IDENTIFIKASI LUTUNG JAWA (Trachypithecus auratus) DI JAVAN

IDENTIFIKASI LUTUNG JAWA (Trachypithecus auratus)
DI JAVAN LANGUR CENTER (JLC) COBAN TALUN, BATU
BERDASARKAN SEKUEN Cytochrome-b
Rita Rizky Rahmawati, Dwi Listyorini, Abdul Gofur
Universitas Negeri Malang
Email: [email protected]; [email protected];
[email protected]
ABSTRAK: Tujuan penelitian ini adalah untuk mengidentifikasi subspesies
Lutung Jawa (T. auratus) berdasarkan sekuen Cyt-b. Jenis penelitian ini adalah
deskriptif eksploratif dengan sampel dua ekor Lutung Jawa (T. auratus) dari
Javan Langur Center (JLC) yang bernama Andin (♀) dan Bobby (♂).
Amplifikasi gen target Cyt-b dari DNA total darah menggunakan primer
Forward L15162 5’-CTTCCATGAGGACAAATATC-3’ dan primer Reverse
Rmuc1
5’-GTGGAGTATAGGTATGATTGC-3’.
Rekonstruksi
pohon
filogenetik menggunakan software MEGA5 dengan metode maximum likelihood
(ML), sedangkan analisis pairwise distance menggunakan model Kimura-2
parameter. Berdasarkan analisis diketahui bahwa Andin dan Bobby berada satu
kelompok dengan T. a. auratus, sehingga dapat disimpulkan bahwa kedua
sampel termasuk dalam T. a. auratus (Lutung Jawa sebaran Jawa bagian Timur).
Kata Kunci: Lutung Jawa, Javan Langur Center (JLC), Cytochrome-b
Lutung Jawa (Trachypithecus auratus) merupakan salah satu jenis lutung
endemik Indonesia (Wahyono dan Supriatna dalam Fuadi, 2008). Lutung Jawa (T.
auratus) hidup secara berkelompok, berkisar antara 6 hingga 30 ekor (Nijman,
2000; Kurniawan, 2012b). Groves (1985) membagi spesies T. auratus menjadi
dua subspesies, yaitu T. auratus auratus dan T. auratus mauritius. Subspesies T.
auratus auratus dapat ditemukan di Jawa Timur, Pulau Sempu, Bali, dan
Lombok, sedangkan subspesies T. auratus mauritius dijumpai terbatas di Jawa
Barat dan Banten. Lutung Jawa sebaran Jawa bagian Timur (T. a. auratus) dan
sebaran Jawa bagian Barat (T. a. mauritius) memiliki perbedaan dari segi
morfologi.
Javan Langur Center (JLC) merupakan salah satu lembaga ex-situ yang
secara administratif adalah bagian dari Javan Primate Project (Program
Konservasi Primata Jawa) – The Aspinall Foundation (TAF) Indonesia Program
(Kurniawan, 2012b). Lembaga yang berada di kawasan Coban Talun Batu Jawa
Timur ini lebih spesifik dengan programnya untuk merawat dan merehabilitasi
Lutung Jawa (T. auratus) yang tersebar di Jawa bagian Timur, yaitu subspesies T.
auratus auratus. Data yang tersedia di Javan Langur Center (JLC) hanya data
morfometrik masing-masing individu Lutung Jawa (T. auratus) dan data lokasi
penangkapan atau penyitaan dari masyarakat. Ketersediaan data berupa karakter
tingkah laku dan morfologi belum sepenuhnya mampu menyelesaikan masalah
hubungan secara evolusioner dari Lutung Jawa (T. auratus) (Karanth et al., 2008).
Metode uji DNA merupakan metode yang paling sering digunakan untuk
mengidentifikasi spesimen atau sampel hewan (Tsai et al., 2007). Kemampuan
DNA mitokondria dalam memberikan informasi kajian molekuler didukung
dengan laju evolusi DNA mitokondria yang sangat cepat, secara garis besar
dianggap 5 hingga 10 kali lebih tinggi jika dibandingkan dengan DNA inti pada
beberapa spesies mammalia (Liedigk et al., 2009; Vun et al., 2011), hal ini
dikarenakan DNA mitokondria memiliki stabilitas paling tinggi dan jumlah kopi
yang paling tinggi dibandingkan DNA inti.
Sekuen gen dari DNA mitokondria dapat diperoleh pada jaringan, feses,
rambut dan sebagainya (Liu et al., 2008). Tsai et al. (2007) menjelaskan bahwa,
untuk mengidentifikasi hewan dapat dilakukan melalui sequencing dari gen
Cytochrome-b (Cyt-b) DNA mitokondria, sehingga metode genetik ini telah
digunakan untuk mengkaji identitas spesies dari ikan air tawar, kerang putih,
harimau, dan primata atau untuk mengetahui habitat asli Cetacea. Panjang gen
Cyt-b mencapai 1.140bp (Castresana, 2001). Gen Cyt-b dari DNA mitokondria
telah ditemukan sebagai indikator yang kuat untuk identifikasi spesies dengan
teknik analisis DNA, selain itu juga digunakan untuk kajian evolusi molekuler
(Barlett and Davidson dalam Prusak et al., 2005). Gen Cyt-b terbukti lebih akurat
dalam menyelesaikan masalah hubungan filogeni mammalia dan dapat
membedakan tingkat spesies (Farias et al., 2001). Gen ini memiliki lebih banyak
variasi sekuen jika dibandingkan dengan gen lainnya pada DNA mitokondria.
METODE
Objek yang digunakan dalam penelitian ini adalah Lutung Jawa (T. auratus)
yang berada di pusat rehabilitasi Javan Langur Center (JLC). Sampel yang
digunakan dalam penelitian ini adalah sampel darah yang diambil dari Lutung
Jawa (T. auratus) bernama Bobby (♂) dan Andin (♀). Kedua sampel berada
dalam tahap dewasa dengan umur masing-masing adalah 11 tahun untuk Andin
dan 5 tahun untuk Bobby.
Isolasi whole DNA menggunakan protokol Roche Isolation Mini Kit
dengan beberapa modifikasi. Pengecekan konsentrasi DNA dilakukan dengan
menggunakan
NanoDrop
Spechtrophotometer
(ND-2000).
Untuk
mengamplifikasi gen target Cyt-b dilakukan PCR dengan menggunakan primer
Forward L15162 5’-CTTCCATGAGGACAAATATC-3’ dan primer Reverse
Rmuc1 5’-GTGGAGTATAGGTATGATTGC-3’ (Muslih, 2011). Hasil
amplifikasi gen Cyt-b kemudian disequencing dengan mesin sekuensing DNA dan
dilakukan di Eijkman Institute for Molecular Biology, Jakarta. Optimasi
pembacaan kromatogram hasil sequencing menggunakan software Peak Trace,
kemudian sekuen yang telah diperoleh dianalisis menggunakan DNA Baser untuk
mendapatkan consensus sequence. Membandingkan hasil consensus sequence
dengan sekuen Cyt-b referensi dari National Center for Biotechnology
Information (NCBI) menggunakan program Basic Local Alignment Search Tool
(BLAST) untuk memastikan apakah sekuen yang diperoleh adalah benar gen
target. Analisis selanjutnya menggunakan Clustal X . Alignment Andin, Bobby, T.
a. auratus, T. a. auratus aaC, dan T. a. auratus aaF (analisis data) berdasarkan
nilai tertinggi hasil BLAST kedua sampel dengan spesies referensi. Rekonstruksi
pohon filogenetik dilakukan dengan software MEGA 5 menggunakan metode
Maximum Likelihood (ML), sedangkan analisis pairwise distance menggunakan
model Kimura-2 parameter (standar pairwise distance Cyt-b 2%).
HASIL DAN PEMBAHASAN
Pengecekan secara kualitatif hasil amplifikasi gen Cyt-b sampel Lutung
Jawa (T. auratus) Andin dan Bobby menggunakan primer forward dan primer
reverse diperoleh fragmen DNA dengan panjang ±500 bp. Optimasi pembacaan
hasil sequencing dilakukan dengan menggunakan software Peak Trace. Analisis
dengan DNA Baser menghasilkan sekuen konsensus sepanjang 488 bp untuk
Andin dan 503 bp untuk Bobby dari total sekuen gen Cyt-b sepanjang 1.140 bp
(Castresana, 2001).
Sekuen konsensus masing-masing sampel diidentifikasi menggunakan
software Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) untuk memastikan bahwa
sekuen yang diperoleh adalah sekuen Cyt-b yang menjadi target. Hasil analisis
menunjukkan bahwa posisi sekuen Cyt-b Andin berada pada urutan basa ke 1
hingga 450, sedangkan Bobby berada pada urutan basa ke 1 hingga 500 dari
sekuen Cyt-b spesies referensi. Nilai query Andin dan Bobby adalah 100% yang
menunjukkan bahwa sekuen yang diperoleh dari kedua sampel adalah benar
sekuen Cyt-b. Hasil alignment menggunakan software Clustal X menunjukkan
bahwa, sekuen Cyt-b dari kedua sampel memiliki kemiripan yang tinggi dengan
referensi dari NCBI, yaitu T. a. auratus, T. a. auratus haplotype aaC, dan T. a.
auratus haplotype aaF.
Berdasarkan hasil analisis pohon filogenetik diketahui bahwa Andin dan
Bobby berada satu kelompok dengan T. a. auratus dan terpisah dari T. a.
mauritius, T. germaini, T. cristatus, dan T. johnii (out-group) (Gambar 1). Andin
terletak satu clade dengan T. a. auratus haplotype aaF, sedangkan Bobby terletak
satu clade dengan T. a. auratus dan T. a. auratus haplotype aaC. Berdasarkan
analisis pairwise distance kedua sampel menunjukkan nilai yang sangat rendah,
yaitu 0,5% (< 2%) yang mengindikasikan bahwa kedua sampel termasuk dalam 1
spesies (intraspesies) (Gambar 2). Nilai pairwise distance antara Andin, Bobby,
dan kelompok T. a. auratus adalah 0% hingga 1,7% (kurang dari 2%),
mengindikasikan bahwa kedua sampel memiliki hubungan yang sangat dekat
dengan T. a. auratus (Vun et al., 2011). Apabila masing-masing individu
memiliki jarak genetik (pairwise distance) berdasarkan variasi sekuen Cyt-b
kurang dari 2%, maka mengindikasikan intraspesies. Berdasarkan analisis pohon
filogenetik dan nilai pairwise distance, dapat disimpulkan bahwa Andin dan
Bobby termasuk dalam subspesies T. a. auratus (Lutung Jawa sebaran Jawa
bagian Timur). Hal ini didukung oleh ciri-ciri morfologi kedua sampel. Andin dan
Bobby memiliki warna rambut hitam keperakan, raut wajah yang lebar, dan tidak
terlalu membentuk sudut yang jelas pada tiap lekukan wajah (Brandon-Jones,
2004).
T. cristatus cbM
35
T. cristatus cbO
T. cristatus cmS
44
T. cristatus cbK
T. cristatus cnQ
19
33
T. cristatus csH
93
T. germaini gA
T. germaini gH
23
78
T. germaini gD
95
97
T. germaini gF
T. a. auratus aaM
T. a. auratus aaQ
92
T. a. auratus aaO
T. a. auratus
66
90
T. a. auratus aaC
BOBBY
ANDIN
72
T. a. auratus aaF
T. a. mauritius amB
T. johnii
0.1
Gambar 1. Analisis Sekuen Cyt-b pada Andin, Bobby, dan Anggota
Trachypithecus Lainnya.
Gambar 2.
Pairwise Distance pada
Trachypithecus Lainnya
Andin,
Bobby,
dan
Anggota
PENUTUP
Kesimpulan
Hasil analisis genetik menggunakan fragmen Cyt-b didapatkan bahwa
Andin dan Bobby termasuk dalam subspesies T. a. auratus (Lutung Jawa sebaran
Jawa bagian Timur). Andin terletak satu clade dengan T. a. auratus haplotype
aaF, sedangkan Bobby terletak satu clade dengan T. a. auratus dan T. a. auratus
haplotype aaC.
Saran
Berdasarkan simpulan di atas, maka saran yang diajukan dirumuskan sebagai
berikut. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk verifikasi Andin dan Bobby
menggunakan sekuen gen 16S. Untuk melengkapi data molekuler Lutung Jawa (T.
auratus) di Javan Langur Center (JLC), maka perlu dilakukan identifikasi
subspesies untuk Symon (♂), Lina (♀), Wira (♂), dan Miko (♀).
DAFTAR RUJUKAN
Brandon-Jones, Douglas. 2004. A Taxonomic Revision of the Langurs and Leaf
Monkeys (Primates: Colobinae) of South Asia. Zoo’s Print Journal, 19
(8): 1552-1594.
Castresana, Jose. 2001. Cytochrome-b Phylogeny and the Taxonomy of Great
Apes and Mammals. Molecular Biology Evolution, 18 (4): 465-471.
Farias, Izeni P., Orti, Guillermo., Sampaio, Iracilda., Schneider, Horacio., &
Meyer, Axel. 2001. The Cytochrome b Gene as a Phylogenetic Marker: the
Limits of Resolution for Analyzing Relationships Among Cichlid Fishes.
Molecular Evolution, 53: 89-103.
Fuadi, Zainal. 2008. Perbandingan Aktivitas Harian Lutung Jawa
(Trachyphitecus auratus) di Pusat Penyelamatan Satwa (PPS) Petungsewu
dan Suaka Margasatwa Dataran Tinggi Hyang. Skripsi tidak diterbitkan.
Malang: Fakultas Sains dan Teknologi UIN.
Groves, C.P & Weitzel, V. 1985. The Nomenclature and Taxonomy of the
Colobine Monkeys of Java. International Journal of Primatology, 6 (4):
399-409.
Karanth, Praveen K., Singh, Lalji., Collura, Randall V., & Stewart, Caro-Beth.
2008. Molecular Phylogeny and Biogeography of Langurs and Leaf
Monkeys of South Asia (Primates: Colobinae). Molecular Phylogenetics
and Evolution, 46: 683-694.
Kurniawan, Iwan. 2012b. Profil Program Rehabilitasi Lutung Jawa
(Trachypithecus auratus). Malang: JLC Press.
Liedigk, Rasmus., Thinh, Van Ngoc., Nadler, Tilo., Walter, Lutz., & Roos,
Christian. 2009. Evolutionary History and Phylogenetic Position of the
Indochinese Grey Langur (Trachypithecus crepusculus). Vietnamese
Journal of Primatology, 3: 1-8.
Liu, Wenting., Huang, Chengming., Roos, Christian., Zhou, Qihai., Li, Youbang.,
& Wei, Fuwen. 2008. Identification of the Species, Origin, and Sex of
Smuggled Douc Langur (Pygathrix sp.) Remais.Vietnamese Journal of
Primatology, (2): 63-69.
Muslih, Miftakhul. 2011. Kekerabatan Lutung Jawa (Trachypithecus auratus)
berdasarkan Sekuen Gen Cyt-b di Javan Langur Center (JLC). Skripsi
tidak diterbitkan. Malang: FMIPA UM.
Nijman, Vincent. 2000. Geographic Distribution of Ebony Leaf Monkey
Trachypithecus auratus (E. Geoffroy Saint-Hilaire, 1812) (Mammalia:
Primates: Cercopithecidae). Contributions to Zoology, 69 (3).
Prusak, Beata., Grzybowski, Tomasz., & Bednarek, Jaroslaw. 2005. Cytochrome
b Gene (cytb) in Analysis of Anonymous Biological Traces and its
Application in Veterinary Diagnostic and Animal Conservation. Animal
Science Papers and Reports, 23 (4): 229-236.
Tsai, Li-Chin., Huang, Mei-Tzu., Hsiao, Chung-Ting., Lin, Chun-Yen Apollo.,
Chen, Szu-Jung., Lee, James Chun-I., & Hsieh, Hsing-Mei. 2007. Species
Identification of Animal Specimens by Cytochrome b Gene. Forensic
Science Journal, 6 (1): 63-6.
Vun, V.F., Mahani, M.C., Lakim, M., Ampeng, A., & Md-Zain, B.M. 2011.
Phylogenetic Relationships of Leaf Monkeys (Presbytis; Colobinae) based
on Cytochrome-b and 12S rRNA Genes. Genetic and Molecular Research,
10 (1): 368-381.