Identifikasi Jenis Khamir yang Diisolasi dari Tanah Gambut
advertisement
BioSMART Volume 6, Nomor 1 Halaman: 10-14. ISSN: 1411-321X April 2004 Identifikasi Jenis Khamir yang Diisolasi dari Tanah Gambut Taman Nasional Bukit Duabelas, Jambi Identification of yeasts isolated from peat soil Bukit Duabelas National Park, Jambi ATIT KANTI Bidang Mikrobiologi, Pusat Penelitian Biologi-LIPI, Bogor 16122. Diterima: 23 Oktober 2003. Disetujui: 15 Desember 2003. ABSTRACT Exploration and identification of yeasts are the main tools to study about the diversity of tropical microflora. Microorganism of tropical peat soil is unique. Yeast that grows in the peat soils has ability to adapt with acid soil rich in high organic substances. Peats yeasts were quite heterogeneous. About eight strains were successfully isolated from peat soil. They were taxonomically divided into two major groups, namely imperfect ascomycetous and imperfect basidiomycetous yeasts. Specifically on the basis of its morphological and physiological characters, all isolates can be divided into three groups. Of the 8 isolates three isolates were included in Group I and identified as Candida tropicalis, two in Group II as Candida blankii, and three in Group III identified into genus level as Cryptococcus sp. Physiological diversity and enzymatic characteristics of those isolates are important characters to explore the ecological role of yeast in peat ecosystem. Key words: yeast, peat soil, Taman Nasional Bukit Duabelas. PENDAHULUAN Taman Nasional Bukit Dua Belas merupakan salah satu kawasan konservasi di wilayah Propinsi Jambi yang mempunyai luas sekitar 60.500 ha, serta diyakini mempunyai keragaman flora dan fauna yang tinggi. Walaupun belum ada justifikasi ilmiah yang menghubungkan antara keragaman flora, fauna dengan mikroba, akan tetapi diyakini ada ketergantungan flora dan fauna terhadap mikroba. Salah satu ekosistem yang subur yang dapat menunjang kehidupan mikroba dengan baik adalah tanah, karena memiliki senyawa organik yang merupakan akumulasi tanaman yang telah diuraikan dan mineral yang memadai untuk keperluan pertumbuhan jasad renik. Oleh karena itu tanah merupakan eksosistem yang subur untuk mikroorganisme tanah. Mikroorganisme yang hidup di dalam tanah dapat menguraikan zat-zat organik yang kompleks menjadi zat-zat yang lebih sederhana sehingga dapat digunakan oleh mahluk hidup lain seperti tumbuhan dan hewan (Sutedjo et al., 1991). Khamir memiliki beberapa enzim penting seperti selulase, fosfatase, lipase, dan proteinase yang menyebabkan khamir memegang peran yang penting dalam dekomposisi senyawa organik dan dapat digunakan untuk keperluan industri (Spencer dan Spencer, 1997). Keragaman khamir tanah telah dilaporkan oleh ♥ Alamat korespondensi: Jl. Ir. H. Juanda 18, Bogor 16122. Tel.: +62-251-324006. Faks.: +62-251-325854 e-mail: [email protected] beberapa peneliti sebelumnya yang telah mengisolasi khamir dari berbagai variasi tipe ekosistem tanah, seperti daerah Antartika, gurun, dan hutan subtropika (Phaff dan Starmer, 1987). Akan tetapi belum banyak peneliti yang melaporkan tentang keragaman khamir yang hidup pada tanah di daerah hutan tropis, terutama tipe ekosistem khusus seperti ekosistem lahan gambut (Spencer dan Spencer, 1997). Gambut merupakan ekosistem yang unik karena memiliki kandungan bahan organik dan keasaman tinggi, serta ditandai dengan ketersediaan unsur hara nitrogen dan fosfat yang rendah. Untuk mengungkapkan keragaman khamir di alam, teknik isolasi dan identifikasi khamir telah banyak dikembangkan oleh beberapa peneliti. Hal ini dapat memberikan harapan ditemukannya khamir jenis baru dan diyakini jumlah khamir di alam jauh lebih tinggi dibandingkan dengan khamir yang telah diketahui selama ini (Kurtzman dan Jack, 1998). Di samping peran ekologi khamir yang menentukan kecepatan dan arah proses degradasi senyawa organik di dalam tanah, khamir juga telah lama digu-nakan untuk proses industri seperti pada pembuatan minuman beralkohol, fermentasi tape, pembuatan makanan ternak, kosmetik, dan antibiotik (Tanaka et al., 1990 ; Ardhana dan Fleet, 1989). Di samping itu, hasil penelitian yang dilaporkan oleh Lansane et al., (1997) menunjukkan bahwa khamir di masa depan dapat dikembangkan sebagai “renewable resources”, beberapa jenis khamir mampu memproduksi alkohol dari berbagai jenis karbohidrat yang berbeda. Berbagai penemuan tersebut akan memacu kegiatan eksplorasi khamir, terutama jenis-jenis khamir yang mempunyai potensi ekonomi. 2004 Jurusan Biologi FMIPA UNS Surakarta KANTI – Khamir tanah gambut TN Bukit Duabelas Penelitian ini bertujuan untuk mengungkapkan keragaman jenis khamir di tanah gambut dan mempelajari nilai penting dari isolat tersebut untuk keperluan konservasi mikroba. Dari penelitian ini diharapkan diperoleh data keragaman khamir yang akan menjadi dasar untuk menggali potensi ekologi dan ekonomi khamir di alam. BAHAN DAN METODE Isolat khamir dan cara penyimpanan. Delapan isolat khamir yang diisolasi dari ekosistem tanah gambut dan 3 “strain type” digunakan sebagai biak acuan. Isolat-isolat tersebut disimpan pada yeast malt extract (YME) agar dengan komposisi sebagai berikut: 2% agar (Difco Laboratories, Detroit, MI, USA), 0,5% Bacto peptone (Difco Lab), 0,3% yeast extract (Difco Lab), 0,3% malt extract (Difco Lab) dan 1% glukosa (Merck). Isolat yang telah murni disimpan pada media YME miring di suhu 4°C dan disimpan pada 10% gliserol, pada suhu –80°C (Kirsop dan Doyle, 1991). Khamir yang digunakan sebagai biak acuan adalah Debaryomyces hansenii JCM 5912T, Rhodotorula minuta TUA 0960T, dan Candida catenulata JCM 1604T. Isolasi khamir. Untuk isolasi khamir yang berasal dari tanah dan ekosistem sekitarnya digunakan teknik pengkayaan media yang dilakukan melalui tiga tahap. Tahap awal: media yang digunakan pada tahap ini yaitu media Cytophaga dengan komposisi sebagai berikut: 0,1% (NH4)2SO4, 0,1% MgSO4, 0,1% MnSO4, 0,1% glukosa, 0,1% yeast extract, 1% CMC dan 0,1% FeCl3 (pH 6,8). Sebanyak 10 g sampel tanah dimasukkan ke dalam 100 ml media Cytophaga dan dishaker selama 3 hari pada suhu 30oC. Tahap kedua: media yang digunakan pada tahap ini yaitu media yeast nitrogen base (YNB) dengan komposisi sebagai berikut 0,17% YNB without amino acid and ammonium sulfat (Difco Lab), 0,5% ammonium sulfat dan 10% glukosa (pH 6,8). Sebanyak 10 ml sampel dari tahap awal dimasukkan ke dalam medium YNB dengan kandungan glukosa 10% dan dishaker selama 3 hari pada suhu 30oC. Selanjutnya masuk ke dalam tahap ketiga. Tahap ketiga: pada tahap ini metode dan media yang digunakan sama dengan yang dilakukan pada tahap kedua, namun konsentrasi glukosa yang digunakan lebih tinggi yaitu sebesar 20%. Isolasi dilakukan dengan plate count methods, dengan ulangan sebanyak tiga kali dan menggunakan media Cytophaga. Kultivasi dari isolat dilakukan pada suhu 30oC selama 3 hari Pemurnian. Khamir yang telah didapat, dimurnikan dengan cara menanam pada media YME agar (pH 6,8), diikuti dengan inkubasi pada suhu 25oC selama 48 jam. Koloni yang terpisah dengan baik dipilih dan ditanam kembali pada media yang sama sebanyak dua ulangan. Setelah berumur 2 hari, koloni yang didapat diamati dengan menggunakan mikroskop untuk pengamatan morfologi. Identifikasi khamir. Khamir yang telah diisolasi diidentifikasi berdasarkan beberapa karakter yang meliputi: morfologi sel vegetatif dan reproduksi vegetatif yang 11 dianalisis berdasarkan Hawksworth (1995), serta karakterisasi fisiologi dan biokimia yang dianalisis berdasarkan Kurtzman dan Jack, (1998) dan Barnett et al. (2000). HASIL DAN PEMBAHASAN Dari tanah gambut Taman Nasional Bukit Duabelas, Jambi berhasil diisolasi 8 isolat khamir yang mendominasi ekosistem tersebut. Karakteristik morfologi dari ke-8 isolat ditunjukkan pada Tabel 1. Tanah gambut merupakan suatu ekosistem yang ekstrim, karena memiliki kandungan bahan organik, keasaman, kandungan air, dan porositas yang tinggi, miskin unsur hara, serta proses dekomposisi yang lambat (Setiadi, 1999). Didasari oleh keadaan ekosistem yang unik tersebut, keberadaan khamir pada tanah gambut hanya didominasi oleh khamir-khamir yang mampu beradaptasi dengan ekosistem yang mempunyai kandungan unsur hara nitrogen dan fosfat rendah, kecenderungan pH asam, serta kandungan bahan organik tinggi. Dibandingkan dengan bakteri dan jamur, khamir mampu tumbuh baik pada rentang pH yang lebih bervariasi, dan umumnya khamir lebih suka tumbuh pada kondisi asam (pH 4-4,5) (Kurztman dan Jack, 1998). Tabel 1. Karakteristik morfologi khamir yang diisolasi dari tanah Gambut, Jambi. DBB, Ascospora, Dnase, basidiospora Urease 1 Tanah gambut 20 A subglobose 2 Tanah gambut 20 A subglobose 3 Tanah gambut 20 A subglobose 4 Tanah gambut 20 A ovoidal 5 Tanah gambut 20 A ovoidal 6 Tanah gambut 20 A spheroidal + 7 Tanah gambut 20 A spheroidal + 8 Tanah gambut 20 A spheroidal + Keterangan: DBB = diazonium blue Salt B. No. Asal Morfologi sel Populasi khamir di tanah lebih rendah dibanding-kan dengan populasi jamur (Atlas dan Bartha, 1993). Fenomena tersebut disebabkan oleh khamir tidak mampu mendapatkan substrat yang lebih bervariasi, dibandingkan dengan jamur yang mempunyai sifat morfologi yang unik, yaitu mempunyai kemampuan membentuk hifa, sehingga memungkinkan jamur dapat tumbuh dan masuk pada permukaan tanah yang agak lunak. Hal ini mengakibatkan jamur dapat tumbuh menutupi permukaan tanah. Sifat yang tidak dimikili oleh khamir, mengakibatkan jumlah populasi khamir di tanah selalu lebih rendah jika dibandingkan dengan populasi jamur. Karena perbedaan sifat morfologi tersebut, maka pengembangan teknik isolasi khamir merupakan tahapan yang paling menentukan untuk keberhasilan mengungkapkan keragaman khamir di alam. Salah satu teknik isolasi yang dikembangkan oleh Wickerman (1951) yaitu dengan menggunakan media yang memiliki kadar glukosa tinggi sekitar 20%. Kadar gula yang tinggi digunakan untuk menghambat pertumbuhan jamur yang tidak tahan dengan tekanan osmotik tinggi. 12 B i o S M A R T Vol. 6, No. 1, April 2004, hal. 10-14 Karakteristik morfologi dari ke-8 isolat khamir ditunjukkan pada Tabel 1. Bentuk sel khamir ber-variasi dari bentuk subglobose (1, 2, 3), ovoidal (4, 5) dan spheroidal (6, 7, 8). Khamir juga mempunyai variasi bentuk sel seperti globose, oval, subglobose, ellipsoid, dan sausage (Hawksworth et al., 1995). Setelah 2 minggu diinkubasikan pada media YME agar, 8 isolat tidak membentuk pigmen, dan berwarna putih kekuningan. Hal ini ditunjang oleh penelitian yang dilaporkan oleh Spencer dan Spencer (1997), bahwa hampir 90% khamir mempunyai penampakan morfologi putih kekuningan. Pengamatan pembentukan ascospora dan basidiospora memperlihatkan bahwa ke-8 isolat tidak melakukan pembentukan ascospora dan basidio-spora selama proses perkembangbiakannya, dan hanya melakukan perkembangbiakan dengan tahapan aseksual. Ciri tersebut menguatkan bahwa isolat khamir yang diteliti merupakan anggota dari kelompok khamir imperfect, yaitu khamir yang tidak melakukan perkembangbiakan secara seksual, tetapi berkembang biak dengan cara aseksual, yaitu dengan cara membentuk tunas (budding). Pengamatan siklus seksual khamir merupakan salah satu kunci identifikasi yang cukup penting dalam membedakan khamir seksual dan aseksual, oleh sebab itu banyak media dan metode yang dikembangkan untuk merangsang pembentukan ascospora dan basidiospora. Berdasarkan penelitian yang dikembangkan oleh Kawado et al. (1992) kemampuan khamir untuk membentuk ascospora dapat hilang apabila khamir disimpan dalam waktu yang cukup lama. Kawado et al., (1992) telah berhasil mengembangkan media pembentukan spora yang diperkaya dengan glutathione, dimana zat tersebut berfungsi untuk merangsang aktivitas enzim glikolitik yang berlanjut dengan meningkatnya sintesis glutathion thiol ester pada khamir yang ditumbuhkan pada media tersebut. Berdasarkan uji Dnase, urease dan Diazonium Blue Salt B (DBB), 8 isolat khamir dapat dibagi dalam 2 kelompok yaitu kelompok I yang memberikan hasil negatif (1, 2, 3, 4, dan 5), serta kelompok II yang memberikan hasil positif (6, 7, dan 8). Penelitian yang dilakukan oleh Kurtzman dan Jack (1998) dan Sugita et al. (1997) menyatakan bahwa adanya perbedaan stuktur dinding sel antara kelompok khamir ascomycetes dan basidiomycetes menjadi penanda yang sangat membantu dalam proses identifikasi khamir dengan menggunakan uji DBB dan Dnase. Basidiomycetes karena stuktur dinding selnya yang khas memberikan reaksi warna merah tua bila diuji dengan larutan buffer DBB. Karakteristik fisiologis 8 isolat yang diteliti diperlihatkan pada Tabel 2. Sebagian isolat mempunyai kemampuan untuk memfermentasi glukosa sebagai salah satu sumber karbon yang diujikan kecuali isolat 6, 7, dan 8. Isolat 1 dapat tumbuh secara optimal pada media yang mengandung beberapa macam sumber karbon seperti galaktosa, sukrosa, maltosa, cellobiosa, dan laktosa. Sedangkan bila ditumbuhkan pada media yang mengandung L-sorbosa, D-ribosa, ribitol, arbutin dan xylitol, isolat tersebut tidak dapat tumbuh secara optimal. Isolat 2, memberikan reaksi positif bila ditumbuhkan pada hampir semua jenis karbon yang diujikan kecuali pada arbutin dan xylitol. Pola assimilasi fisiologis yang hampir sama dapat diamati pada isolat 3 yang mampu menggunakan dengan baik beberapa sumber karbon untuk proses assimilasinya. Kecuali untuk satu jenis sumber karbon melezitose. Isolat 4 dapat tumbuh dengan optimum pada beberapa sumber karbon di antaranya galaktosa, maltosa, cellobiosa, L-arabinosa dan dan dulcitol (Tabel 2.), kecuali pada melezitose isolat ini memberikan reaksi negatif. Tabel 2. Karakteristik fisiologi khamir yang diisolasi dari tanah gambut, Jambi. No. isolat 1 2 3 4 5 6 7 8 Fermentasi glucosa + + + + + - - - Assimilasi glucosa galactosa L-sorbosa sucrosa maltosa cellobiosa lactosa mellibiosa raffinosa melezitosa inulin strach D-xylosa L-arabinosa D-arabinosa D-ribosa L-rhamnosa erytritol ribitol dulcitol D-mannitol D-sorbitol methyl glucoside 2-ketogluconocid asam succinate D-glucuronic arbutin xylitol asam citrate nitrate nitrite L-lysine + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + cadaverine glucosamine + + + - + + + + + + + + + + + + Pertumbuhan pada: suhu 37oC suhu 40oC + + + + + + + + + + + + + + + + KANTI – Khamir tanah gambut TN Bukit Duabelas Isolat 5, 6, 7, dan 8 mempunyai kesamaan dalam karakteriksasi fisiologi, yaitu kemampuan untuk tumbuh dengan baik pada media yang mengandung sumber karbon raffinosa, melezitosa, D-xylosa, L-arabinosa, dan Darabinosa, tetapi keempat isolat tersebut tidak dapat melakukan proses assimilasi dengan menggunakan Darabinosa sebagai salah satu sumber karbonnya. Fenomena yang menarik dari seluruh isolat yang diteliti adalah kemampuannya untuk mengasimilasi soluble starch sebagai salah satu sumber karbon. Karakterisasi asimilasi sumber nitrogen menunjukkan bahwa seluruh isolat tidak dapat tumbuh dengan baik bila ditumbuhkan pada media dengan nitrat sebagai satu-satunya sumber nitrogen, sebaliknya isolat 5, 6, 7, dan 8 dapat menggunakan nitrit dalam proses assimilasinya. Seluruh isolat yang berhasil diisolasi dapat tumbuh secara optimal pada beberapa sumber nitrogen lain yang diujikan, seperti L-lysine, cadaverine, dan glucosamine. Berdasarkan sifat karakteristik fisiologis yang dimiliki oleh isolat 1, 2, dan 3, maka isolat tersebut dapat diidentifikasi pada tingkat marga sebagai Candida sp. Candida merupakan salah satu marga yang tidak melakukan perkembangbiakan secara seksual selama siklus hidupnya, kemampuan perkembanganbiakan ini dapat diamati dengan adanya pembentukan ascospora atau basidiospora (Nakase dan Matofumi, 1998). Seperti dilaporkan oleh Hamamoto et al. (1998), Kurtzman dan Robnett (1998), dan Barnett et al. (2000) yang menekankan bahwa pengamatan pembentukan ascospora dapat digunakan secara efektif untuk membedakan khamir yang melakukan siklus seksual dan yang tidak melakukan siklus seksual selama masa perkembangbiakannya. Akan tetapi seringkali kemampuan pembentukan ascospora tersebut mengalami penurunan apabila khamir tersebut tidak hidup pada ekosistem asalnya. Dengan karakter fisiologis yang dimilikinya, isolat 1, 2 dan 3 dapat diidentifikasikan pada tingkat jenis sebagai Candida tropicalis. Candida merupakan salah satu marga khamir yang paling besar dan sangat umum diisolasi dari ekosistem tanah (Spencer dan Spencer, 1997, Lanchance dan Starmer, 1998, Buzzini dan Alexandro, 2000). Penelitian yang dilakukan oleh Phaff dan Starmer (1987) mengemukakan bahwa terdapat beberapa kelompok khamir yang secara tetap hidup di dalam tanah dan terdapat pula kelompok khamir yang hidup sementara dalam tanah. Faktor yang mempengaruhi hal tersebut karena khamir yang hidup di tanah sangat tergantung kepada mikroorganisme lain yang berfungsi untuk melakukan perombakan senyawa-senyawa polimer di dalam tanah. Beberapa khamir yang hidup permanen dalam tanah di antaranya Schwanniomyces occidentalis, Candida sp., Lipomyces tetrasporus, Cryptococcus sp. dan beberapa jenis khamir yang termasuk ke dalam marga Rhodotorula sp. (Spencer dan Spencer, 1997). Isolat 4 dan 5 berbeda pada beberapa karakter fisiologis, akan tetapi mempunyai karakter fenotipe yang dekat dengan Candida blankii dan diidentifikasikan sebagai jenis tersebut. Isolat 6, 7, dan 8 mempunyai karakter khusus yang menjadi pembeda dengan isolat yang lainnya. 13 Isolat dalam kelompok ini digolongkan ke dalam khamir basidiomycetes yang dicirikan dengan reaksi positif pada uji urease dan DBB. Berdasarkan hasil yang disajikan pada Tabel 2, diasumsikan bahwa isolat ini digolongkan dalam khamir basidiomycetes aseksual dan diidentifikasi pada tingkat marga sebagai Cryptococcus sp. Cryptococcus merupakan salah satu marga khamir yang kerap diisolasi dari tanah, dan penelitian yang dilakukan oleh Nakase et al. (1996) dilaporkan bahwa Cryptococcus merupakan “cellulolytic yeasts” dan mempunyai kemampuan untuk merombak sellulosa menjadi glukosa. Fenomena ini menunjukkan bahwa khamir turut berperan dalam proses perombakan senyawa-senyawa polimer di dalam tanah. Untuk mengungkapkan keragaman dan potensi khamir di alam, beberapa peneliti mengisolasi khamir dari berbagai macam sumber seperti daun, bunga, rumput, dan berhasil mengungkapkan beberapa jenis khamir baru (Sugita et al., 1997; Gibas et al., 1998; Kurtzman, 2000, dan Buzzini dan Alexandro, 2000). Pada penelitian ini digunakan teknik isolasi khusus dengan melakukan isolasi bertahap dan digunakan untuk mengisolasi khamir yang mempunyai kemampuan enzimatik sellulase dan fosfatase. KESIMPULAN Delapan isolat khamir yang diisolasi dari tanah Taman Nasional Bukit Duabelas Jambi, dapat digolongkan ke dalam tiga kelompok besar berdasarkan karakteristik morfologi dan fisiologinya. Kelompok pertama terdiri dari 3 isolat (1, 2, dan 3) dan diidentifikasi sebagai Candida tropicalis. Kelompok kedua terdiri dari 2 isolat (4 dan 5) dan diidentifikasi sebagai Candida blankii, kelompok terakhir digolongkan ke dalam khamir basidiomycetes dan diidentifikasi sampai pada tingkat marga sebagai Cryptococcus sp. DAFTAR PUSTAKA Ardhana, M.M. and G.H. Fleet. 1989. The microbial ecology of tape ketan fermentation. International Journal of Food Microbiology 9: 157165. Atlas, R.M. and R. Bartha. 1993. Microbial Ecology, Fundamental and Application. Reading-Mass.: Addison Wesley. Barnett, J.A, R.W. Payne, and D. Yarrow. 2000. Yeasts Characteristics and Identification. London: Cambridge University Press. Buzzini, P and M. Alexandro. 2000. Biodiversity of killer activity in yeasts isolated from the Brazilian rain forest. Canadian Journal of Microbiology 46: 607-611. Gibas C., T. Masako, S. Takashi, and N. Takashi. 1998. Three new species of Kockovaella isolated from plants collected in the Ogasawara Islands. Journal of General and Applied Microbiology 44: 11-18. Hamamoto, M., K. Takashi, and N. Takashi. 1998. Fellomyces ogawarensis sp.nov. and Fellomyces distylii sp.nov., yeasts isolated from a plant in Japan. International Journal of Systematic Bacteriology 48: 287-293. Hawksworth, D.L., P.M. Kirk, B.C. Sutton, and D.N. Pegler. 1995. Ainsworth & Bisby’s Dictionary of the Fungi, 8 th edn. WallingfordUK.: CAB International. Kawado, A., T. Suizu, S. Imayasu, and T. Shigematsu. 1992. Highly efficient sporulation induced by glutathione or glutathionethiol ester in sake and wild type yeast. Journal of Fermentation and Bioengineering 104: 257-268. 14 B i o S M A R T Vol. 6, No. 1, April 2004, hal. 10-14 Kirsop, B.E. and A. Doyle. 1991. Maintenance of Microorganism and Cultured Cells. A Manual of Laboratory Methods. New York: Academic Press, Limited. Kurtzman, C.P. and C.J. Robnett. 1998. Identification and phylogeny of ascomycetous yeasts from analysis of nuclear large subunit (26S) ribosomal DNA partial sequences. Antonie van Leeuwenhoek 73: 331371. Kurtzman, C.P. and W.F. Jack. 1998. The Yeast A Taxonomic Study. New York: Elsivier. Kurtzman, C.P. 2000. Three new ascomycetous yeasts from insectassociated arboreal habitats. Canadian Journal of Microbiology 46: 50-58. Lanchance, A. and W.T. Starmer. 1998. Yeasts and Ecology. New York: Marcel Dekker. Lansane, B.K., G. Vijayalakshi, M.M. Krishnaiah. 1997. Yeast and energy; The production of fuel-grade ethanol. In: Spencer, J.F.T. and D.M. Spencer. (ed.). Yeasts in Natural and Artificial Habitats. Berlin: Springer Verlag. Nakase, T., S. Matofumi, H. Makiko, T. Masako, H. Takushi, and F. Sakuzo. 1996. A taxonomic study on cellulolytic yeasts and yeast-like microorganisms isolated in Japan. II. The Genus Cryptococcus. Journal of General and Applied Microbiology 42: 7-15. Nakase, T. and S. Matofumi. 1998. Biochemical studies in the yeast genus Candida. Cellular and Molecular Biology 30 (3): 291-301. Phaff, H.J. and W.T. Starmer. 1987. Yeast associated with plants, insects and soil. In: Spencer, J.F.T. and D.M. Spencer (ed.). Yeasts in Natural and Artificial Habitats. Berlin: Springer Verlag. Setiadi, B. 1999. Masalah dan Prospek Pemanfaatan Gambut. Jakarta: Penerbit BPPT-HSF. Spencer, J.F.T. and D.M. Spencer. 1997. Yeasts in Natural and Artificial Habitats. Berlin: Springer Verlag. Sugita, T., T. Masako, H. Makiko, B. Paipan, and N. Takashi. 1997. Bensingtonia sakaguchii sp.nov. isolated from a leaf of Bischofia javanica in the Ogawara Islands. The Journal of General and Applied Microbiology 43: 231-235. Sutedjo, M.M., A.G. Kartasapoetra, dan Sastroatmojo. 1991. Mikrobiologi Tanah. Jakarta: Rineka Cipta. Tanaka, T., M.T. Suzuki, N. Takashi, W. Daengsubha, M. Chaowsangket, P. Suyanandana, M. Watanabe, K. Ohno, T. Murayama, H. Iino, and M. Kozaki. 1990. Amylolytic Yeasts of Indonesian Koji-cake; Ragi. Tokyo: Report in graduation work at Showa Women’s University. Wickerman, L.J. 1951. Taxonomy of Yeasts. Technical Bulletine No. 1029. Washington, D.C.: U.S. Department of Agriculture.
