ISOLASI GEN ACYLTRANSFERASE (AT3) DARI Capsicum

1
ISOLASI GEN ACYLTRANSFERASE (AT3) DARI Capsicum frutescense cv. Cakra
Hijau
Habibi, M.1, Sulasmi, E.S.2, & Listyorini, D.2
1 Mahasiswa S1 jurusan Biologi FMIPA Universitas Negeri Malang
2
Jurusan Biologi FMIPA Universitas Negeri Malang
Jalan Semarang 5 Malang 65145, Indonesia
Koresponden : [email protected] [email protected]
Abstrak
Cabai merupakan salah satu tanaman yang telah banyak dimanfaatkan dan
dibudidayakan masyarakat Indonesia. Terdapat tiga spesies cabai yang ditemukan di
Indonesia, yaitu Capsicum annuum L., Capsicum frutescens L., dan Capsicum violaceum
H.B.K. Capsicum frutescens merupakan tanaman yang mempunyai nilai ekonomi yang
tinggi disebabkan karena rasa pedas dan kandungan karotenoidnya. Capsicum frutescens
mempunyai beberapa kultivar, salah satunya adalah Capsicum frutescens cv. Cakra Hijau.
Kultivar ini tahan terhadap hama dan penyakit serta mempunyai rasa yang pedas. Rasa
pedas pada tanaman cabai dikarenakan adanya senyawa kapsaisin. Selain memberikan rasa
pedas, kapsaisin juga berfungsi untuk pertahanan tanaman cabai, antiartritis, analgesik, dan
antikanker. Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi gen Acyltransferase (AT3) sebagai
gen pengkode enzim CS (Capsaicin synthase). Gen AT3 diisolasi menggunakan metode
PCR dengan primer forward 5’-ATG GCT TTT GCA TTA CCA TCA-3’ dan reverse 5’CCT TCA CAA TTA TTC GCC CA-3’. Data dianalisis dengan menggunakan DNA baser,
BLAST, dan ClustalW. Dari penelitian ini diperoleh sekuen parsial sepanjang 404 basa dari
gen AT3. Hasil alignment dengan gen AT3 dari Capsicum frutescens cv. Shuanla dan
Capsicum frutescens cv. BG2814.6 menunjukkan bahwa gen AT3 yang teramplifikasi
adalah pada bagian tengah. Sebanyak 1917 basa dari bagian upstream dan 1435
downstream masih belum teramplifikasi, sehingga diperlukan design primer untuk
mendapatkan gen AT3 secara utuh.
Kata Kunci : Capsicum frutescens cv. Cakra Hijau, Kapsaisin, gen AT3
Pendahuluan
Cabai merupakan salah satu tanaman yang telah banyak dimanfaatkan dan
dibudidayakan masyarakat Indonesia. Terdapat tiga spesies cabai yang ditemukan di
Indonesia, yaitu Capsicum annuum L., Capsicum frutescens L., dan Capsicum violaceum
H.B.K.(Backer et al., 1965) Capsicum annuum L. dan Capsicum frutescens L. merupakan
spesies cabai yang paling banyak dibudidayakan di Indonesia (Djarwaningsih, 2005).
Cabai rawit (Capsicum frutescens) merupakan tanaman yang mempunyai nilai ekonomi
yang tinggi disebabkan karena rasa pedas dan kandungan karotenoidnya (Sukrasno et al.,
1997). Capsicum frutescens mempunyai beberapa kultivar, seperti Sky line, White chilli,
Bara, Cakra putih, dan Cakra hijau. Cakra hijau merupakan kultivar unggul. Kultivar ini
tahan terhadap hama dan penyakit, mempunyai rasa yang pedas, dapat dipanen pada umur
±80 hari, dan berpotensi menghasilkan 12.000 kg/ha buah cabai (Rukmana, 1996:18).
1
2
Rasa pedas pada tanaman cabai dikarenakan adanya senyawa kapsaisin. Kapsaisin
hanya ditemukan pada genus Capsicum. Kapsaisin juga berfungsi dalam bidang
pengobatan dan farmasi sebagai antiartritis dan analgesik (Mori et al., 2006), selain itu
Kapsaisin juga berfungsi sebagai pengatur distribusi lemak dalam tubuh (Leung, 2008),
antibakteri (Xu et al., 2005), dan anti-kanker (Lee et al., 2000).
Biosintesis kapsaisin melibatkan beberapa enzim. Capsaicin Synthase (CS)
merupakan enzim tahap akhir yang mempunyai peranan penting dalam biosintesis
kapsaisin dengan mengkondensasi vanillylamin dengan acyl moieties dan selanjutnya akan
membentuk kapsaisin (Lang et al., 2006). Enzim CS juga berfungsi sebagai regulator
pembentukan kapsaisin (Prasad et al., 2006). Stewart et al. (2005) mengusulkan gen AT3
sebagai gen yang mengkode CS. Pernyataan ini didukung oleh Lee et al. (2005) dengan
beberapa alasan, yaitu gen AT3 terekspresi di plasenta dan gen ini tersegregasi pada lokus
C, sementara itu Kim et al. (2009) melaporkan bahwa gen AT3 terlokalisasi dengan lokus
Pun1 dan delesi 2,3 kb dari gen AT3 menyebabkan cabai tidak pedas.
Isolasi gen AT3 telah dilakukan pada kultivar Capsicum annuum (Stewart et al.,
2007) dan beberapa Capsicum frutescens (Lee et al., 2004). Sejauh ini belum ada laporan
mengenai gen AT3 C. frutescens dari Indonesia, data gen ini juga belum terekam di Gene
Bank. Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi gen AT3 dari Capsicum frutescens cv.
Cakra Hijau.
Bahan dan Metode
Tanaman Capsicum frutescens cv. Cakra Hijau diperoleh dari BPTP (Balai
Pengkajian Teknologi Pertanian) Karangploso, Malang. Isolasi DNA total dari daun
dilakukan dengan menggunakan kit isolasi DNA tumbuhan (Nucleospin® II, MachereyNagel, germany). Primer yang digunakan adalah primer forward 5’-ATG GCT TTT GCA
TTA CCA TCA-3’ dan reverse 5’ –CCT TCA CAA TTA TTC GCC CA-3’. PCR dilakukan
dengan pre-denaturasi pada 94oC selama 5 menit, denaturasi 94oC selama1 menit, annealing 53oC
selama 1 menit, polimerisasi 72oC selama 2 menit, dan polimerisasi akhir 72oC selama 10 menit;
dalam 30 siklus.
Produk PCR dielektroforesis dengan menggunakan gel agarose 1% untuk mengetahui
hasilnya. Sekuensing dilakukan di Lembaga Biologi Molekuler Eijkman Jakarta dengan Big Dye
Transluminator melalui mesin ABI 3130 Genetic analyzer. Hasil sekuensing dianalisis dengan
menggunakan software Bioedit, Peaktrace, DNA Baser, BLAST, dan ClustalX.
Hasil dan Pembahasan
Isolasi gen AT3 dari Capsicum frutescens cv. Cakra Hijau menggunakan teknik
PCR dengan sepasang primer menghasilkan sekuen sepanjang 404 basa. Gen target yang
teramplifikasi adalah pada bagian “tengah” gen AT3 merujuk C. frutescens (Kode akses:
HM854860.1 dan AY819026.1). Sekuen DNA dari gen AT3 Capsicum frutescens cv.
Cakra Hijau yang diperoleh disajikan pada gambar 1.
3
10
20
30
40
50
60
70
5’....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
TACCATCATC ACTTGTTTCA GTTTGTNACA AATCTTTTAT CAAACCTTCC TCTCTCACCC CCTCTACACT
80
90
100
110
120
130
140
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
TAGATTTCAC AAGCTATCTT TCATCGATCA ATCTTTAAGT AATATGTATA TCCCTTGTGC ATTTTTTTAC
150
160
170
180
190
200
210
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
CCTAAAGTAC AACAAAGACT AGAAGACTCC AAAAATTCTG ATGAGCTTTC CCATATAGCC CACTTGCTAC
220
230
240
250
260
270
280
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
AAACATCTCT ATCACAAACT CTAGTCTCTT ACTATCCTTA TGCTGGAAAG TTGAAGGACA ATGCTACTGT
290
300
310
320
330
340
350
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
TGACTGTAAC GATATGGGAG CTGAGTTCTT GAGTGTTCGA ATAAAATGTT CCATGTCTGA AATTCTTGAT
360
370
380
390
400
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....3’
CATCCTCATG CATCTCTTGC AGAGAGCATA GTTTTGCCCA AGGATTTGCC TTGG
Gambar 1. Partial sequence Gen AT3 Capsicum frutescens cv. Cakra Hijau yang berhasil diisolasi
Analisis sekuen dengan menggunakan program BLAST dibandingkan dengan gen
AT3 dari Capsicum frutescens cv. Shuanla (Gambar 2A) dan Capsicum frutescens cv.
BG2814.6 (Gambar 2B) menunjukkan query coverage 24% dan 10% berturut-turut dengan
indeks similaritas masing-masing 99%. Berdasarkan hal tersebut maka sekuen yang
diperoleh adalah benar gen AT3.
A)
B)
Gambar 2 Hasil BLAST gen target dengan a) gen AT3 C. frutescens cv. Shuanla, b) gen AT3
C. frutescens cv. BG2814.6
4
Sekuen DNA dari gen AT3 Capsicum frutescens cv. Cakra Hijau dianalisis dengan
menggunakan program ClustalX untuk membuat alignment asam aminonya dengan asam
amino gen AT3 Capsicum frutescens cv. Shuanla dan Capsicum frutescens cv. BG2814.6.
Hasil alignment asam amino dari ketiga spesies tersebut menunjukkan bahwa gen AT3
Capsicum frutescens cv. Cakra Hijau berada pada 43 sampai 139 dari sekuen asam amino
gen AT3 Capsicum frutescens cv. Shuanla dan Capsicum frutescens cv. BG2814.6.
(Gambar 3).
C. frutescens cv. Cakra Hijau
C. frutescens cv. Shuanla
C. frutescens BG2814.6
Clustal Consensus
C. frutescens cv. Cakra Hijau
C. frutescens cv. Shuanla
C. frutescens BG2814.6
Clustal Consensus
C. frutescens cv. Cakra Hijau
C. frutescens cv. Shuanla
C. frutescens BG2814.6
Clustal Consensus
C. frutescens cv. Cakra Hijau
C. frutescens cv. Shuanla
C. frutescens BG2814.6
Clustal Consensus
C. frutescens cv. Cakra Hijau
C. frutescens cv. Shuanla
C. frutescens BG2814.6
Clustal Consensus
C. frutescens cv. Cakra Hijau
C. frutescens cv. Shuanla
C. frutescens BG2814.6
Clustal Consensus
C. frutescens cv. Cakra Hijau
C. frutescens cv. Shuanla
C. frutescens BG2814.6
Clustal Consensus
10
20
30
40
....|....|....|....|....|....|....|....|
---------------------------------------MAFALPSSLVSVCDKSFIKPSSLTPSKLRFHKLSFIDQSL
MAFALPSSLVSICDKSFIKPSSLTPSTLRFHKLSFIDQSL
50
60
70
80
....|....|....|....|....|....|....|....|
--MYIPCAFFYPKVQQRLEDSKNSDELSHIAHLLQTSLSQ
SNMYIPCAFFYPKVQQRLEDSKNSDELSHIAHLLQTSLSQ
SNMYIPCAFFYPKVQQRLEDSKNSDELSHIAHLLQTSLSQ
**************************************
90
100
110
120
....|....|....|....|....|....|....|....|
TLVSYYPYAGKLKDNATVDCNDMGAEFLSVRIKCSMSEIL
TLVSYYPYAGKLKDNATVDCNDMGAEFLSVRIKCSMSEIL
TLVSYYPYAGKLKDNATVDCNDMGAEFLSVRIKCSMSEIL
****************************************
130
140
150
160
....|....|....|....|....|....|....|....|
DHPHASLAESIVLPKDLPW--------------------DHPHASLAESIVLPKDLPWANNCEGGNLLVVQVSKFDCGG
DHPHASLAESIVLPKDLPWANNCEGGNLLVVQVSKFDCGG
*******************
170
180
190
200
....|....|....|....|....|....|....|....|
---------------------------------------IAISVCFSHKIGDGCSLLNFLNDWSSVTRDHTTTALVPSP
IAISVCFSHKIGDGCSLLNFLNDWSSVTRDHTTTTLVPSP
210
220
230
240
....|....|....|....|....|....|....|....|
---------------------------------------RFVGDSVFSTKKYGSLITPQILSDLNECVQKRLIFPTDKL
RFVGDSVFSTKKYGSLITPQILSDLNECVQKRLIFPTDKL
250
260
270
....|....|....|....|....|....|....|
----------------------------------DALRAKVILPSSIIVCLTVFLKRIIFNSLLETYFT
DALRAKVILPSSIIVCLTVFLKRLIFNSLLET---
Gambar 4.4 Hasil alignment asam amino gen AT3 C. frutescens cv. Cakra Hijau dengan gen AT3
dari C. frutescens cv. Shuanla dan C. annuum cv. Hot.
Kesimpulan
Gen AT3 (Acyltransferase) dari Capsicum frutescens cv. Cakra hijau sepanjang
404 basa yang mengkode 97 asam amino berhasil diisolasi dengan metode PCR
menggunakan sepasang primer. Sekuen yang diperoleh adalah bagian tengah gen AT3.
Masih perlu dilakukan isolasi bagian up-stream dan down-stream gen ini untuk
memperoleh sekuen utuhnya..
5
Kepustakaan
Backer, C. A. & Bakhuizen Van Den Brink Jr. 1965. Flora of Java Vol II. Netherland :
N.V.P Noordhoff
Djarwaningsih, Tutie. 2005. Capsicum spp. (Cabai): Asal, persebaran dan Nilai Ekonomi.
Biodiversitas 6 : 292-196
Lang, Y.Q., Kisaka, H., Sugiyama, R., Nomura, K., Morita, A., Watanabe, T., Tanaka, Y.,
Yazawa, S., Miwa, T. 2009. Functional loss of pAMT results in biosynthesis
capsinoids, capsaicioids analog, in Capsicum annuum cv. CH-19 sweet. Plant Journal
59 : 953-961
Lee YS., Nam DH., and Kim JA. 2000. Induction of apoptosis by capsaicin in A172
human glublastoma cells. Cancer Lett. 161 : 121-130
Lee CJ, Yoo EY, Shin J, Lee J, Hwang HS, Kim BD. 2005. Non-pungent Capsicum
contain a deletion in the capsaicinoid synthetase gene, wich allow early detection of
pungency with SCAR markers. Mol. Cells 19:262-267
Mori, A., Lehmann, S., O’kelly, J., Kumagai, T., Desmond, J.C., Pervan, M., McBride,
W.H., Kizaki, M. & Koefler, H.P. 2006. Capsaicin, a component of red peppers,
inhibits the growth of Androgen-independent, p53 mutant prostate cancer cells.
Cancer Res. 66(6): 3222-3229
Prasad Narasimha B. C. 2006. Characterization of Capsaicin Synthase And Identification of its
Gene (csy1) For Pungency Factor Capsaicin In Pepper. 2006. India. Central food and
Technological Research Institute.
Rukmana, Rahmat. 2002. Usaha Tani Cabai Rawit. Kanisius: Yogyakarta.
Stewart, C., Kang, B. C., Liu, K., Mazourek, M., Moore, S. L., Yoo, E. Y., Kim, B. D., Paran, I.,
Jahn, M. M. 2005. The Pun1 Gene for Pungency in Pepper Encodes a Putative
Acyltransferase. The Plant Journal 42, 675-688
Stewart, Charles. Mazourek, M. Stellari, M. O’Connel, Mary. Jahn, Molly. 2007. Genetic Control
of Pungency in Capsicum chinense via the Pun1 Locus. Journal of Experimental Botany 58,
979-991.
Sukrasno, Kusmadiyarni. S., Tarini. S., Sugiarso N.C., Kandungan Kapsaisin dan
Dihidrokapsaisin pada berbagai Buah Capsicum. JMS 2 : 28-34
Xu, H.K., Kim, Y.C., Lee, J.W., Kim, I.S., Yoo, K.C., and Higashio, H. 2002. Change of Some
Constituents along with the fruit maturity in Capsicum species. Journal Kor. Soc. Hort. Sci.
43, 39-42.