BAB 4 METODE PENELITIAN 4.1 Rancangan penelitian Penelitian

ADLN – PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
BAB 4
METODE PENELITIAN
4.1
Rancangan penelitian
Penelitian ini merupakan penelitian menggunakan desain eksperimental
(True experiment-post test only control group design). Dalam penelitian yang
pertama dilakukan uji daya hambat ekstrak siwak terhadap E. faecalis dalam
kondisi planktonik dengan menggunakan metode dilusi untuk mendapatkan kadar
hambat minimum bakteri. Kemudian dilakukan uji antibiofilm menggunakan
konsentrasi ekstrak yang sama sehingga diperoleh kadar hambat minimum biofilm
bakteri.
4.2
Unit analisis penelitian
4.2.1 Unit analisis uji daya hambat bakteri
Unit analisis uji daya hambat bakteri adalah ekstrak siwak 25%, 30%,
35%, 40%, 45%, 50%,55%, 60%, 65%, 70%, 75%, dan 100% yang diberikan
terhadap pertumbuhan bakteri E. faecalis, dan jumlah koloni bakteri E. faecalis
yang ditanam pada media Trypticase Soy Agar
Sampel penelitian adalah kultur bakteri E. faecalis yang diperoleh dari
Laboratorium RSPTI Surabaya. Dari sediaan kultur tersebut inokulum masingmasing bakteri diinkubasi pada Trypticase Soy Broth pada suhu 37◦C selama 18
jam serta diencerkan dengan 0,85% larutan NaCl steril sehingga mencapai
suspensi kekeruhan yang setara dengan Standard Mc.Farland 0,5. Kultur setiap
bakteri ditanam pada sediaan Trypticase Soy Agar padat serta diinkubasi selama
TESIS
40
EFEKTIVITA EKSTRA SIWAK …
IKA RHISTY CENDANA SARI
ADLN – PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
41
24 jam pada suhu 37°C. (Poelongan dan Praptiwi, 2010., Oli et al., 2012;
Masadeh et al., 2013).
4.2.2 Unit analisis uji daya hambat pertumbuhan biofilm bakteri
Ekstrak siwak 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%,55%, 60%, 65%, 70%,
75%, dan 100%, yang diberikan terhadap tiap pertumbuhan biofilm bakteri E.
faecalis, dan nilai Optical Density biofilm bakteri E. faecalis yang terbaca pada
ELISA Reader dengan panjang gelombang 595 nm.
Sampel penelitian adalah kultur biofilm bakteri E. faecalis diisolasi dari
kultur bakteri E. faecalis yang diperoleh dari Laboratorium RSPTI Surabaya.
Dari sediaan kultur tersebut, 100µL suspensi dibiakkan dalam polyprophylene
tube yang mengandung 2 mL Trypticase Soy Broth (TSB) dengan penambahan
glukosa 1% selama 48 jam pada suhu 37◦C. Setelah 48 jam inkubasi, sel biofilm
dipanen melalui pembuangan media kultur dan membilas tube sebanyak tiga kali
dengan 200µL Phosphat Buffer Saline (PBS, pH 7,2) untuk menghilangkan
bagian bakteri yang non adesif. Sel yang adesif dipanen melalui proses vortex dan
sentrifugasi. Pellet tersuspensi dalam PBS untuk kemudian dikondisikan pada 0,5
Standar turbiditas (kekeruhan) McFarland. (Oli et al., 2012; Masadeh et al., 2013;
Geethashri et al., 2014)
4.3
Besar sampel penelitian
Besar sampel penelitian uji daya hambat bakteri maupun daya hambat
pertumbuhan biofilm bakteri menggunakan rumus yang sama. Jumlah sampel
TESIS
EFEKTIVITA EKSTRA SIWAK …
IKA RHISTY CENDANA SARI
ADLN – PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
42
yang ditentukan dalam masing-masing penelitian ini menggunakan rumus Federer
(Federer, 1991; Islam, 2007) :
{(p-1) (n-1)}≥ 15
Keterangan: n : jumlah replikasi
p : jumlah kelompok perlakuan
Uji anti bakteri
: p = 14
=13n-13 ≥ 15, maka n ≥ 3
Uji anti biofilm bakteri
: p = 16
=15n-15 ≥ 15, maka n ≥ 2
Berdasar perhitungan rumus tersebut maka dilakukan pengulangan sebanyak
3 kali sehingga didapatkan 4 sampel pada masing-masing perlakuan.
4.4
Variabel penelitian
4.4.1
Variabel bebas penelitian uji daya hambat bakteri dan biofilm
bakteri
Variabel bebas dalam penelitian uji daya hambat bakteri dan biofilm
bakteri adalah ekstrak siwak 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%,55%, 60%, 65%,
70%, 75%, dan 100%.
4.4.2 Variabel terikat penelitian uji daya hambat bakteri
Variabel terikat dalam penelitian daya hambat ekstrak siwak terhadap
pertumbuhan bakteri adalah pertumbuhan bakteri E. faecalis yang terlihat pada
medium Trypcase Soy Medium setelah dilakukan inkubasi selama 24 jam dalam
TESIS
EFEKTIVITA EKSTRA SIWAK …
IKA RHISTY CENDANA SARI
ADLN – PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
43
suhu 37°C. Ditandai dengan jumlah koloni bakteri pada media penanaman yang
dapat dihitung dengan colony counter.
4.4.3 Variabel terikat penelitian uji daya hambat pertumbuhan biofilm
bakteri
Variabel terikat dalam penelitian uji daya hambat pertumbuhan biofilm bakteri
adalah Nilai Optical Density (OD) biofilm bakteri E. faecalis dalam medium TSB
yang terbaca dalam ELISA Reader panjang gelombang 595 nm.
4.4.4 Variabel terkendali penelitian uji daya hambat bakteri
Variabel kendali penelitian uji daya hambat bakteri adalah kultur bakteri
E. faecalis, media penanaman kultur dalam penelitian, proses pembuatan ekstrak
siwak, lingkungan, metode pemeriksaan, dan cara pemeliharaan.
4.4.5 Variabel terkendali penelitian uji daya hambat pertumbuhan biofilm
bakteri
Variabel kendali penelitian uji daya hambat pertumbuhan biofilm bakteri
adalah kultur bakteri E. faecalis yang diambil untuk mendapatkan biofilm, media
penanaman kultur biofilm, proses pembuatan ekstrak siwak, waktu penelitian,
lingkungan, metode pemeriksaan, cara pemeliharaan, dan teknik screening
biofilm.
TESIS
EFEKTIVITA EKSTRA SIWAK …
IKA RHISTY CENDANA SARI
ADLN – PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
4.5
44
Definisi operasional
1. Konsentrasi ekstrak siwak adalah hasil ekstraksi dari bubuk siwak dengan
metode sokhletasi yang dibuat di Laboratorium Farmakologi Akademi
Farmasi Putra Indonesia Malang dan diencerkan dengan metode dilusi
dengan perbandingan bubuk siwak dalam gram dan pelarut dalam milliliter
sehingga didapat didapatkan ekstrak siwak 100% (1 gr/ ml), 75% (0,75
gr/ml), 70% (0,7 gr/ml), 65%(0,65 gr/ml), 60% (0,6 gr/ml), 55% (0,55 gr/
ml), 50% (0,5 gr/ml), 25% (0,25 gr/ml). Ekstrak siwak adalah dan
diencerkan dengan metode dilusi sehingga didapatkan ekstrak siwak
dengan konsentrasi 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%,55%, 60%, 65%,
70%, 75%, dan 100%.
2. Minimum Inhibitory Concentration (MIC) adalah konsentrasi ekstrak
batang siwak terendah yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri E.
faecalis.
3. Minimum Biofilm Inhibitory Concentration (MBIC) adalah konsentrasi
ekstrak siwak terendah yang mampu menghambat pertumbuhan biofilm E.
faecalis setelah terbentuk.
4. Kultur pertumbuhan bakteri E. faecalis adalah gambaran kekeruhan dari
pertumbuhan bakteri E. faecalis pada media cair Trypticase Soy Broth
setelah dilakukan inkubasi selama 24 jam dalam suhu 37°C dan dibuktikan
dengan penanaman kembali pada medium Trypticase Soy padat dimana
jumlah koloni dapat dihitung dengan colony counter .
5. Kultur biofilm bakteri E. faecalis adalah gambaran pertumbuhan biofilm
yang didapatkan dari sel yang tetap melekat dalam well setelah dilakukan
TESIS
EFEKTIVITA EKSTRA SIWAK …
IKA RHISTY CENDANA SARI
ADLN – PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
45
pencucian dalam metode microtiter biofilm assay, dari kultur bakteri E.
faecalis yang telah diisolasi. Sel yang adesif tersebut dipanen melalui
proses vortex dan sentrifugasi.
6. Pertumbuhan biofilm E. faecalis adalah jumlah sel hidup agregat
monospesies E. faecalis yang membentuk lapisan padat pada permukaan
suatu substrat atau media dan diselimuti oleh pelekat karbohidrat yang
dikeluarkan bakteri tersebut dan ditentukan berdasarkan koloni biofilm
yang dapat dihitung dengan metode optical density (OD).
7.
ELISA reader adalah alat yang digunakan untuk menghitung optical
density (OD) atau ukuran intensitas kekeruhan pertumbuhan biofilm yang
terbentuk dan diletakkan pada microplate. ELISA reader yang digunakan
adalah merk Biorad dengan panjang gelombang 595 nm
4.6
Waktu dan tempat penelitian
1. Penelitian dilakukan di Laboratorium RSPTI (Rumah Sakit Penyakit
Tropis dan Infeksi) Surabaya bulan Juni 2014 - Oktober 2015.
2. Pembuatan ekstrak siwak dilakukan di Laboratorium Farmakologi
Akademi Putera Farmasi Indonesia Malang bulan Juni 2014 – Oktober
2015.
4.7
Alat dan bahan penelitian
4.7.1 Alat dan bahan uji daya hambat bakteri
Alat :
1. tabung reaksi dan rak
TESIS
EFEKTIVITA EKSTRA SIWAK …
IKA RHISTY CENDANA SARI
ADLN – PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
46
2. kawat oese
3. kompor listrik
4. pengaduk
5. mikropipet
6. kertas saring
7. gelas ukur
8. alat timbangan
9. cawan petri
10. inkubator
Bahan :
1. Stok Bakteri E. faecalis
2. Ekstrak etanol siwak
3. Media cair Trypticase Soy Broth
4. Media padat Trypticase Soy Agar
5. Akuades steril.
4.7.2 Alat dan bahan uji daya hambat pertumbuhan biofilm bakteri
Alat :
1. tabung reaksi dan rak.
2.
kawat oese
3. kompor listrik
4. pengaduk
5. mikropipet
6. kertas saring
TESIS
EFEKTIVITA EKSTRA SIWAK …
IKA RHISTY CENDANA SARI
ADLN – PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
47
7. gelas ukur
8. alat vortex dan sentrifugasi
9. cawan petri
10. Anaerobic jar
11. Microplate
11. ELISA reader
12. inkubator
Bahan :
1. Stok Kultur Bakteri E.faecalis
2. Trypcase Soy Broth Medium
3. 20% gliserol
4. Phosphat Buffer Saline (PBS)
5. Polyprophylene tube
6. Crystal Violet 0,1 %
7. Media cair Trypticase Soy Broth
8. Media padat Trypticase Soy Agar
9. Acidified isopropanol
10. Akuades steril
4.8
Prosedur penelitian
4.8.1 Tahap persiapan
a. Sterilisasi alat
TESIS
EFEKTIVITA EKSTRA SIWAK …
IKA RHISTY CENDANA SARI
ADLN – PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
48
Sebelum penelitian dilaksanakan, semua alat dan media yang akan
digunakan disterilisasi dengan memasukkannya ke dalam autoklaf pada suhu
121°C dengan tekanan sebesar 1atm selama 15 menit, lalu didinginkan. (Rahardjo
dkk, 2006; Todar, 2012)
b. Pembuatan ekstrak etanol siwak
Digunakan etanol 96%, kemudian dibuat ekstrak siwak yang diperoleh
dari Laboratorium Farmasi Akademi Farmasi Putera Indonesia Malang. Bahanbahan tersebut diolah untuk mendapatkan ektrak siwak dengan konsentrasi dosis
ekstrak yang efektif dalam menghambat pertumbuhan E. faecalis.
Ekstrak siwak
yang digunakan adalah menggunakan batang kunyah
(chewing stick) yang diambil dari pohon siwak (Salvadora persica) yang segar.
Batang siwak dipotong-potong hingga menjadi potongan kecil dan dikeringkan
pada suhu kamar selama 2 minggu. Bahan tersebut dihaluskan dengan
menggunakan blender untuk mendapatkan bubuk batang siwak.
Larutan ekstrak siwak yang digunakan adalah larutan yang dibuat dari 400
gr bubuk batang siwak yang diekstraksi dengan metode sokhletasi. Digunakan
pelarut etanol 96%. sebanyak 1,5 kali volume ekstraktor menggunakan alat
sokhlet pada suhu 60-80◦C sampai warna pelarut pada sokhlet menjadi bening dan
diletakkan pada rotary evaporator
pada suhu 60◦C. Pelarut diuapkan pada
elektromanthel hingga diperoleh ekstrak kental, kemudian diencerkan sehingga
didapat konsentrasi ekstrak 100%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%,
35%. 30%, 25%. (Harborne, 2006; Chivatxaranukul et al., 2008; Kusumasari,
2012)
TESIS
EFEKTIVITA EKSTRA SIWAK …
IKA RHISTY CENDANA SARI
ADLN – PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
49
Sokhletasi adalah suatu metode atau proses pemisahan suatu komponen
yang terdapat dalam zat padat dengan cara penyaringan berulang-ulang dengan
menggunakan pelarut tertentu sehingga semua komponen yang diinginkan akan
terisolasi. Metode ini digunakan sehingga komponen aktif yang didapatkan dari
ekstrak akan optimum dan pengaruh pelarut terhadap efektifitas ekstrak relatif
kecil. Pelarut yang digunakan dalam penelitian ini adalah etanol 96% sehingga
memadai untuk dilakukan pembuatan ekstrak dengan metode sokhletasi karena
metode ini harus menggunakan jenis pelarut yang mudah menguap. Dengan
metode ini, pelarut organik dapat menarik senyawa organik dari bahan ekstrak,
waktu yang digunakan lebih efisien, dan jumlah pelarut yang digunakan lebih
sedikit dibandingkan dengan menggunakan metode maserasi maupun perkolasi.
Metode ini juga baik digunakan dalam kondisi pemisahan minyak atsiri dengan
metode distilasi uap tidak dapat digunakan dengan baik karena presentasi senyawa
yang digunakan atau diisolasi memiliki jumlah yang kecil atau tidak mencukupi.
(Sandoe et al., 2006)
c. Persiapan kultur E. faecalis
Sediaan kultur E. faecalis dipersiapkan. Dari sediaan tersebut inokulum
bakteri diinkubasi pada Trypticase Soy Broth pada suhu 37◦C selama 18 jam serta
diencerkan dengan 0,85% larutan NaCl steril sehingga mencapai suspensi
kekeruhan setara dengan Standard Mc.Farland 0,5. (Oli et al., 2012; Masadeh et
al., 2013). Kemudian diambil sebanyak 200µl suspensi menggunakan standard
Mc.Farland dan kultur setiap bakteri ditanam pada sediaan Trypticase Soy Agar
padat kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37°C. (Poelongan &
Praptiwi, 2010).
TESIS
EFEKTIVITA EKSTRA SIWAK …
IKA RHISTY CENDANA SARI
ADLN – PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
50
4.8.2 Prosedur pelaksanaan penelitian uji daya hambat bakteri
1. Disiapkan 7 tabung reaksi yang diisi masing-masing 100 µL media
Mueller Hinton Broth Untuk masing-masing bakteri
2. Pada masing-masing tabung dimasukkan 100 µL kultur bakteri
3. Setelah ekstrak siwak disiapkan dalam konsentrasi masing-masing
25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%,55%, 60%, 65%, 70%, 75%, dan
100%., digunakan masing-masing 100 µL ekstrak dan ditambahkan ke
dalam tabung. Tabung nomor 1 ditambahkan 100 µL ekstrak siwak
100 % , pada tabung nomor 2 ditambahkan 100 µL ekstrak siwak 75 %
, pada tabung nomor 3 ditambahkan 100 µL ekstrak siwak 70 % , pada
tabung nomor 4 ditambahkan 100 µL ekstrak siwak 65 % serta pada
tabung nomor 5 ditambahkan 100 µL ekstrak siwak 60 %, tabung
nomor 6 ditambahkan 100 µL ekstrak siwak 55%, Tabung nomor 7
ditambahkan 100 µL ekstrak siwak 50 % , pada tabung nomor 8
ditambahkan 100 µL ekstrak siwak 45 % , pada tabung nomor 9
ditambahkan 100 µL ekstrak siwak 40 % , pada tabung nomor 10
ditambahkan 100 µL ekstrak siwak 35 %, pada tabung nomor 11
ditambahkan 100 µL ekstrak siwak 30 %, dan tabung nomor 12
ditambahkan 100 µL ekstrak siwak 25%.
4. Disiapkan tabung nomor 13 sebagai kontrol positif dengan
menambahkan 100 µL kultur bakteri dengan media cair Trypticase
Soy Broth.
TESIS
EFEKTIVITA EKSTRA SIWAK …
IKA RHISTY CENDANA SARI
ADLN – PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
51
5. Disiapkan tabung nomor 14 sebagai kontrol negatif atau kontrol
sterilisasi dengan media cair Trypticase Soy Broth steril (tanpa
tambahan kultur bakteri dan ekstrak siwak)
6. Kemudian semua tabung diinkubasi dalam inkubator selama 24 jam
pada suhu 37°C.
7. Kemudian untuk mengetahui jumlah bakteri dari tiap-tiap hasil biakan
bakteri yang diberi perlakuan, dilakukan penanaman pada tiap kultur
dari tabung 1 sampai 7 pada cawan petri sebanyak 10 µL
menggunakan mikropipet dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu
37°C pada media Mueller Hinton Agar padat. Adanya pertumbuhan
masing-masing jenis bakteri ditandai dengan adanya koloni pada
media.
9.
Penghitungan koloni dilakukan dengan menggunakan alat penghitung
colony counter. Dengan syarat penghitungan koloni dengan metode
plate count tiap cawan petri antara 30-300 koloni.
11. Dilakukan replikasi percobaan sebanyak 3 kali, sehingga didapatkan 4
sampel untuk masing-masing hasil biakan tiap-tiap bakteri.
4.8.3 Prosedur pelaksanaan penelitian uji daya hambat pertumbuhan
biofilm bakteri
a. Pembuktian kultur biofilm E.faecalis
1. Dari sediaan kultur bakteri E. faecalis , 100µL suspensi dibiakkan
dalam polyprophylene tube yang mengandung 2 mL Trypticase Soy
TESIS
EFEKTIVITA EKSTRA SIWAK …
IKA RHISTY CENDANA SARI
ADLN – PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
52
Broth (TSB) dengan penambahan glukosa 1% dan diinkubasi selama
48 jam pada suhu 37◦C.
2. Sel biofilm dipanen melalui pembuangan media kultur dan membilas
tube sebanyak tiga kali dengan 0,2 ml larutan PBS (pH = 7,2) untuk
menghilangkan bagian bakteri yang non adesif.
3. Sel yang adesif, yaitu sel yang tetap melekat dalam well setelah
dilakukan pencucian dalam metode microtiter biofilm assay, dipanen
melalui proses vortex dan sentrifugasi. Pellet kultur sel tersebut
disuspensi dalam PBS untuk kemudian dikondisikan pada 0,5 Standar
turbiditas (kekeruhan) McFarland.
4. Untuk membuktikan adanya biofilm pada kultur, tube kultur dicat
dengan crystal violet. Keberadaan sel biofilm dideteksi lewat adanya
garis biofilm yang tampak pada dinding tube.
5. Sampel diambil dari 100µL suspensi Pellet kultur bakteri yang terbukti
mampu menghasilkan biofilm dan ditanam pada medium Trypticase
Soy Broth. (Masadeh et al., 2013).
b. Pelaksanaan uji daya hambat pertumbuhan biofilm bakteri
1. Disiapkan well yang diisi masing-masing 100 µL media Trypticase Soy
Broth dan penambahan glukosa 1% .
2. Pada masing-masing well dimasukkan 100 µL kultur bakteri E.faecalis
yang terbukti dapat menghasilkan biofilm.
3. Setelah ekstrak siwak disiapkan dalam konsentrasi masing-masing
100%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30 %, dan
25%. digunakan masing-masing 100 µL ekstrak dan ditambahkan ke
TESIS
EFEKTIVITA EKSTRA SIWAK …
IKA RHISTY CENDANA SARI
ADLN – PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
53
dalam tiap well. Tabung nomor 1 ditambahkan 100 µL ekstrak siwak
100 % , pada tabung nomor 2 ditambahkan 100 µL ekstrak siwak 75 %
, pada tabung nomor 3 ditambahkan 100 µL ekstrak siwak 70 % , pada
tabung nomor 4 ditambahkan 100 µL ekstrak siwak 65 % serta pada
tabung nomor 5 ditambahkan 100 µL ekstrak siwak 60 %, tabung
nomor 6 ditambahkan 100 µL ekstrak siwak 55%, Tabung nomor 7
ditambahkan 100 µL ekstrak siwak 50 % , pada tabung nomor 8
ditambahkan 100 µL ekstrak siwak 45 % , pada tabung nomor 9
ditambahkan 100 µL ekstrak siwak 40 % , pada tabung nomor 10
ditambahkan 100 µL ekstrak siwak 35 %, pada tabung nomor 11
ditambahkan 100 µL ekstrak siwak 30 %, dan tabung nomor 12
ditambahkan 100 µL ekstrak siwak 25%.
4. Disiapkan well sebagai kontrol positif dengan menambahkan 100 µL
ml kultur bakteri dengan 100 µL media cair Trypticase Soy Broth dan
100 µL chlorhexidine 0,1% sebagai kontrol negatif.
5. Selain itu disiapkan well sebagai kontrol ekstrak yang berisi 100 µL
ekstrak siwak 100% saja, dan well sebagai kontrol pewarnaan berisi
100 µL medium saja.
6. Well tersebut diinkubasi selama 48 jam pada suhu 37◦C.
7. Kemudian semua tabung dimasukkan ke dalam anaerobic jar berisi gas
campuran 95% NO2 dan 5% CO2 dan diinkubasi selama 24 jam pada
suhu 37°C.
8. Kultur biofilm diletakkan pada microplate kemudian dicuci 3 kali
dengan 0,2 mL PBS
TESIS
EFEKTIVITA EKSTRA SIWAK …
IKA RHISTY CENDANA SARI
ADLN – PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
54
9. Kultur biofilm yang menempel pada well di cat dengan 0,2ml crystal
violet 2% dan dibilas dengan 100 µL akuades steril.
10. Setelah kering, ditambahkan 0,2 ml acidified isopropanol pada tiap
well
9. Nilai Optical Density (OD) dibaca pada ELISA reader dengan panjang
gelombang 595 nm.
9. Perhitungan hambatan pertumbuhan biofilm bakteri setelah pemberian
ekstrak siwak ditentukan dengan melihat nilai Optical Density melalui
rumus biofilm assay sebagai berikut: (Pettit, 2005; Balaji et al., 2013;
Tang et al., 2014)
% hambatan pertumbuhan Biofilm = nilai OD kontrol positif - nilai OD perlakuan x 100%
Nilai OD kontrol positif
10. Dilakukan replikasi percobaan sehingga didapatkan 4 sampel pada
masing-masing perlakuan.
4.9
Analisis data penelitian
Dari data penelitian , baik daya hambat pertumbuhan bakteri secara
planktonik maupun biofilm bakteri, dilakukan uji Kolmogorof – Smirnov untuk
mengetahui distribusi normalnya, lalu dianalisis menggunakan uji Anova dengan
taraf kemaknaan 0,05 untuk mengetahui perbedaan dari masing-masing perlakuan.
Kemudian dilakukan uji LSD ( Least Square Differences) untuk melihat
perbedaan makna antar perlakuan. Analisis tersebut untuk melihat masing-masing
dosis ekstrak siwak yang memiliki daya hambat, baik terhadap pertumbuhan
bakteri maupun biofilm bakteri berdasar hasil Optical Density dari E. faecalis.
(Pudyani dkk, 2013)
TESIS
EFEKTIVITA EKSTRA SIWAK …
IKA RHISTY CENDANA SARI
ADLN – PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
55
4.10 Alur penelitian uji daya hambat bakteri dan pertumbuhan biofilm
bakteri
4.10.1 Pembentukan biofilm oleh bakteri E. faecalis
E. faecalis
100µL suspensi bakteri:
polyprophylene tube
berisi 2 mL TSB + 1%
Glukosa
Inkubasi selama 48 jam pada suhu 37◦C.
Media kultur dibuang dan tube dibilas dengan PBS (Phosphat Buffer
Saline) pH 7,2 untuk menghilangkan sel non adesif
Sel yang adesif dipanen dengan proses vortex + sentrifugasi
Pellet kultur sel disuspensi dalam PBS
Uji keberadaan biofilm dengan pengecatan Tryphan blue / Crystal violet
pada tube
100µL suspensi Pellet kultur yang terbukti menghasilkan biofilm ditanam pada
medium Trypticase Soy Agar.
TESIS
EFEKTIVITA EKSTRA SIWAK …
IKA RHISTY CENDANA SARI
ADLN – PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
56
4.10.2 Uji daya hambat bakteri dan daya hambat pertumbuhan biofilm
bakteri E. faecalis
Potongan siwak dikeringkan dan dihaluskan
Di rendam ke dalam etanol 96 % dengan metode soxhletasi
Ekstrak diperoleh melalui penguapan dengan elektromanthel
Ekstrak diencerkan dengan metode dilusi : konsentrasi ekstrak siwak 100%,
75%,70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%
Kesimpulan penelitian
TESIS
EFEKTIVITA EKSTRA SIWAK …
IKA RHISTY CENDANA SARI