PENENTUAN AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN

PENENTUAN AKTIVITAS ANTIOKSIDAN
DAN KADAR FENOL TOTAL PADA
EKSTRAK KULIT BUAH PISANG
(Musa acuminata Colla)
Rosida, Diyan Ajeng RA
Akademi Farmasi Jember
Email: [email protected]
Abstrak
Antioksidan merupakan senyawa yang mampu menghambat oksidasi molekul
lain. Tubuh tidak mempunyai sistem pertahanan antioksidatif yang berlebihan, sehingga
tubuh membutuhkan antioksidan eksogen. Kekhawatiran terhadap efek samping
antioksidan sintetik menjadikan antioksidan alami menjadi alternatif yang dipilih.
Flavonoid merupakan senyawa fenolat (hidroksil fenolik) yang mampu bertindak
sebagai antioksidan dan umumnya terdapat pada tanaman. Salah satu limbah tanaman
yang mempunyai kandungan flavonoid adalah kulit buah pisang (Musa acuminata).
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menetapkan kadar flavonoid total dan
melakukan pengujian aktivitas antioksidan kulit buah pisang menggunakan diphenyl
picryl hydrazil hydrate (DPPH) sebagai radikal bebas. Metode ekstraksi yang digunakan
adalah remaserasi dengan pelarut etanol 96%. Penetapan kadar flavonoid total
menggunakan katekin sebagai standar dan pengujian DPPH menggunakan metode
spetrofotometri. Hasil penelitian menunjukkan kandungan flavonoid total ekstrak etanol
kulit buah pisang sebesar 0,79 ± 0,03 %b/b, aktivitas antioksidan tertinggi dalam
IC50terhadap DPPH sebesar 70,41 mg/L.
Kata Kunci: kulit buah pisang, flavonoid total, aktivitas antioksidan, IC50
I. PENDAHULUAN
Kesehatan merupakan masalah yang cukup serius. Banyak penyakit yang disebabkan
oleh radikal bebas, radikal bebas dapat mengoksidasi asam nukleat, protein, lipid
sehingga menginisiasi terjadinya degeneratif dan kerusakan sel. Faktor lingkungan
seperti polusi, intensitas uv yang berlebih, suhu, bahan kimia dan kekurangan gizi dapat
mengakibatkan tubuh terpapar radikal bebas. Bila radikal bebas berlebihan akan
menciptakan ketidakseimbangan antara molekul radikal bebas dan antioksidan endogen.
Ketika jumlah radikal bebas melebihi kapasitas tubuh untuk menetralisirnya, maka
terbentuk stress oksidatif yang menyebabkan kerusakan struktur sel, jaringan dan organ
(Leong & Shui, 2001).
Prosiding Seminar Nasional Current Challenges in Drug Use and Development
Tantangan Terkini Perkembangan Obat dan Aplikasi Klinis
26
Untuk meredam aktivitas radikal bebas diperlukan antioksidan. Antioksidan adalah
molekul yang dapat mendonorkan elektronnya kepada molekul radikal bebas, sehingga
menghentikan reaksi radikal bebas.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa beberapa ekstrak tanaman memiliki senyawa
antioksidan seperti fenolik, flavonoid yang lebih efektif dan lebih aman daripada
antioksidan sintetis, seperti butylated hydroxytoluene. Antioksidan asam fenolat,
polifenol, flavonoid menghambat radikal peroksida, hidroperoksida atau lipid peroxyl,
menghambat mekanisme oksidatif, sehingga mencegah penyakit degeneratif, selain itu
berguna sebagai anti tumor dan mempunyai efek pencegahan pada kerusakan hati.
Flavonoid memiliki kemampuan anti-inflamasi dan antioksidan yang terbukti mampu
menghambat proses stress oksidatif pada penyakit kardiovaskular dan neurodegeneratif.
Salah satu buah yang mempunyai kandungan flavonoid adalah pisang (Musa
acuminata). Buahnya banyak disukai untuk di konsumsi secara langsung sebagai buah
atau diolah menjadi produk konsumsi. Namun hal ini tidak diimbangi dengan
pengolahan limbah dari kulit buah pisang yang sangat banyak jumlahnya. Limbah kulit
buah pisang mewakili sekitar 30% dari buah. Hal ini merupakan masalah lingkungan
karena mengandung sejumlah besar nitrogen, fosfor dan kadar air yang tinggi sehingga
rentan terhadap perkembangan mikroorganisme (Gonzales et al., 2009).
Total jumlah senyawa fenol pada kulit pisang (Musa acuminat Colla) sekitar 0,90
sampai 3,0 g/100g DW (Nguyen et al., 2003; Someya et al., 2002). Kulit pisang matang
juga mengandung senyawa seperti anthosianin delphinidin, cyaniding, dan catekolamin
(Kanazawa & Sakakibara, 2000). Berdasarkan penelitian kami sebelumnya bahwa
pemberian ekstrak kulit buah pisang secara topikal mampu mempercepat perbaikan
kondisi pasca luka bakar. Hal ini ditandai dengan penurunan konsentrasi lipid
peroksidase, peningkatan ekspresi VEGF dan kolagen.
Berdasarkam potensi yang dimiliki kulit buah pisang sebagai antioksidan alami dan
mengandung banyak komponen yang senyawa bioaktif (flavonoid, fenol), maka perlu
dipelajari lebih lanjut kandungan flavonoid total dan pengukuran aktivitas antioksidan
menggunakan DPPH secara spektrofotometri.
Prosiding Seminar Nasional Current Challenges in Drug Use and Development
Tantangan Terkini Perkembangan Obat dan Aplikasi Klinis
27
II. METODE PENELITIAN
A. Bahan dan Alat
Bahan penelitian adalah kulit buah pisang (Musa acuminata Colla) yang diperoleh
dari daerah Genteng, Banyuwangi dan dideterminasi di Balai Konservasi Tumbuhan
Kebun Raya Purwodadi; Katekin ex. Sigma; etanol teknis; plat silica gel 60 F254 ex. E.
Merck;Difenilpikril Hidrazil Hidrat (DPPH) ex. Sigma; Pelarut untuk Spektrofotometer
ex. E.Merck; Freeze dryer Heidolp; rotavapor Heidolph; Spektrofotometer Hitachi
U1800.
B. Rancangan Penelitian
Penelitian ini adalah penelitian eksperimental laboratories in vitro yang bertujuan
untuk mnetapkan kadar katekin dan menguji aktivitas antiradical bebas DPPH sebagai
kapasitas antioksidan ekstrak etanol kulit buah pisang dari daerah Genteng-Banyuwangi.
Sebagai variable tergantung adalah kadar katekin dan perendaman radikal bebas DPPH;
variable bebas adalah ekstrak etanol dalam berbagai konsentrasi.
C. Prosedur Kerja
Pembuatan Serbuk Kulit Buah
Ditimbang 1 kg kulit buah pisang matang dan dikeringkan dengan teknik freeze
drying. Bahan yang telah dikeringkan kemudian ditimbang dan disimpan dalam lemari
es.
Pembuatan Ekstrak dan Larutan Uji
Ditimbang 250 gram serbuk kulit buah pisang, kemudian diektraksi dengan etanol
dengan cara remaserasi. Perendaman dilakukan selama 3 x 24 jam ekstraksi dilakukan
2-3 kali. Filtrat yang diperoleh dipekatkan dengan rotavapor sehingga dihasilkan
ekstrak kental.
Uji Kualitatif Flavonoid
Uji kualitatif flavonoid pada ekstrak kulit buah pisang menggunakan pembanding
katekin yang ditotolkan secara berurutan. Penotolan sebanyak 10 μl pada plat silica gel
60 F254 (E. Merck). Penampak noda menggunakan larutan FeCl3 10%.
Penentuan Kadar Flavonoid Total
Total flavonoid menggunakan standar katekin dengan metode Sultana et al. (2008)
dengan beberapa modifikasi yaitu 1 ml larutan ekstrak air yang mengandung 0,01 g/ml
Prosiding Seminar Nasional Current Challenges in Drug Use and Development
Tantangan Terkini Perkembangan Obat dan Aplikasi Klinis
28
bahan kering ditempatkan dalam labu ukur 10 ml. Kemudian ditambahkan 5 ml air.
Tambahkan 0,3 ml NaNO2 (5% b/v). Setelah 5 menit tambahkan 0,6 ml AlCl3 (10%
b/v). Setelah 5 menit tambahkan 2 ml larutan NaOH 1 M. Terakhir tambahkan air
sampai 10 ml (garis tanda pada labu) Campuran dikocok dengan kuat, ukur absorbansi
warna pink pada 510 nm. Kurva baku dibuat menggunakan larutan standard katekin 10
– 100 mg/L. Semua sampel dianalisis dalam tiga replikasi dan hasil di rata-rata. Kadar
flavonoid secara kuantitatif diukur dengan menggunakan kurva standar katekin.
Uji Aktivitas Antioksidan
Ekstrak kental kulit buah pisang hasil evaporasi dilarutkan dengan etanol menjadi
konsentrasi 160 mg/L, kemudian diencerkan menjadi empat variasi konsentrasi yaitu 80
; 90,4 ; 104,3 dan 125,22 mg/L, tujuannya untuk menentukan aktivitas antioksidan
dengan membuat kurva IC50. Masing-masing ekstrak sebanyak 1,8 mL direaksikan
dengan DPPH 0,04 % sebanyak 0,5 mL. Kemudian diinkubasi selama 30 menit,
kemudian diukur absorbansi sampel dengan spektrofotometer pada panjang gelombang
516,5 nm. Penentuan IC50 dibuat dari persamaan regresi antara persentase aktivitas
radikal bebas DPPH pada ekstrak terhadap 5 konsentrasi tadi. Aktivitas antioksidan
dapat dihitung dengan rumus berikut ini:
Berikut ini tabel mengenai klasifikasi aktivitas antioksidan menurut Blois.
Tabel1. Klasifikasi aktivitas antioksidan (Blois, 1958)
Nilai IC50
Antioksidan
<50ppm
Sangat kuat
50-100 ppm
Kuat
100-150 ppm
Sedang
151-200 ppm
Lemah
III. HASIL DAN PEMBAHASAN
Uji kualitatif flavonoid pada ekstrak kulit buah pisang menggunakan pembanding
katekin yang ditotolkan secara berurutan. Penotolan sebanyak 10 μl pada plat silica gel
60 F254 (E. Merck). Hasil positif mengandung katekin ditandai dengan penampakan
Prosiding Seminar Nasional Current Challenges in Drug Use and Development
Tantangan Terkini Perkembangan Obat dan Aplikasi Klinis
29
noda yang sama dengan standar katekin dan memiliki nilai Rf (waktu retensi) yang
sama. Hasil elusi dan adanya noda tampak dengan penampak noda larutan FeCl 3,
didapatkan Rf sebesar 0,8 (Tabel 2).
Tabel 2. Profil KLT ekstrak kulit buah pisang
Eluen
Kloroform :
Metanol : Air
(6,5 : 3,5 : 1)
Penampak Noda
Harga Rf
Ekstrak kulit buah
Standar Katekin
pisang
Larutan FeCl3
10%
0,8
0,8
Pada penelitian ini untuk mengetahui kadar flavonoid total mengunakan standarisasi
katekin yang terkandung pada ekstrak kulit buah pisang. Menurut Schmid et al (2010),
ekstrak etanol kulit Parapiptadenia rigida yang mengandung katekin dengan
konsentrasi 1 dan 10μM menunjukkan peningkatan proliferasi fibroblast sedangkan
katekin dengan konsentrasi 20 μM menunjukkan anti proliferasi.
Analisis kadar katekin dilakukan dengan menggunakan metode spektrofotometer
panjang gelombang maksimum spektra katekin adalah 510 nm. Hasil pengamatan dan
perhitungan standar Katekin diperoleh kurva baku dengan persamaan y = 0,011x +
0,007 ; dengan r = 0,9975 (Gabmar 1). Dari persamaan ini didapat kadar Katekin pada
ekstrak kulit buah pisang sebesar 0,79 ± 0,03 %b/b.
Uji aktivitas antioksidan secara kuantitatif menggunakan metode DPPH dipilih
karena ujinya sederhana, mudah, cepat dan peka serta hanya memerlukan sedikit sampel
(Hanani et al, 2005). Pengujian radikal bebas DPPH diawali dengan penentuan panjang
gelombang maksimum. Pembuatan spectra sinar tampak lautan DPPH pada rentang
400-600 nm. Hasil penelitian menunjukkan kurva normal (sigmoid) pada daerah puncak
516,5 nm. Adanya aktivitas antioksidan dari sampel mengakibatkan terjadinya
perubahan warna pada larutan DPPH dalam metanol yang semula berwarna ungu pekat
menjadi kuning pucat (Permana et al., 2003).
Selanjutnya dilakukan pengukuran waktu inkubasi ekstrak dengan larutan DPPH.
Waktu inkubasi mengunakan 0, 10, 20 dan 30 menit. Hasil absorbansi menunjukkan
bahwa absorbansi stabil mulai menit 10 sampai menit ke 30. Pada penelitian ini
menggunakan waktu inkubasi 30 menit.
Prosiding Seminar Nasional Current Challenges in Drug Use and Development
Tantangan Terkini Perkembangan Obat dan Aplikasi Klinis
30
1
y = 0.011x + 0.007
R=0.998
0,9
0,8
Absorbansi
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
20
40
60
80
100
Konsentrasi (mg/L)
Gambar 1. Kurva standar katekin dalam berbagai konsentrasi 20, 30, 40, 50, 60, 70,
80 mg/L terhadap absorbansi.
Aktivitas antioksidan dari ekstrak dinyatakan dalam persen penghambatannya
terhadap radikal DPPH.Persentase penghambatan ini didapatkan dari perbedaan serapan
antara absorban DPPH dalam metanol dengan absorban sampel yang diukur dengan
spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 516,5 nm. Selanjutnya persamaan
regresi yang diperoleh dari grafik hubungan antara konsentrasi ekstrak kulit buah pisang
dayak dengan persen penghambatan DPPH digunakan untuk mencari nilaiIC50.
Besarnya aktivitas antioksidan ditandai dengan nilai IC50, yaitu konsentrasi larutan
sampel yang dibutuhkan untuk menghambat 50% radikal bebas DPPH (Andayani et al.,
2008).
Uji aktivitas antioksidan atau hambatan terhadap radikal bebas menggunakan metode
DPPH menunjukkan bahwa ekstrak kulit buah pisang memiliki aktivitas antioksidan.
Hasil pengujian dapat dilihat pada Gambar 2.
Berdasarkan persamaan regresi linier tersebut dapat ditentukan nilai IC50ekstrak kulit
buah pisang sebesar 70,41 mg/L. Berdasarkan klasifikasi aktivitas antioksidan
menunjukkan bahwa nilai IC50ekstrak kulit buah pisang memiliki antioksidan yang kuat
yaitu rentang 50 – 100 mg/L (Blois, 1958).
Aktivitas penghambatan radikal bebas DPPH ekstrak kulit buah pisang ditentukan
oleh berbagai senyawa antioksidan yang terdapat pada tumbuhan tersebut. Beberapa
Prosiding Seminar Nasional Current Challenges in Drug Use and Development
Tantangan Terkini Perkembangan Obat dan Aplikasi Klinis
31
penelitian menunjukkan bahwa kulit pisang kaya senyawa fitokimia. Senyawa fenolat
yang telah diketahui memiliki efek antioksidan yang sangat kuat. Total jumlah senyawa
fenol pada kulit pisang (Musa acuminata Colla) sekitar 0,90 sampai 3,0 g/100g DW
(Nguyen, Ketsa & van Doorn, 2003 ; Someya, Yosiki & Okubo, 2002). Kulit pisang
matang juga mengandung senyawa seperti anthosianin delphinidin, cyaniding, dan
catekolamin (Kanazawa & Sakakibara, 2000). Selain itu telah diidentifikasi pada kulit
pisang caratenoids seperti β-carotene, α-carotene dan xantophil (Subagio, Morita &
Sawada, 1996), sterol dan triterpens seperti β-sitosterol, stigmasterol, campesterol,
cycloeucalenol, cycloartenol dan 24 metylene cycloartenol (Knapp & Nicholas, 1969).
Persen Penghambatan (%)
80
y = 0,6046x - 7,4745
R² = 0,929
70
60
50
40
30
20
10
0
0
20
40
60
80
100
120
140
Konsentrasi (mg/L)
Gambar 2. Hubungan konsentrasi ekstrak kulit buah pisang dengan persen
penghambatan
IV.
KESIMPULAN
Dari hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa ekstrak etanol kulit buah pisang (Musa
acuminata Colla) mengandung flavonoid total 0,79 ± 0,03 %b/b dan memiliki aktivitas
antioksidan yang kuat dengan nilai IC50 sebesar 70,41 mg/L.
DAFTAR PUSTAKA
Andayani, R., Y., Lisawati, & Maimunah. 2008. Penentuan Aktivitas Antioksidan,
Kadar Fenol Total dan Likopen pada Buah Tomat (Solanum lycupersicum L).
Jurnal Sains dan Teknologi Farmasi, Vol 13 (1).
Prosiding Seminar Nasional Current Challenges in Drug Use and Development
Tantangan Terkini Perkembangan Obat dan Aplikasi Klinis
32
Blois, M. S. 1958. Antioxidant Determinations By the Use of a Stable Free
Radical.Nature. Vol 181: 1999-1200.
Gonzales R. M., Lobo, G. M., & Gonzales, M. 2010. Antioxidant Activity in Banana
Peel Extraction: Testing Extraction Conditions and Related Bioactive
Compounds. Food Chem, 199: 1030-1039.
Hanani, E. A., Mun’im, R.., & Sekarini. 2005. Identifikasi Senyawa Antioksidan dalam
Spons Calispongia sp dari Kepulauan Seribu. Majalah Ilmu Kefarmasian. Vol 2
(3): 127-133.
Kanazawa, K., & Sakakibara, H. 2000. High Content of Dopamine, A Strong
Antioxidant, in Cavendish Banana. J Agric and Food Chem. Vol 48 (3), 844–
848.
Knapp, F. F., & Nicholas, H. J. 1969. Sterols and Triterpenes of Banana Peel.
Phytochem. Vol 8 (1): 207–214.
Leong, L. P. & Shui, G. 2002. An Investigation of Antioxidant Capacity of Fruits in
Singapore Markets. Food Chemistry.76: 69-75.
Nguyen, T. B. T., Ketsa, S., & Van Doorn, W. G. 2003. Relationship Between
Browning and The Activities of Polyphenol Oxidase and Phenylalanine
Ammonia Lyase in Banana Peel During Low Temperature Storage. Postharvest
Biol and Tech. Vol 24 (3): 187-193.
Permana, D. N. H.. Lajis, F., Abas, A. G., Othman, R., Ahmad, M., Kitajama, H.,
Takayama, N., & Aimi. 2003. Antioksidative Constituents of Hedotis Diffusa
Wild. Natural Product Sciences. Vol 9 (1): 7-9.
Schmidt, C. A., Murillo, R., Bruhn, T., Bringmann, G., Goettert, M., Heinzmann, B.,
Brecht, V., Laufer S. A., & Merfort, I. 2010. Catechin Derivatives from
Parapiptadenia Rigida with in Vitro Woundhealing Properties. J Nat Prod.
Vol73 (12), 2035–2040.
Someya, S., Yoshiki, Y., & Okubo, K. 2002. Antioxidant Coumpounds from Bananas
(Musa cavendish). Food Chem. Vol 79 (3): 351-354.
Subagio, A., Morita, N., & Sawada, S. 1996. Carotenoids and Their Fatty-Acid Esters in
Banana Peel. J Nutr Sci and Vitam. Vol 42 (6): 553–566.
Sultana, B., Anwar, F., Asi, M. R., Chatha, S. A. S. 2008. Antioxidant Potential of
Extracts from Different Agro Wastes: Stabilization of Corn Oil. Grasas y
Aceites. Vol 59 (3): 205-217.
Prosiding Seminar Nasional Current Challenges in Drug Use and Development
Tantangan Terkini Perkembangan Obat dan Aplikasi Klinis
33