ekstrak/fraksi Nilai IC50 (ppm) Ekstrak metanol daun 165,9 Fraksi n-heksana daun 592,1 Fraksi kloroform daun 129,5 Fraksi metanol daun 125,7 Ekstrak metanol batang 155,9 Fraksi n -heksana batang 506,9 Fraksi kloroform batang 245,0 Fraksi metanol batang 60 Vitamin C 8 Tabel 3 Kandungan Total Fenol Daun dan Batang Lakum Ekstrak/Fraksi Total Fenol (µg/mL) Ekstrak metanol daun 24,0 Fraksi n-heksana daun 10,7 Fraksi Kloroform daun 39,3 Fraksi metanol daun 43,3 Ekstrak metanol batang 30,7 Fraksi n-heksana batang 12,7 Fraksi kloroform batang 20,7 Fraksi metanol batang 57,7 Berdasarkan hasil uji statistik analisis Uji Anova (P<0,05) antara konsentrasi dan % inhibisi memiliki perbedaan signifikan dan berbeda nyata. Aktivitas antioksidan diketahui memiliki hubungan dengan kandungan total fenol. Berdasarkan Tabel 5 ditunjukkan bahwa fraksi metanol batang yang memiliki kandungan total fenol tertinggi yaitu 57,7 µg/mL dan menunjukkan nilai IC50 yang paling rendah yaitu 59,3 μg/mL. Semakin rendah nilai IC50 maka kandungan total fenol semakin tinggi, sehingga aktivitas antioksidan berbanding lurus dengan total fenol, semakin tinggi kandungan fenol dalam suatu bahan semakin tinggi pula aktivitasnya sebagai antioksidan (Huang et al., 2005). Berdasarkan hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa senyawa fenolik lebih banyak terekstrak pada fraksi metanol batang lakum daripada fraksi semi polar dan non polar. Kandungan total fenol tertinggi terdapat pada fraksi metanol batang yaitu sebesar 57,7 µg/mL. Hal ini dapat terjadi karena senyawa golongan fenol bersifat polar atau semi polar (Hayati dkk, 2010). Tabel 5 Hubungan Antioksidan dan Kandungan Total Fenol Ekstrak/Fraksi Total Nilai IC50 Fenol (ppm) (µg/mL) Ekstrak metanol daun 24,0 165,9 Fraksi n-heksana daun 10,7 592,1 Fraksi kloroform daun 39,3 129,5 Fraksi metanol daun 43,3 125,7 Ekstrak metanol batang 30,7 155,9 Fraksi n-heksana batang 12,7 506,9 Fraksi kloroform batang 20,7 245,0 Fraksi metanol batang 57,7 60 Uji Aktivitas Antioksidan dengan Metode DPPH (2,2-difenil-1-pikril-hidrazil) Uji aktivitas antioksidan dengan metode DPPH dilakukan untuk menentukan seberapa besar aktivitas suatu sampel untuk menghambat radikal stabil DPPH dengan cara mendonorkan atom hidrogen. Sampel yang memiliki aktivitas antioksidan akan mereduksi DPPH menjadi DPPH-H (Molyneux, 2004). Reduksi terjadi ditandai dengan perubahan warna ungu menjadi kuning. Nilai IC50 dianggap sebagai ukuran yang baik untuk efisiensi antioksidan senyawa-senyawa murni ataupun ekstrak. Menurut Molyneux (2004) semakin kecil nilai IC50 berarti semakin tinggi aktivitas antioksidan. Hasil menunjukkan bahwa pada sampel fraksi metanol batang memiliki nilai IC50 terkecil dibandingkan sampel lainnya, namun masih memiliki nilai IC50 lebih besar dibandingkan nilai IC50 vitamin C. Fraksi metanol mempunyai nilai IC5O yang lebih kecil dibanding ekstrak lainnya karena adanya Berdasarkan hasil uji statistik Anova antara nilai IC50 dengan kandungan total fenol memiliki perbedaan yang signifikan dengan nilai selang kepercayaan 0,852 artinya pengaruh kandungan total fenol terhadap aktivitas antioksidan 85,2% sedangkan 14,8% dipengaruhi oleh senyawa lainnya. 33 JKK, Tahun 2014, Volume 3(3), halaman 30-35 ISSN 2303-1077 Uji Toksisitas dengan Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) Brine Shrimp Lethaly Test (BSLT) dilakukan untuk menentukan aktivitas toksisitas dari suatu sampel bahan alam. Metode ini merupakan uji awal yang digunakan untuk menentukan aktivitas antikanker berdasarkan kemampuan suatu sampel untuk membunuh larva udang (Artemia salina) (Meyer, 1982). DAFTAR PUSTAKA Basset, J., Denny, R.C., Jeffrey, G.H. dan Mendham, J., 1994, Buku Ajar Vogel Kimia Analitik Kuantitatif Anorganik,A.B : Pudjaatmaka, A.H. dan Setiono, L., Edisi Ke-4, EGC, Jakarta Bhaskar, A.; Nithya, V., and Vidhya, V.G., 2011, Phytochemical Screening and In vitro Antioxidant Activities of the Ethanolic Extract of Hibiscus rosa sinensis L, J. Annals of Biological Research., 2(5): 653661. Gupta, A., Bhardwaj, A., Gupta, J. and Bagchi, A., 2012, Antiimplantation Activity of Petroleum Ether Extract of Leaves of Cayratia trifolia Linn. on Female Albino Rat, J. Asian Pacific of Tropical Biomedicine, 2:S197-S199. Harborne, J.B., 1987, Metode Fitokimia, Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan, AB: K. Padmawinata dan I. Soediro, terbitan ke-2, ITB, Bandung. Hayati E.K., Fasyah A.G., dan Sa’adah L., 2010, Fraksinasi dan Identifikasi Senyawa Tanin pada Daun Belimbing Wuluh (Averrhoa bilimbi L.), J. Kimia, 4(2): 193-200. Huang D., Ou B., Prior RL., 2005, The Chemistry Behind Antioxidant Capacity Assays. J. Agricultural and Food Karthik, P., Amudha, P. and Srikanth, J., 2010, Study on phytochemical profile and antiulcerogenic effect of Cayratia pedatata Lam in albino wistar rats, J. Pharmacologyonline., 2: 1017-1029. Kekuda, T.R.P.; Vinayaka, K.S.; Kumar, S.V.P. and Sudharshan, S.J., 2009, Antioxidant and Antibacterial Activity of Lichen Extracts, Honey, and Their Combination, J. Pharmacy Research., 2(12): 1875-1878 Kumalaningsih S., 2010, Antioksidan Sumber dan Manfaatnya, J. Antioxidant centre 12: 112-123. Kumar, D., Gupta, J., Kumar, S., Arya, R., Kumar, T. and Gupta, A., 2012, Pharmacognostic Evaluation of Cayratia trifolia (Linn.) Leaf, Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine, 2:6-10. McLaughlin, J.L and Roger , L.L., 1998, The Use Of Medical Assays To Evaluate Botanicals, J. Drug Information., 32 : 513524. Meyer, B.N, and Ferrigni, M.L., 1982, Brine Shrimp: A Convenient General Bioassay for Active Plant Constituents, J. Planta Medica., 45: 31-34. Tabel 6 Nilai LC50 pada Sampel Daun dan Batang Lakum Ekstrak/Fraksi Nilai LC50 (ppm) Ekstrak metanol daun 666,6 Fraksi n-heksana daun 1292,2 Fraksi kloroform daun 232,7 Fraksi metanol daun 1177,2 Ekstrak metanol batang 652,3 Ekstrak n-heksana batang 984,3 Fraksi kloroform batang 91,7 Fraksi metanol batang 91,7 Nilai LC50 merupakan konsetrasi dari suatu senyawa kimia yang dapat membunuh 50% organisme uji (Meyer et al.,1982). Hasil menunjukkan bahwa sampel fraksi kloroform dan batang lakum lebih toksik dibandingan pada fraksi lainnya hal ini dapat di lihat dari nilai LC50 yang paling kecil yaitu 91,7 ppm. Hal ini berdasarkan Meyer et al., 1982 ekstrak yang bersifat toksik apabila nilai LC50 < 1000 mg/ml. Ekstrak yang lebih toksik yaitu pada fraksi kloroform dan metanol batang lakum karena batang lakum memiliki tingkat kematian yang lebih besar dibandingkan dengan daun lakum pada berbagai fraksi, selain itu karena pengaruh dari senyawa metabolit sekunder yang terkandung yaitu polifenol, alkaloid, flavonoid dan steroid yang dapat membunuh larva udang (Mutia, 2010). SIMPULAN Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan, maka dapat disimpulkan bahwa Kandungan total fenol tertinggi yaitu pada fraksi metanol batang. Aktivitas antioksidan paling besar yaitu pada fraksi metanol batang. Nilai LC50 yang paling bersifat toksik yaitu pada fraksi metanol batang dan fraksi kloroform batang. Berdasarkan penapisan fitokimia, senyawa yang berperan terhadap aktivitas antioksidan diperkirakan dari golongan flavonoid dan senyawa yang berperan terhadap aktivitas sitotoksik adalah dari golongan alkaloid dan steroid. Semakin besar kandungan total fenol, maka semakin besar pula aktivitas antioksidannya. 34 JKK, Tahun 2014, Volume 3(3), halaman 30-35 ISSN 2303-1077 Molyneux, P., 2004, The Use of the Stable Free Radikal diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) for Estimating Antioxidant Activity, J. Science of Technology., 26(2):211-219. Mutia, D., 2010, Uji Toksisitas Akut Ekstrak Etanol Buah Anggur (Vitis vinifera) terhadap Larva Artemia salina Leach dengan Metode Brine Shrimp Lethality Test (BST), Universitas Diponegoro, Fakultas Kedokteran, Semarang, (Skripsi). Patil, S. And Honrao, B. K., 2000, Phytochemical Studies in the Genus Cayratia Juss. (Vitaceae) and Their Significance. Journal of Economic and Taxonomic Botany., 24 : 688-694. Gopalakrishnan, V.K., 2012, In Vitro Antioxidant Activities and HPTLC Analysis of Ethanolic Extract of Cayratia trifolia (L.), Asian Pacific Journal of tropical disease., S952-S956. Sudirman, S., 2011, Aktivitas Antioksidan dan Komponen Bioaktif Kangkung Air (Ipomoea aquatica Forsk.), Institut Pertanian Bogor, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Bogor, (Skripsi). Widhiana, E.T., Fitriana, N., Neliyanti. Dan Anugrah, E.T., 2012, Skrining Fitokimia dan Uji Aktivitas Antioksidan Buah Lakum (Vitis diffusa) Khas Kalimantan Barat pada Berbagai Fraksi, MIPA Universitas Tanjungpura, Pontianak, Laporan Penelitian PKMP. Perumal, P.C., Sophia, D., Raj, C.A., Ragavendran, P., Starlin, T., and 35