PRODUKSI PROTEIN HETEROLOGUS DI DALAM SEL EUKARYOT

PRODUKSI PROTEIN DENGAN SISTEM
EKSPRESI DI SEL EUKARYOT
Suharsono
• Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi, IPB
• Departemen Biologi, FMIPA, IPB
• E-mail: [email protected]; [email protected]
Kelemahan sel prokaryot
Produksi protein heterologus eukaryot di sel
prokaryot (bakteri):
-Tidak stabil
-Kekurangan aktivitas biologis
-Dapat terkontaminasi oleh toksin dari bakteri
‰di dalam sel prokaryot tidak terjadi modifikasi
pascatranslasi
Pascatranslasi pada eukaryot
‰Pembentukan ikatan disulfida oleh disulfida
isomerase Æ pelipatan protein Æ menentukan
stabilitas dan aktivitas
‰Pemotongan proteolitik dari protein prekursor Æ
menentukan fungsi protein
‰Glikosilasi melalui penambahan residu gula Æ
menentukan stabilitas protein
-Terikat pada O: serin, treonin
-Terikat pada N: asparagin
‰Penambahan pada protein: fosforilasi, asetilasi,
sulfatasi, asilasi, γ-karboksilasi, miristilasi,
palmitasi
Glikosilasi
Khamir
Khamir
Serangga
Mamalia
Serangga
Terikat pada O
Mamalia
Terikat pada N
Vektor ekpresi pada eukaryot
1. Gen penanda seleksi di
eukaryot
2. Promoter
3. Signal berhenti transkripsi
dan translasi
4. Sekuen yang menandai
poliadenilasi pada transkrip
mRNA
+ Ori (plasmid) atau sekuen
komplementer (untuk
integrasi ke DNA kromosom
sel inang)
Introduksi DNA ke dalam sel:
•Transformasi (bakteri, khamir)
•Transfeksi (sel hewan)
Teknik untuk transformasi khamir
1. Elektroporasi (kejutan listrik berenergi tinggi)
2. Perlakuan Li asetat
3. Menggunakan protoplast
Transveksi pada sel hewan
1. Sel dicampur dengan DNA yang telah
dipresipitasi dengan CaPO4 atau DEAE-dextran
2. Elektroporasi
Sistem ekspresi Saccharomyces cerevisiae
Sebagai sel inang ekspresi gen eukaryot:
1. Sel tunggal, secara genetik dan fisiologis telah
diketahui, mudah tumbuh (di tabung reaksi dan
bioreaktor)
2. Mempunyai promoter kuat dan plasmid (2 μm)
3. Melakukan proses modifikasi pascatranslasi
4. Mensekresi beberapa protein, shg bila digunakan
untuk produksi protein rekombinan ekstrasel Æ
purifikasi mudah
5. Organisme yang dianggap aman
Protein rekombinan yang diproduksi oleh sistem ekspresi S. cerevisiae
Insulin: 50% produksi dunia diproduksi oleh S. cerevisiae
Vektor ekspresi S. cerevisiae
3 kelompok
1. Vektor episom atau plasmid, yeast episomal
plasmid (YEp)
2. Vektor terintegrasi atau yeast integrating plasmid
(YIp)
3. Kromosom-khamir buatan atau yeast artificial
chromosome (YAC)
YEp:
-ekstensif digunakan (produksi protein intra/ekstra sel)
-berdasarkan plasmid 2 μm dengan jumlah kopi yang
tinggi
-menggunakan inang S.c mutan auxotrofik, gen WT di
vektor Æ komplementasi misal: YEp (LEU2), S.c (leu2)
Vektor ekspresi S. cerevisiae
Promoter yang disenangi:
teregulasi secara ketat, indusibel
Misal: promoter yg diinduksi galaktosa: transkripsi naik
1000x bila + galaktosa
Terminasi transkripsi Æ ekspresi maksimal
Plasmid tidak stabil di S. c.
•dalam kultur berskala
besar (>10 liter)
Îintegrasi gen ke kr. Æ
YIp
Kendala: produk rendah
krn kopi gen tunggal
Îdiatasi: sasaran ke
DNA repetitif (rDNA=
200 kopi; sekuen δ =
400 kopi)
δ = bagian retrotransposon
= sekuen DNA Æ RNA Æ
DNA Æ integrasi ke
beberapa situs
A1 & A2 = ujung gen
yang tidak esensial
YAC
-pengklonan segmen besar
(100 kb), kromosom terpisah
di S.c.
-stabil
-untuk: peta fisik genom
manusia, analisis gen besar,
pustaka genom
-mirip kromosom:
Ori (ARS), sentromer, telomer
-belum digunakan untuk
produksi protein
-potensi: produksi protein dg
jumlah besar dari gen
multikopi atau protein dengan
subunit yang berbeda
Produksi protein intrasel di S. cerevisiae
Cu/Zn-SOD: agen terapi untuk penyakit bengkak
(osteroarthritis, rheumatoid arthritis, scleroderma,
ankylosing spondylitis)
Æ perlu Cu/Zn-SOD dari manusia
Superoksida +
H+
Cu/Zn-SOD
H2O 2
katalase/peroksidase
H2O + O2
• Ekspresi cDNA Cu/Zn-SOD manusia di E. coli Æ
alanin setelah metionin inisiator tidak terasetilasi
Produksi SOD manusia
Dengan YEp sehingga:
1. gen LEU2; 2. Ori dari plasmid 2 μm; 3. gen AmpR; 4. Ori
E. coli; 5. cDNA Cu/Zn-SOD manusia (promoter dan
terminator GAPD= glyceraldehyde phosphate
dehydrogenase)
S. c (LEU2-)
Seleksi medium
tanpa leusin
produk Cu/Zn-SOD
LEU2 tumbuh
Untuk memudahkan purifikasi:
ÆProtein disekresikan ke luar sel
ƒfusi dengan sekuen signal (peptida signal, sekuen
pendahulu) di hulu
contoh sekuen signal: faktor tipe kelamin (mating)
gen α, prepro-α-factor
Contoh: hirudin (dari Hirudo medicinalis) sebagai
antikoagulan darah
Kelemahan ekspresi di S. cerevisiae
1. Kadang ekspresi rendah dan hasil rendah
2. Hiperglikosilasi (>100 residu manosa) Æ
mengganggu fungsi, antigen
3. Protein kadang disekresikan di ruang periplasmik
Æ purifikasi mahal
4. Pada konsentrasi sel yang tinggi, menghasilkan
etanol yang toksik terhadap sel sehingga jumlah
protein yang disekresikan rendah
Sistem ekspresi selain khamir
• Pichia pastoris (methylothropic yeast), karena:
1. punya promoter yang diinduksi metanol (alkohol
oksidase): + metOH Æ 30% AOX; -metOH Æ 0%
AOX)
2. tidak mensintesis etanol sehingga dapat mencapai
kerapatan sel yang tinggiÆ jumlah protein yang
disekresikan tinggi
3. mensekresikan sedikit protein sehingga
mempermudah purifikasi protein rekombinan yang
disekresikan
Vektor ekspresi di P. p
1. GOI di antara promoter dan terminator AOX1
2. Ori dan penanda seleksi di E. coli
3. Penanda seleksi di khamir
Vektor integratif P. pastoris
Æ menghindari instabilitas plasmid
GOI dan penanda seleksi diintegrasikan ke kromosom:
1). rekombinasi tunggal; 2). rekombinasi ganda
GOI
-bakteri,
fungi, tan,
hewan
-manusia:
HBsAg, HSA
Alternatif inang lain:
Hansenula polymorpha: hemoglobin A manusia (2
α- dan 2 β-globin)
Schizosaccharomyces pombe
Candida utilis: monelin
Aspergillus: α-amylase, lipase, amyloglucosidase,
cellulase untuk pangan, minuman, dan industri dan
pulp.
Sistem ekspresi sel serangga-baculovirus
Baculovirus
Inang: invertebrata (serangga)
Siklus infeksi: 2 bentuk
1. Nukleokapsid tunggal (partikel virus):
dari sel terinfeksi
2. Polihedron: kumpulan nukleokapsid
(virion) terbungkus di dalam matriks
protein (polihedrin)
Sel lisis, organisme mati Æ polihedron
Polihedron melindungi virion
Polihedrin disintesis dalam jumlah banyak
pada tahap akhir (36-48 jam setelah
infeksi, selama 4-5 hari) s/d sel lisis dan
inang mati
Promoter polihedrin (polyh)
• sangat kuat, tidak untuk produksi virus
• proses pascatranskripsi
• dapat untuk produksi protein (polihedrin diganti
dengan GOI)
Îbaculovirus digunakan utk produksi protein
mamalia
Contoh:
Autographa californica multiple nuclear
polyhedrosis virus (AcMNPV) menginfeksi ulat
jengkal alfalfa (A.c) dan 30 spesies serangga, sel
serangga (ulat tentara, Spodoptera frugiperda)
Sistem vektor ekspresi Baculovirus
AcMNPV rekombinan:
1. promoter polihedrin dan bagian hulu AcMNPV
(situs rekombinasi)
2. MCS (di antara promoter dan terminator
polihedrin)
3. terminator polihedrin dan daerah hilir AcMNPV
(situs rekombinasi)
Î diperbanyak di E. coli
Sel serangga diinfeksi dengan AcMNPV dan vektor
(GOI) Î c.o. ganda Î GOI terintegrasi ke AcMNPV,
gen polihedrin hilang. Virion tanpa gen polihedrin Î
baculovirus rekombinan dapat diisolasi dari plak
tanpa oklusi
Identifikasi virus
rekombinan:
-hibridisasi, PCR
-biru-putih bila lacZ di
bawah kontrol promoter
baculovirus
Sel inang + baculovirus rekombinan
Î 4-5 hari panen protein
Protein yang dihasilkan oleh baculovirus
Sistem ekspresi sel mamalia
•produksi protein dg modifikasi pascatranslasi
•Sel COS, BHK, HEK-239: ekspresi sementara dan
cepat untuk mengetahui integritas konstruksi
•Sel CHO: ekspresi stabil & produksi protein dalam
jumlah besar
Vektor ekspresi sel mamalia:
•Ori di sel eukaryot (dari virus ex: SV40)
•promoter & terminator pengendali GOI
•penanda seleksi di sel eukayot (thymidine kinase)
Vektor ekspresi sel mamalia
p= promoter
I= intron
pa= polyadenilation
MCS= multiple cloning sites
SMG= selectable marker gene
ori= origin of replication
Protein dengan 2 atau lebih subunit
•Protein yang tersusun dari 2 rantai peptida yang
berbeda
•human thyroid-stimulating hormone
(heterodimer); hemoglobin (tetramer, α2β2) &
antibodi (tetramer, H2L2)
Sintesis: @ peptida terpisah, dirakit menjadi dimer
atau tetramer secara in vitro Æ tidak efisien
In vivo Æ efisien:
2 vektor ekspresi @ cDNA untuk satu subunit &
penanda seleksi berbeda
•Seleksi dengan 2 agen Æ sel hidup membawa dua vektor Æ
protein rekombinan dimer/tetramer
Kendala: satu vektor hilang, jumlah kopi berbeda (jumlah
protein beda)
Æ satu vektor membawa 2 gen di bawah promoter &
terminator berbeda
Vektor bisistronik
•jumlah kedua protein sama
•mengandung 2 GOI dipisah oleh IRES (internal ribosome
entry site, dari virus mamalia) dikontrol satu promoter &
terminator Æ transkrip tunggal Æ translasi dari ujung 5’
untuk rantai α dan dari IRES untuk rantai β
Penanda seleksi untuk vektor ekspresi mamalia
Skema seleksi untuk meningkatkan produksi protein
•jumlah kopi vektor
ekspresi dinaikkan
dengan peningkatan
konsentrasi agen
seleksi secara bertahap